庫爾班江·巴拉提

(新疆伊犁師范學院 化學與環(huán)境科學學院,新疆 伊寧 835000)

葡萄葉乙醇提取物的提取工藝及體外抑菌活性研究*

庫爾班江·巴拉提

(新疆伊犁師范學院 化學與環(huán)境科學學院,新疆 伊寧 835000)

為優(yōu)選出葡萄葉乙醇提取物的最佳提取工藝條件，以采自吐魯番市恰特喀勒鄉(xiāng)的葡萄葉為材料，采用索氏提取器回流提取法提取葡萄葉乙醇提取物；工藝優(yōu)化以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比為影響因素，分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌做抑菌試驗，并以其中抑菌效果最明顯的金黃色葡萄球菌為指示菌，以葡萄葉乙醇提取物的抑菌圈直徑為指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用了正交試驗，并用K-B瓊脂擴散法測定其體外抑菌活性。結(jié)果表明，各因素對提取葡萄葉抑菌活性物質(zhì)的影響順序為，乙醇濃度>浸提溫度>料液比>浸提時間。最佳提取工藝為，乙醇濃度70%、浸提溫度70℃、料液比1︰30、浸提時間3h。在最佳提取條件下獲得的葡萄葉提取物對4種菌的抑菌作用大小為：金黃色葡萄球菌﹥大腸桿菌﹥白假絲酵母菌﹥枯草芽孢桿菌。葡萄葉中乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較顯著的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌抑菌活性最大，而對枯草芽孢桿菌的抑菌作用不太顯著。本文所建立的葡萄葉乙醇提取物的最佳提取工藝具有漸變快速、儀器設(shè)備簡單、不污染環(huán)境等優(yōu)點，可用于葡萄葉中具有抗菌活性物質(zhì)的提取。

葡萄葉；乙醇提取物；索氏提取器回流提取法;金黃色葡萄球菌;單因素試驗；正交試驗；抑菌活性

葡萄(VitisviniferaL.)是葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(VitisL.)落葉藤本植物，是世界最古老的植物之一。葡萄在我國大部分地區(qū)均有栽培，尤其是新疆葡萄資源非常豐富[1～2]。葡萄葉是一種傳統(tǒng)的中藥材，可治嘔吐、水腫、小便不利、目赤等癥[3～5]。根據(jù)文獻報道，葡萄葉含有豐富的具有高生理活性的黃酮類、有機酸、鞣質(zhì)類、低聚芪類等化合物[3,5]。葡萄葉在土耳其、希臘及中東一帶大都作為烹飪材料，其中最有名的菜是多馬西(dolmasi)，以葡萄葉包米和絞肉的菜肴[6～8]。我國葡萄植物資源豐富，但大量的葡萄葉資源尚未得到充分的開發(fā)利用。周璇等對蔬菜、花卉、樹木、作物和雜草中的29科73種植物提取物抑菌活性進行了篩選，發(fā)現(xiàn)葡萄葉提取物有很強的抑菌活性[9～13]。本文以葡萄葉為原料，以70%乙醇為提取劑，以葡萄葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)的抑菌圈直徑為考察指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化了提取條件，并測定了乙醇提取物的體外抑菌活性，為葡萄葉抑菌活性物質(zhì)的提取及不同溶劑提取物抑菌活性比較提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

BL-75A立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DHG-9030電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；SHA-B多功能恒溫振蕩器(江蘇金壇市正基儀器有限公司)；HZQ-X100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；BSP-250生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；FW80高速萬能粉碎機(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；ZHJH-2109C智能型水平超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 材料與試劑

1.2.1 葡萄葉

2013年9月18日采自吐魯番市恰特喀勒鄉(xiāng)，自然晾干、于電熱恒溫鼓風干燥箱中40℃避光干燥、粉碎后，4℃冷藏備用。

1.2.2 菌種

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、白假絲酵母菌(Canidiaalbicans)均購自北京萊耀生物科技有限公司。

1.2.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、土豆培養(yǎng)基(PDA)等均購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉、蛋白胨均購自天津市英博生化試劑有限公司；牛肉膏購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；葡萄糖購自天津市天新精細化工開發(fā)中心；無水乙醇(A.R.)購自成都市科龍化工試劑廠。其余試劑均為分析純。

1.3 研究方法

1.3.1 單因素試驗

將葡萄葉置于50℃熱空氣干熱消毒箱內(nèi)烘干、粉碎、過60目篩后，分別稱取葡萄葉粉末若干份(每份約2g)，置于250mL的索氏提取器中，分別用不同濃度的乙醇(50%、60%、70%、80%)、不同提取時間(1h、2h、3h、4h)、不同提取溫度50℃、60℃、70℃、80℃)及不同料液比(1︰20、1︰30、1︰40、1︰50)回流3.5h，提取液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇、真空干燥得葡萄葉乙醇提取物，提取物用無菌水溶解，定容至10mL、4℃冷藏備用。

金黃色葡萄球菌活化后，制成106～108CFU/mL菌懸液。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂擴散法，37℃培養(yǎng)24h后測定抑菌圈的大小。每個抑菌試驗重復3次。

分別用不同濃度的乙醇為提取劑，以金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為考察指標，分別考察乙醇濃度、提取時間、提取溫度及料液比對葡萄葉乙醇提取物抑菌活性的影響。

1.3.2 正交試驗

以金黃色葡萄球菌抑菌圈效果為指標，確定提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時間4個因素。將葡萄葉置于50℃熱空氣干熱消毒箱內(nèi)烘干、粉碎、過60目篩后，分別稱取葡萄葉粉末若干份(每份約2g)，置于250mL的索氏提取器中，按4因素3水平L9(34)正交試驗設(shè)計進行提取，提取物用無菌水溶解，定容至10mL、4℃冷藏備用。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌活化后,制成106～108CFU/mL菌懸液。細菌培養(yǎng)及抑菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃培養(yǎng)24h。白假絲酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28℃培養(yǎng)24h。抑菌試驗采用K-B瓊脂擴散法，每個抑菌試驗重復3次。

采用正交試驗設(shè)計助手Ⅱ(v3.1)，對9組試驗數(shù)據(jù)進行分析，確定各因素對抑菌的影響，得到最優(yōu)提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對抑菌效果的影響結(jié)果

精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比分別加入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在溫度為70℃下提取3h。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮回收乙醇，得到干燥的提取物浸膏，提取物用無菌水溶解并定容至5mL，用4種提取液分別做對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗，結(jié)果見表1和圖1。

表1 乙醇濃度對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

圖1 乙醇濃度對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

Fig.1 Effect of ethanol concentration on the antibacterial activity

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，葡萄葉提取物的抑菌活性呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當乙醇濃度為70%時，葡萄葉提取物抑菌圈平均直徑最大，為13.54mm。當乙醇濃度高于70%時，葡萄葉提取物的抑菌活性降低，可能是隨著乙醇濃度的提高，脂溶性物質(zhì)溶出增加，對抑菌效果有一定的影響。因此，乙醇濃度為70%較合適。

2.2 料液比對抑菌效果的影響結(jié)果

精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，分別按1︰20、1︰30、1︰40、1︰50料液比，加入70%乙醇在溫度為70℃下提取3h；提取液按2.1的方法操作分別做抑菌試驗，4種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表2和圖2。

表2 料液比對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

圖2 料液比對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

Fig.2 Effect of material liquid ratio on the antibacterial activity

由圖2可知，隨著料液比的增大，抑菌圈直徑也在逐漸增大。在料液比為1︰50時，抑菌圈平均直徑最大，為13.27mm。由圖2可以看出，當料液比為1︰20時，葡萄葉提取物的抑菌活性較低，這可能是當料液比較小時，很難將葡萄葉中的抑菌活性物質(zhì)充分溶解在提取溶劑中。當料液比在1︰30至1︰50時，抑菌圈的平均直徑差異并不顯著，在料液比為1︰30時，提取物就可以達到比較好的抑菌效果，再增加提取溶劑的用量對其抑菌效果不大?？紤]到生產(chǎn)成本，確定料液比1︰30為宜。

2.3 提取時間對抑菌效果的影響

精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比，加入70%乙醇在溫度為70℃下分別提取1h、2h、3h、4h；提取液按2.1的方法操作分別做抑菌試驗，4種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表3和圖3。

表3 不同提取時間對抑菌效果的影響

圖3 浸提時間對葡萄葉提取液抑菌活性的影響

Fig.3 Effect of extraction time on the antibacterial activity

從圖3可以看出，隨著提取時間的延長，葡萄葉提取物的抑菌活性先增大后減小。在提取時間為3h時，抑菌效果最佳，測量抑菌圈平均直徑為12.91mm。當提取時間小于3h時，抑菌效果不明顯，可能是由于加熱時間短，葡萄葉內(nèi)的抑菌活性物質(zhì)未被充分浸提。當時間大于3h時，葡萄葉提取物的抑菌活性有下降的趨勢，可能是由于提取時間過長，少部分乙醇受熱揮發(fā)而導致沸點逐漸增大，從而破壞了提取物中的某些活性物質(zhì)，使抑菌活性降低。綜上考慮，選擇提取時間為3h。

2.4 提取溫度對抑菌效果的影響結(jié)果

精確稱取葡萄葉粉若干份(每份2g)，置于索氏提取器中，按1︰30的料液比，加入70%乙醇，在溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃下提取3h；提取液按2.1的方法操作分別做抑菌試驗，4種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表4和圖4。

表4 提取溫度對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

圖4 浸提溫度對葡萄葉提取物抑菌活性的影響

Fig.4 Effect of extraction temperature on the antibacterial activity

從表4可以看出，隨著提取溫度的升高，葡萄葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性先增大后減小。在提取溫度為70℃時，抑菌效果最明顯，平均抑菌圈直徑為13.86mm。在50℃～60℃之間，隨著提取溫度的升高葡萄葉乙醇提取液的抑菌活性逐漸增大。這可能是因為隨著溫度的升高，葡萄葉粗提物中抑菌活性物質(zhì)的提取除了具有溶解效應以外，還有熱效應，在一定溫度下有利于其溶解，使提取效率得到提高，從而具有更好的抑菌效果。當提取溫度高于70℃后，其抑菌活性又逐漸減小，可能是當溫度超過70℃時，會造成葡萄葉中抑菌物質(zhì)在過高溫度下，活性下降或失去活性。并且考慮到乙醇溶劑的沸點較低，在高溫時其會揮發(fā)加劇，使整個溶劑系統(tǒng)的極性過大，影響到浸提效果，導致抑菌效果不佳。故根據(jù)試驗結(jié)果選擇70℃為最佳提取溫度。

2.5 正交試驗結(jié)果及分析

在試驗中，由于各因素之間相互交叉影響，因此為全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，確定以乙醇濃度、料液比、浸提時間與提取溫度4種因素進行4因素3水平L9(34)正交試驗，優(yōu)選最佳提取條件。

通過正交試驗設(shè)計助手Ⅱ(v3.1)軟件，對9組試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到的正交試驗結(jié)果直觀分析見表5。由表5中極差(R)分析得到，提取溫度、乙醇濃度、料液比和提取時間4個因素對葡萄葉乙醇提取物抑菌活性影響的大小為，乙醇濃度>浸提溫度>料液比>浸提時間。根據(jù)正交試驗結(jié)果，葡萄葉中提取抑菌活性成分的最佳提取工藝條件為A2B2C3D2，即乙醇濃度70%、浸提溫度70℃、料液比1︰40、提取時間3h。

2.6 最佳提取條件下的抑菌試驗

通過正交試驗，確定葡萄葉的最佳提取條件，

并在此條件下獲得葡萄葉乙醇提取物，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母菌為供試菌，采用濾紙片法，嚴格按照無菌操作進行抑菌試驗，通過3次重復試驗，測得4種菌的抑菌圈直徑見圖5。

表5 葡萄葉乙醇提取物的 L9(34)正交試驗設(shè)計結(jié)果

注：A為浸提溫度(℃)；B為乙醇濃度(%)；C為料液比(料：液)；D為浸提時間(h)。

表6 最佳提取條件下對4種菌的抑菌效果比較

圖5 最佳提取條件下對4種菌的抑菌效果比較

Fig.5 Comparison of antibacterial effect by 4 bacteria under optimum condition

由圖5可以看出，在最佳提取條件下，葡萄葉乙醇提取物對4種菌的抑菌效果為，金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>白假絲酵母菌>枯草芽孢桿菌。

3 結(jié)論

通過試驗證實葡萄葉中含有抑菌活性成分。對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白假絲酵母菌都有較好的抑菌效果，但是對枯草芽孢桿菌的抑菌作用不太顯著。從葡萄葉中開發(fā)出天然抑菌活性物質(zhì)有一定的應用價值。但是抑菌活性成分的組成和化學結(jié)構(gòu)，還需要進一步研究。

葡萄葉提取抑菌活性成分可以采用索式提取器回流提取法。提取抑菌活性成分最佳提取工藝條件乙醇濃度70%、浸提溫度70℃、料液比1︰40、提取時間3h。

[1]庫爾班江·巴拉提,王萌,張小鶯.大孔樹脂富集分離葡萄葉總黃酮的研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2015,6(3):1073-1079.

[2]孫磊磊,康健,鄒積赟,等.葡萄葉復合茶的研制[J].食品科技,2014,39(11):59-61.

[3]孫磊磊,康健.響應面試驗優(yōu)化超聲波法提取葡萄葉白藜蘆醇工藝[J].食品工業(yè),2015,36(5):16-19.

[4]張縱圓,彭秧.葡萄葉中總黃酮的提取工藝研究[J].生物技術(shù),2007,17(6):58-60.

[5]邊梅娜,李松澤,白紅進,等.響應面法優(yōu)化赤霞珠葡萄葉總黃酮的提取工藝[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,2013,50(11):2037-2045.

[6]孫磊磊,康健,鄒積赟.響應面優(yōu)化酶法輔助提取葡萄葉白藜蘆醇工藝[J].食品科技,2015,40(2):276-281.

[7]毛俊霞,張文君,李曦默,等.響應面法優(yōu)化葡萄葉中白藜蘆醇的提取條件[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26(12):2027-2032.

[8]袁茜,周寶利,李之璞.不同提取條件對葡萄葉提取物抑制兩種病原菌活性的影響[J].植物保護,2009,35(2):125-127.

[9]周璇,周寶利,李志文.抑制茄子黃萎菌的植物提取物的篩選[J].生態(tài)學雜志,2007,26(8):1217-1221.

[10]李欣,喬家駒,馮漢青,等.杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(11):62-65.

[11]林雄平,周逢芳,陳曉清,等.石花菜和海蒿子提取物抗菌活性初步研究[J].亞熱帶植物科學,2011,40(1):28-30.

[12]王奎,馮穎,孫龍,等.美洲大蠊乙酸乙酯提取物的分離和抑菌活性分析[J].林業(yè)科學研究,2013,26(2):163-166.

[13]楊玉,劉曉艷,吳梟瞭.竹蓀乙酸乙酯提取物的抑菌作用研究[J].長江大學學報(自然科學版),2014,29(11):66-68.

Extraction Process and Vitro Antibacterial Activity of Grape Leaves’ Ethanol Extract

KORBANJHON Brad

(College of Chemistry and Environmental Sciences,Yili Normal University,Yining Xinjiang 835000,P.R.China)

To identify the optimum extraction process of ethanol extract from grape leaves,taking grape leaves collected Chatqal Township of Turpan city as research materials,Soxhlet extractor reflux extraction were used to extract ethanol.The optimum process conditions were studied based on antibacterial tests ofEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,CanidiaalbicansandBacillussubtiliswith consideration of several factors such as ethanol concentration,extraction temperature,extraction time and solid-liquid ratio.Orthogonal test was conducted based on single-factor test,and vitro antibacterial activity was measured through K-B agar diffusion method.In this test,the indicator bacteria wasStaphylococcusaureus,and the indictor was the diameter of bacterial inhibition zone.The results showed that the order of the factors that influence the antibacterial activity was ethanol concentration>extraction temperature>solid-liquid ratio>extraction time,and the optimum extraction process was 70% ethanol concentration,extraction temperature 70℃,solid-liquid ratio 1︰30,extraction time 3h.The influence order of ethanol extract on the antibacterial activity of the 4 selected bacteria wasStaphyloccocusaureus>Escherichiacoli>Canidiaalbicans>Bacillussubtilis,and among them,the ethanol extract had significant effect onStaphylococcusaureusandEscherichiacoli,but not significant forBacillussubtilis.

grape leaves;ethanol extract;Soxhlet extractor reflux extraction;Staphylococcusaureus;single factor test;orthogonal test;antibacterial activities

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.007

2015-12-28

伊犁師范學院科研項目基金資助項目(2013YLSYY003)。

庫爾班江·巴拉提(1962-)，男，教授，碩士生導師，主要從事中藥與天然藥物的研究。E-mail: korbanjhon@126.com

Q 946.8；R 284.2

A

1672-8246(2016)06-0037-06