高晉，董恒，隋傅，徐婷婷，曾凡鎖

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

UV-B輻射對(duì)白樺種子萌發(fā)及幼苗生理指標(biāo)影響*

高晉，董恒，隋傅，徐婷婷，曾凡鎖

(東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040)

以人工模擬增強(qiáng)UV-B輻射(25μw/cm2，50μw/cm2)處理白樺種子及幼苗，統(tǒng)計(jì)其發(fā)芽率及根長(zhǎng)，測(cè)定幼苗丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)含量以及超氧化物岐化酶(SOD)活性和過氧化物酶(POD)活性，揭示UV-B輻射處理對(duì)白樺種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的影響。UV-B輻射顯著影響了白樺種子萌發(fā)，25μw/cm2和50μw/cm2處理后萌發(fā)率分別較對(duì)照低了10%和16%，且根生長(zhǎng)分別較對(duì)照低6%和32%。隨著UV-B處理強(qiáng)度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，白樺幼苗中MDA的含量顯著增加；幼苗的SOD和POD活性呈現(xiàn)先增加(10h前)后降低的趨勢(shì)。25μw/cm2和50μw/cm2UV-B處理后白樺幼苗的NO含量顯著升高，在1h時(shí)，分別較對(duì)照升高了96.32%和92.94%；同時(shí)，UV-B處理后H2O2含量均顯著升高，在1h時(shí)，分別較對(duì)照升高了64.92%和20.43%；5h后，50μw/cm2UV-B處理的白樺幼苗的H2O2含量是25μw/cm2的1.5倍。UV-B輻射抑制了白樺種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，并隨著UV-B輻射強(qiáng)度的增強(qiáng)，抑制程度越強(qiáng)。NO和ROS參與白樺UV-B輻射信號(hào)傳導(dǎo)過程，并存在協(xié)同作用。

白樺；種子萌發(fā)；幼苗生長(zhǎng)；UV-B輻射

近年來(lái)，由于氟氯烷烴(CFCs)、溴鹵代烴(Halons)等化合物的排放增加，導(dǎo)致大氣平流層中臭氧分子遭到破壞，臭氧濃度不斷降低，致使到達(dá)地表的紫外輻射增強(qiáng)。雖然UV-B輻射(280～320nm)僅占所有到達(dá)地球表面電磁光譜的很小一部分，但卻對(duì)動(dòng)植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、遺傳特性和生長(zhǎng)周期等方面會(huì)產(chǎn)生顯著影響，并且UV-B 輻射越強(qiáng)，對(duì)植物的影響越大[1]。

一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)是植物體內(nèi)廣泛存在的信號(hào)分子，在多種生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)過程中，NO和ROS協(xié)同作用，激活植物的防御基因。有研究認(rèn)為NO是UV-B 輻射的第二信使，并通過改變細(xì)胞壁的機(jī)械和化學(xué)特性來(lái)影響玉米(Zeamays)中胚軸和葉片生長(zhǎng)[2]。但ROS是否參與植物對(duì)UV-B輻射的防御及其與NO的關(guān)系尚不清楚。白樺(Betulaplatypylla)為次生林的先鋒樹種，在林業(yè)生產(chǎn)上具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。本研究以白樺為研究材料，人工模擬UV-B輻射處理種子及其幼苗，通過種子活力、生理指標(biāo)及信號(hào)分子濃度變化揭示UV-B輻射對(duì)白樺種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，對(duì)解釋植物對(duì)UV-B輻射脅迫的響應(yīng)及適應(yīng)機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用的種子采自東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園。苗木為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲害、長(zhǎng)勢(shì)一致的1年生苗木。

1.2 研究方法

1.2.1 UV-B處理

研究共設(shè)置對(duì)照組(CK)和實(shí)驗(yàn)組(K1、K2)共3個(gè)組，對(duì)照為自然光照射處理，K1的UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2處理，K2的UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2處理。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各處理10天，測(cè)定萌發(fā)率及其根長(zhǎng)。在生理指標(biāo)實(shí)驗(yàn)以及NO和H2O2測(cè)定中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各處理0.5h、1h、5h、10h、24h、36h，分別在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取白樺幼苗葉片，輻射強(qiáng)度由紫外輻照計(jì)測(cè)定。

1.2.2 材料培養(yǎng)

將白樺種子培養(yǎng)在含有3層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，幼苗放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。溫度(25±2)℃，濕度60%～80%，光照周期為14h光照、10h黑暗。

1.2.3 有關(guān)指標(biāo)測(cè)定

(1)種子萌發(fā)率及根長(zhǎng)測(cè)定 白樺種子點(diǎn)播在含有3層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)基上，第2天開始計(jì)數(shù)，每24h統(tǒng)計(jì)1次種子萌發(fā)情況。種子萌發(fā)和生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定參照宋松泉等的方法[3]進(jìn)行。每組統(tǒng)計(jì)150粒，重復(fù)3次，連續(xù)統(tǒng)計(jì)10天。判斷種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為種子露根。第11天計(jì)算各組發(fā)芽率。發(fā)芽率按照以下公式進(jìn)行計(jì)算：發(fā)芽率(Gr)=(前11d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

白樺種子于培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量根的長(zhǎng)度，以平均值表示。

(2)幼苗生理指標(biāo)測(cè)定 丙二醛含量(MDA)的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[4]，超氧化物岐化酶(SOD)含量的測(cè)定采用NBT光還原法[5]，過氧化物酶(POD)含量的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[6]，NO和ROS的測(cè)定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒方法。測(cè)定NO的原理是NO在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值。而測(cè)定ROS的原理是H2O2與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物，在415nm有特征吸收峰。一次取3個(gè)平行樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入、計(jì)算以及圖表繪制。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。MDA含量，POD、SOD活性以及NO和H2O2的含量均采用相對(duì)值(指標(biāo)相對(duì)值=處理指標(biāo)值-對(duì)照指標(biāo)值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B輻射對(duì)白樺種子萌發(fā)的影響

不同強(qiáng)度UV-B輻射處理影響了白樺種子的萌發(fā)(圖1和圖2)。UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2和50μw/cm2的萌發(fā)率均低于自然光照射組，分別下降了10%、16%，差異顯著(P<0.05)。UV-B照射組和對(duì)照組的子葉顏色也存在差異，UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2時(shí)萌發(fā)的子葉為淡綠色，UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2時(shí)，子葉為淡黃色，而對(duì)照組子葉為翠綠色，說(shuō)明隨著UV-B輻射的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，白樺種子的萌發(fā)受到明顯抑制作用。

圖1 不同UV-B強(qiáng)度下白樺種子的萌發(fā)情況

圖2 不同UV-B強(qiáng)度下白樺種子的萌發(fā)率

2.2 UV-B輻射對(duì)白樺根長(zhǎng)的影響

不同強(qiáng)度的UV-B輻射處理顯著影響了白樺根的生長(zhǎng)。對(duì)照組與UV-B照射組的種子萌發(fā)后的根長(zhǎng)在2～3mm所占的比例最多。但與對(duì)照組相比，UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2和50μw/cm2的照射組根長(zhǎng)大于3mm的白樺幼苗數(shù)目明顯減少，分別減少19.47%和62.83%。并且在UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2時(shí)，萌發(fā)的白樺種子的根長(zhǎng)沒有超過5mm的。這說(shuō)明UV-B輻射抑制了白樺根的生長(zhǎng)，并且具有劑量效應(yīng)。

圖3 不同UV-B強(qiáng)度處理下白樺的根長(zhǎng)

2.3 UV-B輻射對(duì)白樺幼苗內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

植物在逆境下遭受傷害與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)，其中丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一[7]。通過測(cè)定MDA相對(duì)含量了解膜脂過氧化的程度，來(lái)反映植物受傷害的程度。由圖4可以看出，不同強(qiáng)度UV-B照射后，UV-B照射組中的丙二醛相對(duì)含量升高，UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2的照射組中的丙二醛含量高于25μw/cm2的照射組。并隨著UV-B處理的時(shí)間逐漸增長(zhǎng)，MDA含量也逐漸增加，至24h時(shí)到達(dá)最高，之后便開始下降。25μw/cm2和50μw/cm2UV-B照射24h后，MDA含量分別較對(duì)照組提高了36.34%和52.79%。由此說(shuō)明，UV-B輻射使植物細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化作用加劇，而且UV-B強(qiáng)度越大，損傷越嚴(yán)重。

圖4 UV-B對(duì)白樺苗內(nèi)MDA含量的影響

2.4 UV-B輻射對(duì)白樺超氧化物岐化酶(SOD)含量的影響

SOD是植物自身產(chǎn)生的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。因此可以通過測(cè)定SOD了解植物受損傷程度。圖5顯示了白樺在不同UV-B輻射強(qiáng)度時(shí)，SOD相對(duì)活性的變化。可以看出，UV-B照射10h內(nèi)，UV-B照射組的SOD活性隨著照射時(shí)間的增加，SOD的活性也逐漸增強(qiáng)，且50μw/cm2的照射強(qiáng)度下幼苗的SOD活性比25μw/cm2高，差異顯著(P<0.05)。不同強(qiáng)度UV-B照射24h后，SOD相對(duì)活性均下降并低于對(duì)照組。說(shuō)明在一定時(shí)間內(nèi)，隨著UV-B強(qiáng)度的增加，植物體啟動(dòng)防御機(jī)制，產(chǎn)生SOD保護(hù)植物體免于UV-B輻射產(chǎn)生的脅迫損傷。

圖5 UV-B對(duì)白樺苗內(nèi)SOD含量的影響

2.5 UV-B輻射對(duì)白樺過氧化物酶(POD)含量的影響

POD是植物體酶促清除系統(tǒng)的另一個(gè)成員。由圖6可以看出，在整個(gè)UV-B處理過程中，POD的活性變化趨勢(shì)與SOD的變化趨勢(shì)相同。10h內(nèi)，UV-B照射組幼苗的POD活性逐漸升高，并且UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2照射組中的POD活性高于25μw/cm2，最高峰出現(xiàn)在10h，與自然光照射組比，分別增長(zhǎng)了35.58%、47.99%，差異顯著(P<0.05)。24h后，UV-B照射組幼苗的POD活性明顯降低。

圖6 UV-B對(duì)白樺苗內(nèi)POD含量的影響

2.6 UV-B輻射對(duì)白樺幼苗內(nèi)NO含量的影響

NO是一種特殊的小分子，并且兼有水、脂溶性。圖7顯示了白樺幼苗在不同UV-B輻射強(qiáng)度時(shí)，植株體內(nèi)NO含量的變化。UV-B照射前期(5h內(nèi)),NO發(fā)生明顯的變化，最高峰出現(xiàn)在1h，UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2和50μw/cm2分別比對(duì)照組增加了96.32%、92.94%，(P<0.05)；照射中期(5h-24h)，NO相對(duì)含量降低；后期(36h)25μw/cm2UV-B處理組中的NO含量又升高，25μw/cm2UV-B處理組中NO含量高于50μw/cm2。由此可知，NO參與了植物的UV-B輻射調(diào)控。

圖7 UV-B輻射下白樺苗NO含量的變化

2.7 UV-B輻射對(duì)白樺幼苗內(nèi)H2O2含量的影響

ROS不僅是植物有氧代謝的副產(chǎn)物，而且也是重要的信號(hào)分子，H2O2作為ROS家族中的一員，可以穿過生物膜，進(jìn)而使得它們適合以信號(hào)分子的形式存在。圖8顯示了白樺幼苗在不同UV-B輻射強(qiáng)度時(shí)，體內(nèi)H2O2含量的變化。在UV-B照射下的H2O2含量發(fā)生了明顯的變化，不同強(qiáng)度UV-B處理后H2O2含量顯著升高。并且在UV-B處理5h后，50μw/cm2UV-B處理白樺幼苗的H2O2含量高于25μw/cm2UV-B處理組。說(shuō)明高劑量的UV-B輻射，增加了植物體內(nèi)H2O2的積累。

圖8 UV-B輻射下白樺苗H2O2含量的變化

3 結(jié)論與討論

植物生命的初始階段是種子萌發(fā)，種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)是衡量種子萌發(fā)快慢和發(fā)芽整齊度的重要指標(biāo)。其高低直接表明在種子萌發(fā)過程中代謝反應(yīng)合成物質(zhì)過程啟動(dòng)的快慢[8]。在本研究中，選用劑量為25μw/cm2和50μw/cm2的UV-B輻射處理白樺種子，結(jié)果表明，隨著UV-B輻射的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，白樺種子的發(fā)芽率及其幼苗的根長(zhǎng)均有明顯的降低及縮短。同時(shí)隨著UV-B輻射的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，MDA、SOD、POD均發(fā)生明顯的變化，膜脂氧化程度加深，說(shuō)明UV-B輻射強(qiáng)度越大對(duì)生物體生長(zhǎng)的影響就越大。此外，在UV-B脅迫下，NO和ROS也參與調(diào)控植物體的發(fā)育。

在UV-B處理下，白樺幼苗中SOD與POD的變化趨勢(shì)相同。在處理前期，UV-B照射組中幼苗的SOD與POD活性逐漸升高。24h后，UV-B照射組幼苗的2種酶的活性明顯降低。UV-B處理的水稻(Oryzasativa)葉中也觀察到在處理初期SOD活性有所升高[9]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨著照射時(shí)間的增加，白樺幼苗的MDA含量上升，說(shuō)明細(xì)胞膜脂過氧化程度加深，通透性增加，細(xì)胞受到了較大程度的傷害。說(shuō)明當(dāng)植物體遭受UV-B照射時(shí)，細(xì)胞壁上會(huì)產(chǎn)生ROS，激活植物體的防御反應(yīng)，開啟包括SOD和POD的酶促清除系統(tǒng)，清除由UV-B脅迫產(chǎn)生的過多的ROS，提高其對(duì)氧化脅迫的抗性[10]。但隨著脅迫時(shí)間的增加，ROS反應(yīng)越劇烈，積累量劇增，超出植物的自身的清除能力，植物體各組織嚴(yán)重受損。

UV-B照射前期(5h內(nèi))，UV-B強(qiáng)度為25μw/cm2和50μw/cm2照射組的NO含量顯著高于對(duì)照組，分別比對(duì)照組增長(zhǎng)了1.57μmol/g，0.79μmol/g。5h后，NO濃度降低；UV-B照射組中的H2O2含量均高于對(duì)照組。并且在UV-B處理5h后，隨著UV-B強(qiáng)度的逐漸增強(qiáng)，UV-B強(qiáng)度為50μw/cm2的照射組中H2O2含量高于25μw/cm2的照射組。有研究認(rèn)為NO可能是UV-B輻射的第二信使，并通過改變細(xì)胞壁的機(jī)械和化學(xué)特性來(lái)影響玉米中胚軸和葉片生長(zhǎng)[11]。Wang等[12]的研究表明NO和ROS 協(xié)同參與了UV-B誘導(dǎo)的乙烯合成。擬南芥(Arabidopsisthaliana)研究表明H2O2通過激活MPK6調(diào)控NO的合成[13]，說(shuō)明NO與ROS二者間有密切聯(lián)系。在UV-B照射下，白樺幼苗中NO和H2O2的活性存在此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)。Delledonne等[14]在大豆細(xì)胞寄主細(xì)胞過敏性壞死(Hypersensitive response，HR)反應(yīng)過程中也證明了這一點(diǎn)。單獨(dú)NO或ROS的產(chǎn)生都不能引起細(xì)胞的過敏性死亡，只有當(dāng)NO和ROS的產(chǎn)生處于一定程度的平衡時(shí)，才會(huì)激活HR。植物體內(nèi)NO和H2O2也可能相互調(diào)節(jié)彼此含量的消長(zhǎng)[15]。UV-B輻射對(duì)植物的調(diào)控與輻照的劑量以及輻照時(shí)間有一定的相關(guān)性，輻照時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)植物的損傷越大；高劑量的輻射對(duì)植物具有傷害效應(yīng)，可抑制植物種子的萌發(fā)以及生長(zhǎng)發(fā)育。而對(duì)于UV-B低劑量效應(yīng)以及UV-B的傷害效應(yīng)的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]韓榕,王勛陵,岳明.增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)小麥體細(xì)胞分裂的影響[J].遺傳學(xué)報(bào),2002,29(6):537-541.

[2]張滿效,陳拓,安黎哲,等.UV-B和NO對(duì)胞壁蛋白的影響[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,41(1):39-44.

[3]宋松泉,程紅焱,龍春林,等.種子生物學(xué)研究指南[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

[4]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000.

[5]張文軍.NBT光還原法、鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD酶活性的比較[J].河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),2000,14(2):1-3.

[6]李忠光,龔明.愈創(chuàng)木酚法測(cè)定植物過氧化物酶活性的改進(jìn)[J].植物生理學(xué)通訊,2008,44(2):323-324.

[7]李曉陽(yáng),陳慧澤,韓榕.UV-B輻射對(duì)擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響[J].植物學(xué)報(bào),2013,48(1):52-58.

[8]馮虎元,安黎哲,陳書燕,等.增強(qiáng)UV-B輻射與干旱復(fù)合處理對(duì)小麥幼苗生理特性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2002,22(9):1564-1568.

[9]晏斌,戴秋.紫外線B對(duì)水稻葉組織中活性氧代謝及膜系統(tǒng)的影響[J].植物生理學(xué)報(bào),1999,22(4):373-378.

[10]陳拓,任紅旭,王勛陵.UV-B輻射對(duì)小麥葉抗氧化系統(tǒng)的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),1999,19(4):453-455.

[11]張滿效,陳拓,安黎哲,等.UV-B誘導(dǎo)的玉米幼苗系統(tǒng)信號(hào)網(wǎng)對(duì)根系生長(zhǎng)的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,30(3):340-344.

[12]WANG Yi bo,HU Feng yuan,QU Ying,etal.Effects of reactive oxygen species on UV-B-induced ethylene production in leaves of maize seedlings[J].Chinese Journal of Plant Ecology,2007,31(5):946-951.

[13]王鵬程.擬南芥活性氧應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制研究[D].鄭州:河南大學(xué),2010.

[14]Delledonne M,Zeier J.Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response[J].PNAS,2001,98:13454-13459.

[15]董海麗,井金學(xué).活性氧和一氧化氮在植物抗病反應(yīng)中的作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2003,31(1):45-49.

Effect of UV-B Radiation on Seed Germination and Seedling Growth ofBetulaplatypylla

GAO Jin, DONG Heng, SUI Fu, XU Ting-ting, ZENG Fan-suo

(College of Life Sciences,Northeast Forestry University,Harbin Heilongjiang 150040,P.R.China)

Betulaplatypyllaseed and seedling were treated with artificial UV-B (25μw/cm2,50μw/cm2).To explore the impact of UV-B radiation onBetulaplatypyllaseed germination and seedling growth,the paper studied germination rate,root length,and measured the content of MDA,NO and ROS and the activity of SOD and POD.Seed germination was influenced by UV-B radiation significantly.The germination rate of 25μw/cm2and 50μw/cm2treatment decreased by 10% and 16%,respectively,comparing with control group.The growth of root length was inhibited,with 6% and 32% lower than control.With the increase in UV-B intensity and treating time,the content of MDA ascended significantly,and the activity of SOD and POD were enhanced at first (before 10h),then descended.The content of NO in 25μw/cm2and 50μw/cm2treatment group increased significantly,with 96.32%,92.94% higher than control group.At the same time,the content of H2O2increased significantly under UV-B radiation by 64.92%,20.43% respectively higher than control group.But after 5 hours,the content of H2O2under 50μw/cm2treatment was 1.5 times more than that of under 25μw/cm2treatment.The results show that the seed germination and seedling growth ofBetulaplatypyllawere inhibited by the UV-B radiation.NO and ROS were involved in the process of UV-B radiation signal transduction inBetulaplatypylla.

Betulaplatypylla; seed germination; seedling growth; UV-B radiation

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.06.012

2016-01-08

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201410225020)。

高晉(1993-)，男，主要從事植物基因工程研究。E-mail：806671695@qq.com

簡(jiǎn)介：曾凡鎖(1980-)，男，副教授，博士，主要從事林木遺傳育種和生物技術(shù)研究。E-mail：zengfansuo@126.com

S 792.153

A

1672-8246(2016)06-0068-05