李憶，尹全

（1.四川民族學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系，四川康定626001；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066）

耐除草劑甜菜H7-1多重PCR檢測方法的建立

李憶1，尹全2

（1.四川民族學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系，四川康定626001；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066）

依據(jù)耐除草劑甜菜H7-1分子特征，同時選擇甜菜內(nèi)源參照基因（GluA）、外源基因P-FMV 35S，CP4-EPSPS和T-E9 3'等4個基因作為多重PCR檢測參數(shù)，基因特異性引物序列參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化以及方法特異性和靈敏度測試，建立了多重PCR檢測體系。利用已知樣品對該體系驗(yàn)證，耐除草劑甜菜H7-1能被同時檢出GluA，P-FMV 35S，CP4-EPSPS和T-E9 3'等4個基因，而其他樣品均不能被同時檢出這4個基因，結(jié)果表明，此體系可運(yùn)用于耐除草劑甜菜H7-1檢測。

甜菜；H7-1；多重PCR；檢測

甜菜（Beta vulgaris L.）為藜科甜菜屬2年生異花授粉作物，是我國主要的糖料、能源和優(yōu)良的飼料作物[1]。甜菜是加工白糖的主要原料，占白糖加工原料的1/3；其副產(chǎn)品有糖蜜和甜菜粕，均可用于食品和飼料。甜菜粕是食用纖維的主要原料之一，被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)。甜菜粕也被廣泛用作豬、牛飼料，尤其是奶牛的首選優(yōu)質(zhì)飼料[2]。

目前，商業(yè)化轉(zhuǎn)基因甜菜已有3個品系，分別為抗草甘膦甜菜H7-1、抗草胺膦甜菜T120-7、抗草甘膦甜菜GTS B 77，被大面積種植的是抗草甘膦甜菜H7-1。1998年，轉(zhuǎn)基因甜菜首次被批準(zhǔn)商業(yè)化種植。至今，轉(zhuǎn)基因甜菜已經(jīng)在美國、加拿大等國被批準(zhǔn)種植，在美國、澳大利亞、日本、墨西哥等國被批準(zhǔn)食用[3]，我國也在2009年批準(zhǔn)耐除草劑甜菜H7-1進(jìn)口，用作加工原料[4]。

隨著農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因生物的安全性問題爭議也越來較大，許多國家出臺了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽制度及相關(guān)法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識[5]。2006年，日本發(fā)布《關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的修正草案》，要求對糖用甜菜及以糖用甜菜作為主要配料的加工食品強(qiáng)制性標(biāo)識轉(zhuǎn)基因成分。現(xiàn)在出口到歐盟、日本等國的白糖、甜菜粕等甜菜加工產(chǎn)品，要求出口商出具非轉(zhuǎn)基因檢測證書。然而，要科學(xué)地執(zhí)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度，就必須依托方便快速、可靠的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)。

靈敏、快速、簡便是PCR技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物和產(chǎn)品檢測的主要優(yōu)勢，可以用于檢測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中的標(biāo)記基因和目的基因[6-7]。但對產(chǎn)品的檢測經(jīng)常需對多個轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測來確認(rèn)其是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及含哪些轉(zhuǎn)基因成分，然而用普通PCR分別檢測各成分存在操作繁瑣、時間和試劑耗費(fèi)大等缺點(diǎn)。因此，多重PCR（Multiplex polymerase chain reaction，MPCR）技術(shù)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中得到了應(yīng)用。MPCR是指在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，向1個反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對1個或多個DNA模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù)[8]。近年來，MPCR技術(shù)得到了較大的發(fā)展，陳貞等[9]用7重PCR對轉(zhuǎn)基因菜籽粕中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了檢測；Germini等[10]建立了一個能同時區(qū)分4種轉(zhuǎn)基因玉米和1種轉(zhuǎn)基因大豆的MPCR體系。因此，MPCR在原材料及深加工產(chǎn)品檢測中有重要的應(yīng)用價值。

雖然國內(nèi)外已有耐除草劑甜菜H7-1轉(zhuǎn)化體特異檢測方法，但并沒有對甜菜H7-1轉(zhuǎn)化體中多個基因進(jìn)行多重PCR的檢測方法。為了提高耐除草劑甜菜H7-1轉(zhuǎn)化體特異檢測效率，本研究根據(jù)耐除草劑甜菜H7-1插入的基因元件，預(yù)期建立一種包括甜菜內(nèi)源參照基因（GluA）、玄參花葉病毒啟動子（P-FMV 35S）、豌豆的核酮糖-1，5二磷酸羧化酶E9基因小亞基3′端序列終止子（T-E9 3′）、目的基因（CP4-EPSPS）的4重PCR，為耐除草劑甜菜H7-1的檢測提供另外一種方法，在同一個反應(yīng)體系內(nèi)同時擴(kuò)增出4條目的條帶，根據(jù)目的條帶可識別耐除草劑甜菜H7-1。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、轉(zhuǎn)基因玉米MON810和NK603來源于IRRM（Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre（JRC））；轉(zhuǎn)基因油菜GT73來源于FLUKA；轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2和轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑植物基因組提取試劑盒、Master Mix、標(biāo)準(zhǔn)分子量（M）購于天根生化科技（北京）有限公司；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 引物序列

根據(jù)耐除草劑甜菜H7-1的分子特征選擇甜菜內(nèi)源基因（GluA），外源基因玄參花葉病毒啟動子（P-FMV 35S）和豌豆的核酮糖-1，5二磷酸羧化酶E9基因小亞基3′端序列終止子（T-E9 3′）以及目的基因（CP4-EPSPS）等4個基因作為MPCR檢測基因，特異性引物序列引用國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。將各檢測基因上下游引物濃度稀釋為10 μmol/L。

表1 引物序列、擴(kuò)增片段長度及檢測依據(jù)

1.3 樣品DNA提取

樣品DNA提取按照植物基因組DNA提取試劑盒方法進(jìn)行，測定提取DNA濃度和判斷質(zhì)量。

1.4 多重PCR方法的建立

1.4.1 單基因特異性反應(yīng)體系：東洋紡2×Master Mix12.5 μL，上下游引物F和R各1 μL，樣品DNA模板2 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃3 min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4.2 多重PCR方法條件優(yōu)化利用以下體系和程序?qū)Χ嘀豍CR退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系：東洋紡2×Master Mix 12.5 μL，4對引物中，上下游引物F和R各0.25μL，樣品DNA模板2μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，退火溫度設(shè)置梯度50，54，56，58，60，64℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，選擇最適合的退火溫度。

利用以下體系和程序?qū)Χ嘀豍CR引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系：東洋紡2×Master Mix 12.5 μL，4對引物終濃度按照表2設(shè)置引物濃度梯度，模板DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序選擇退火溫度優(yōu)化后確定的程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用Qiagen毛細(xì)管電泳儀對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果分析，選擇最適合的引物濃度配比。

表1 引物終濃度配比

1.5 多重PCR方法靈敏度

以去離子水對轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，使得每個反應(yīng)體系中基因組DNA分別為10，3，1，0.5，0.1 ng。

1.6 已知樣品驗(yàn)證

利用本研究建立的多重PCR檢測體系，對已知樣品進(jìn)行實(shí)例驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取

樣品總DNA提取純化采用植物基因組提取試劑盒，通過Nano Drop 1000（Thermo scientific）超微量分光光度計(jì)測定濃度和質(zhì)量，經(jīng)測定，所有樣品濃度都大于25 ng/μL，且OD260/OD280范圍在1.8～2.0，OD260/OD230大于2.0，說明提取的樣品DNA可滿足本研究MPCR的需要。將樣品DNA濃度稀釋至25 ng/μL待測。

2.2 多重PCR單基因特異性驗(yàn)證

本研究選擇的單基因PCR檢測方法都可以將目的基因片段成功擴(kuò)增，而其他不含此基因的樣品中沒有相應(yīng)擴(kuò)增（圖1），結(jié)果說明，4個基因目的條帶都是特異的，沒有非特異性條帶出現(xiàn)。所以，本研究選擇的4個基因可用于多重PCR檢測體系。

2.3 多重PCR條件的優(yōu)化

退火溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，退火溫度太低容易產(chǎn)生非特異性條帶，而退火溫度太高又不能將需要的目的條帶理想擴(kuò)增；如在64℃條件下，T-E9 3′基因的目的條帶未得到有效擴(kuò)增，內(nèi)源基因（GluA）的擴(kuò)增量也非常小，所以，退火溫度64℃不適合（圖2）。在其他溫度條件下，雖然所有目的條帶都得到擴(kuò)增，但目的條帶之間的擴(kuò)增量有所不同，當(dāng)退火溫度為56℃時各目的條帶的擴(kuò)增量相對一致，因此，最終選擇多重PCR反應(yīng)的退火溫度為56℃。

引物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明，各引物終濃度按照方案B配比時，各目的基因的擴(kuò)增效率一致；而其他幾種引物濃度方案結(jié)果均不理想，目的基因存在無擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不一致等（圖3）。所以，最終確定最優(yōu)化的引物終濃度（μmol/L）配比為0.2∶0.2∶0.2∶0.2。

2.4 多重PCR靈敏度

多重PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，在模板濃度不低于0.5 ng時，4個目標(biāo)片段均可得到有效擴(kuò)增；當(dāng)模板濃度低至0.5 ng時，除內(nèi)源參照基因（GluA）得到擴(kuò)增外，其他目的條帶均未得到有效擴(kuò)增；在模板濃度低于0.5 ng時，4個外源基因幾乎沒有擴(kuò)增（圖4）。說明本研究所建立的多重PCR檢測體系靈敏度可達(dá)0.5 ng。

2.5 已知樣品驗(yàn)證

采用已建立的多重PCR體系檢測已知樣品結(jié)果表明，所有樣品擴(kuò)增的目的條帶與其分子特征顯示的基因元件是一致的（圖5）。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究建立的多重PCR檢測方法的可靠性。

3 討論

為了提高檢測效率，本研究首次將分辨率更高、電泳條帶更清晰的毛細(xì)管電泳引入到多重PCR檢測體系中，也是本研究的最大特點(diǎn)。目前，毛細(xì)管電泳技術(shù)已被應(yīng)用于無機(jī)及有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、肽的分離分析，核酸的分離分析等方面[14-15]。雖然目的基因間堿基差異大，也可以采用普通瓊脂糖凝膠電泳方法進(jìn)行分析判斷，但毛細(xì)管電泳能將擴(kuò)增目的條帶分離得更明顯，結(jié)果更加清晰；如果需要檢測的目的基因間的堿基差異大小不能采用普通瓊脂糖凝膠電泳方式進(jìn)行準(zhǔn)確分析，特別是在只有幾個堿基差異時，毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢則更明顯。本研究的多重PCR反應(yīng)體系選擇的基因擴(kuò)增條帶大小雖然差異較大，但采用毛細(xì)管電泳更能清晰地將二者區(qū)分開，并進(jìn)行正確判斷。

多重PCR最早由Chamberlain等[8]于1988年提出，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及生物等領(lǐng)域，包括基因敲除分析、突變、多態(tài)性分析、定量分析、RNA檢測及微生物耐藥檢測等[16-18]。在實(shí)際應(yīng)用中，由于不同引物序列存在很多因素（如引物濃度、退火溫度等）影響多重PCR結(jié)果，所以，在關(guān)鍵影響因素引物濃度選擇過程中，本研究采用不同引物濃度梯度對多重PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，在充分考慮PCR反應(yīng)過程中易產(chǎn)生引物二聚體、非特異性條帶等特殊情況，選擇目的條帶特異、引物二聚體少以及各基因引物擴(kuò)增效率相對一致的引物濃度配比，最終建立了多重PCR檢測體系。

退火溫度是多重PCR反應(yīng)中一個關(guān)鍵因素。通常情況下可以依據(jù)引物的解鏈溫度直接選擇退火溫度，但有的時候其結(jié)果與預(yù)期并不一致。在多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化過程中，最簡單的方法就是設(shè)置54℃為初始退火溫度，如果多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶，需適當(dāng)提高引物退火溫度，反之則降低引物退火溫度[19]。本研究從6個退火溫度中，根據(jù)5個目的基因的特異性條帶擴(kuò)增效率、非特異性條帶以及引物二聚體的產(chǎn)生等因素確定了56℃作為耐除草劑甜菜H7-1轉(zhuǎn)化體特異檢測方法的多重PCR檢測體系退火溫度。以后根據(jù)實(shí)際檢測需求，進(jìn)一步對引物設(shè)計(jì)和多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

本研究建立的耐除草劑甜菜H7-1轉(zhuǎn)化體特異檢測方法多重PCR反應(yīng)體系，可實(shí)現(xiàn)在1個反應(yīng)體系中同時檢測耐除草劑甜菜H7-1內(nèi)源參照基因和多個外源基因成分，有效簡化了操作程序、縮短了檢測時間、提高了檢測效率，有效降低了出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象的概率，為轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1提供另外一種有效的檢測手段。

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Establishment of Multiplex PCR Detection Method for Herbicide-tolerant Sugar Beet H7-1

LI Yi1，YIN Quan2
（1.Department of Environment and Life Sciences，Sichuan University for Nationalities，Kangding626001，China；2.Center of Analysis and Testing，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China）

To establish a kind of herbicide-tolerant sugar beet H7-1 multiplex PCR detection method,according to the molecular characteristics of herbicide-tolerant sugar beet H7-1,the sugar beet endogenous reference gene GluA,exogenous gene P-FMV 35S, CP4-EPSPS and T-E9 3'were selected as detection genes for multiplex PCR,which the sequences of specific primers referred to China national standards,and the reaction conditions were optimized and tested for its specificity and sensitivity.The multiplex PCR detection system was established including an endogenous gene and four exogenous genes.This system was validated by the known sample,and herbicide-tolerant sugar beet H7-1 could be checked out GluA,P-FMV 35S,CP4-EPSPS,T-E9 3',four genes at the same time,while other samples couldn't be checked out the four genes at the same time.The result indicates that this system can be applied to the detection of herbicide-tolerant sugar beet H7-1.

sugar beet;H7-1;multiplex PCR;detection

S566.3

A

1002-2481（2016）01-0014-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.05

2015-09-14

四川省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng)目（15ZB0331）；四川省財(cái)政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014CXSF-040）

李憶（1982-），女，四川瀘定人，講師，碩士，主要從事生物教學(xué)及研究工作。尹全為通信作者。