■曲恒漫 文 媛 王佳榮 周巖民 溫 超

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

甜菜堿是一種季銨型水溶性生物堿，化學(xué)名稱為三甲基甘氨酸。甜菜堿廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物機(jī)體中，主要生理功能是提供活性甲基，為肉堿、肌酸、嘌呤及蛋氨酸等多種物質(zhì)的合成提供原料，參與氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝[1]。在飼料中添加甜菜堿具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)滲透壓、改善胴體組成、提高肉質(zhì)等作用，對(duì)水生動(dòng)物具有誘食作用[2-5]。近年來的研究表明，甜菜堿對(duì)幾種人類臨床常見致病菌具有一定的抑菌作用[6-7]，但對(duì)動(dòng)物體內(nèi)常見致病菌是否有抑菌效果尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以飼料中常用的無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽為試驗(yàn)材料，以對(duì)仔豬危害較大的大腸桿菌K88為研究對(duì)象，分析兩種甜菜堿產(chǎn)品的體外抑菌活性，旨在為甜菜堿在飼料中的應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽由宜興市天石飼料有限公司提供，純度分別為96%、97%。大腸桿菌K88購(gòu)于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 菌種的活化

將-20℃保存的大腸桿菌K88解凍后接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，再次接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，備用[7]。

1.3 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

吸取1 ml培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的大腸桿菌K88菌液加入10 ml含無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽濃度均分別為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg/ml的LB培養(yǎng)基中，同時(shí)設(shè)置只加菌液和只加無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽的對(duì)照管，37℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。取未見細(xì)菌生長(zhǎng)的上清液100 μl涂布到瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計(jì)數(shù)，觀察瓊脂平板菌落生長(zhǎng)狀況，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整甜菜堿濃度，菌落個(gè)數(shù)少于5個(gè)的平板所對(duì)應(yīng)的最小甜菜堿濃度為MIC，無細(xì)菌生長(zhǎng)的平板所對(duì)應(yīng)的最小甜菜堿濃度為最小殺菌濃度（MBC）。試驗(yàn)重復(fù)3次[1]。

1.4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入一定質(zhì)量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成MIC或MBC的溶液，加入100 μl培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置一個(gè)細(xì)菌的純培養(yǎng)作為空白對(duì)照。分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、4、8、16、24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率，繪制曲線圖。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 不同濃度的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽對(duì)大腸桿菌K88抑菌效果的影響

在10 ml高壓滅菌生理鹽水中加入不同質(zhì)量的無水甜菜堿或甜菜堿鹽酸鹽配制成 4、5、6、7、8、9、15 mg/ml的溶液，移取100 μl培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌液加入其中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置一個(gè)細(xì)菌的純培養(yǎng)作為空白對(duì)照。培養(yǎng)24 h后取出，菌液梯度稀釋后，取適宜稀釋度的菌液涂布于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18 h后計(jì)數(shù)，計(jì)算抑菌率，繪制曲線圖。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度（見表1）

表1 不同濃度無水甜菜堿及甜菜堿鹽酸鹽對(duì)大腸桿菌K88的抑菌效果

如表1所示，當(dāng)無水甜菜堿濃度提高到800 mg/ml時(shí)仍可見大量細(xì)菌生長(zhǎng)，說明無水甜菜堿對(duì)大腸桿菌K88的抑菌效果不明顯。甜菜堿鹽酸鹽的最小抑菌濃 度 (MIC)為 6.25 mg/ml，最 小 殺 菌 濃 度(MBC)為8.125 mg/ml。

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)甜菜堿鹽酸鹽抑菌效果的影響（見圖1）

如圖1所示，在甜菜堿鹽酸鹽濃度為6.25 mg/ml時(shí)，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌率逐漸增加，當(dāng)抑菌時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)，抑菌率超過50%，可見該濃度甜菜堿鹽酸鹽在16 h以后才會(huì)達(dá)到明顯的抑菌效果；在甜菜堿鹽酸鹽濃度為8.125 mg/ml時(shí)，抑菌率隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速提高，24 h后抑菌率達(dá)到90%，可見甜菜堿鹽酸鹽濃度達(dá)到8.125 mg/ml時(shí)具有抑菌和殺菌作用。

圖1 甜菜堿鹽酸鹽在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大腸桿菌K88的抑菌率

2.3 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對(duì)大腸桿菌K88抑菌效果的影響（見圖2）

由圖2可以看出，隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度增大，抑菌率逐漸增加，當(dāng)濃度達(dá)到7 mg/ml時(shí)，抑菌率超過50%，達(dá)到抑菌效果，當(dāng)濃度達(dá)到9 mg/ml時(shí)，抑菌率超過90%，達(dá)到殺菌效果。

圖2 不同濃度甜菜堿鹽酸鹽對(duì)大腸桿菌K88的抑菌率

3 討論

近年來，部分文獻(xiàn)報(bào)道了甜菜堿的體外抑菌作用，如張愛君等[6]發(fā)現(xiàn)甜菜堿對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有明顯的抑制作用。黃忠民等[8]亦發(fā)現(xiàn)甜菜堿對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的抑制作用，并推測(cè)可能的抑菌機(jī)制是：甜菜堿作為一種帶正電荷的季銨鹽類化合物，容易吸附于帶負(fù)電荷的金黃色葡萄球菌表面并穿透其細(xì)胞壁，作用于細(xì)胞膜和酶體系，抑制其呼吸作用，進(jìn)一步使細(xì)菌外膜裂解，新陳代謝被抑制而死亡。但上述文獻(xiàn)中均未說明所用甜菜堿劑型。為此，本試驗(yàn)比較了無水甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的體外抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無水甜菜堿對(duì)大腸桿菌K88抑菌效果并不明顯，抑菌效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于甜菜堿鹽酸鹽，其原因可能為：無水甜菜堿呈中性，而甜菜堿鹽酸鹽呈強(qiáng)酸性，添加甜菜堿鹽酸鹽后使培養(yǎng)基pH值降低，從而使大腸桿菌K88細(xì)胞內(nèi)外的的蛋白質(zhì)變性，細(xì)胞膜和酶失去生物活性，生命活動(dòng)無法進(jìn)行而導(dǎo)致死亡。甜菜堿鹽酸鹽大腸桿菌K88的MIC為6.25 mg/ml，與張愛君等[6]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，抑菌率隨之提高，說明其抑菌效果呈劑量和時(shí)間依賴性。

4 結(jié)論

無水甜菜堿對(duì)大腸桿菌K88抑菌效果不明顯，而甜菜堿鹽酸鹽有一定抑菌作用，最小抑菌濃度為6.25 mg/ml，最小殺菌濃度為8.125 mg/ml。隨著甜菜堿鹽酸鹽濃度提高或培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，抑菌率提高。