牛婕婷，潘瑞麗，周彥宏，婁彬彬，姜霞，趙思雨，費鵬，滿朝新，姜毓君

(東北農業(yè)大學a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150030)

常用消毒劑對不同材料表面克羅諾桿菌的影響

牛婕婷a，潘瑞麗a，周彥宏a，婁彬彬a，姜霞a，趙思雨a，費鵬a，滿朝新b，姜毓君ab

(東北農業(yè)大學a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.國家乳業(yè)工程技術研究中心，哈爾濱150030)

以5株分離自嬰兒配方乳粉及其加工環(huán)境中的克羅諾桿菌為研究對象，研究常用消毒劑對不銹鋼、聚四氟乙烯和玻璃這3種材料表面克羅諾桿菌的影響。結果表明：當3種消毒劑處于一定濃度時，不銹鋼表面殘存活菌數(shù)量明顯多于玻璃表面殘存活菌數(shù)量且存在顯著性差異。當過氧乙酸和過氧化氫的質量濃度為分別為3 g/L和35 g/L，二氧化氯為3 g/L時，在3種料上均未檢測出克羅諾桿菌。本研究為嬰兒配方乳粉生產及儲存過程中克羅諾桿菌的防控提供理論依據(jù)，有助于選擇合適材質減少克羅諾桿菌對嬰兒配方乳粉污染的可能。

克羅諾桿菌；不銹鋼；聚四氟乙烯；玻璃；消毒劑

0 引言

克羅諾桿菌(Cronobacter)原名阪崎腸桿菌(Entero?bacter sakazakii)[1-2]，是嬰兒配方乳粉(powdered infant formula，PIF)中的A類致病菌[3-5]，能夠通過污染PIF造成新生兒感染[6-8]，致死率高達40%～80%[9-11]。目前已有消毒劑對克羅諾桿菌菌懸液的抑菌效果的相關報道[12-13]，同時一些研究者發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌粘附在不同材料會導致殺菌效果的差異，但是關于不同材料對消毒劑抑菌效果影響的研究并不全面。本實驗選取分離自加工環(huán)境和成品的5株克羅諾桿菌，選取乳粉加工環(huán)境中常見的三種接觸材料不銹鋼、玻璃、聚四氟乙烯[14]，以及常用消毒劑過氧乙酸、二氧化氯、過氧化氫，來研究不同材料表面對克羅諾桿菌消毒作用的影響，對于更好的控制和消除克羅諾桿菌的污染、指導嬰兒配方乳粉的生產具有重要的意義。

1 實驗

1.1菌株

本實驗所用5株克羅諾桿菌分離自不同地區(qū)的嬰幼兒配方粉生產企業(yè)加工環(huán)境和嬰幼兒配方粉樣品。詳細信息如表1所示。

1.2表面試驗材料

不銹鋼片(SUS 304，2 cm×2 cm)，玻璃片(2 cm× 2 cm)，聚四氟乙烯片(2 cm×2 cm)。

1.3儀器與設備

生物超凈工作臺，離心機，pH計，恒溫培養(yǎng)箱，滅菌鍋，超聲清洗儀，振蕩器，電子天平。

表1 實驗用菌株及其來源

1.4主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，甘油，DE中和培養(yǎng)基，吐溫-80，食品級過氧化氫消毒劑、食品級二氧化氯消毒劑、食品級過氧乙酸消毒劑，NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，CaCO3。

1.5方法

1.5.1 克羅諾桿菌的菌懸液制備

取出-20℃甘油保存的含有克羅諾桿菌的凍存管，按質量分數(shù)為2%的接種量接于TSB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h進行活化，將活化后的菌株在TSA固體培養(yǎng)基上進行三區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落，置于10 mL液體TSB培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，在轉速為4 000 r/min，15 min離心得菌沉淀，將菌沉淀重懸于用PBS溶液中進行洗滌兩次，最后用PBS溶液進行稀釋，調整初始菌液濃度最終達到每片8.0（對數(shù)值）。

1.5.2 染菌材料的制備

材料的清洗和滅菌:將不銹鋼片和玻璃片用15%磷酸溶液超聲20 min,用蒸餾水洗凈，清洗后的不銹鋼和玻璃片，待干燥后，放入玻璃平皿中，然后將玻璃平皿放入烘箱170℃，3 h進行干熱滅菌待用，將聚四氟乙烯片放入體積分數(shù)為75%酒精中浸泡12 h待用。

材料表面接種：分別取100 μL菌懸液滴加到3種不同材料表面上，在生物安全柜中在室溫下，干燥2 h。

1.5.3 消毒劑的稀釋和中和劑的配置

（1）消毒劑的稀釋

將食品級過氧乙酸消毒劑(質量濃度為160 g/L)使用滅菌的硬質水（0.4 g，1 L蒸餾水）稀釋到質量濃度分別為1，1.5，2，2.5，3 g/L。

將食品級二氧化氯消毒劑使用無菌的硬質水稀釋到0.5，1，1.5，2，2.5，3 g/L。

將食品級過氧化氫消毒劑(質量濃度350 g/L)使用滅菌的硬質水稀釋成質量濃度為10，15，20，25，30，35 g/L。

（2）中和劑的配置

取34 g DE中和培養(yǎng)基，5 g吐溫80溶解于1 L蒸餾水中[15]，分裝到50 mL的離心管中，121℃，15 min滅菌，待用。

1.5.4 消毒液對3種染菌材料的殺菌實驗

取200 μL的不同稀釋濃度的消毒劑分別滴加到材料表面的接種點上的，完全覆蓋之前的干燥菌液，處理10 min，作用完馬上將處理的材料放入已滅菌的含有10 mL的DE中和肉湯培養(yǎng)基和3 g玻璃珠（直徑0.5 mm）50 mL的離心管中，立即終止作用，中和作用5 min后以最大轉速離心1 min進行徹底洗脫。將洗脫液進行梯度稀釋，取100 μL的混合液均勻涂布于TSA固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)時間的延長是為了使未致死的細胞能完全恢復，最后觀察克羅諾桿菌的生長情況，進行菌落計數(shù)，結果以每片的對數(shù)值表示，所有實驗重復3次。無菌硬質水滴加到接種點，處理相同時間作為空白對照。

1.6統(tǒng)計分析

采用SPSS公司(SPSS inc.)統(tǒng)計軟件SPSS v17.0將數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1過氧乙酸對不同材料表面克羅諾桿菌殺菌作用試驗

通過梯度稀釋平板計數(shù)的方法，對5株克羅諾桿菌在不同材料表面用過氧乙酸消毒劑處理后的情況進行差異性分析，結果如表1所示。5株菌當用過氧乙酸質量濃度為3 g/L處理后時，均未檢測出克羅諾桿菌?？肆_諾桿菌ES3在過氧乙酸質量濃度為1 g/L和2.5 g/L時，在不銹鋼片，聚四氟乙烯片，玻璃片三種材料表面上沒有呈現(xiàn)出明顯的差異；而當過氧乙酸質量濃度為1.5 g/L和2 g/L時，在不銹鋼片和玻璃片上存在明顯差異(P<0.05)?？肆_諾桿菌ES35在過氧乙酸質量濃度為1，1.5，2 g/L時，在不銹鋼片上和聚四氟乙烯片上未出現(xiàn)明顯差異，而這兩種材料均與玻璃片之間呈現(xiàn)出明顯差異（P<0.05），在過氧乙酸質量濃度達到2.5 g/L時，不銹鋼片和聚四氟乙烯片出現(xiàn)了顯著性差異（P<0.05），而聚四氟乙烯與玻璃片卻未出現(xiàn)明顯差異?？肆_諾桿菌ES45和ES46質量濃度均在1，1.5，2，2.5 g/L時，在不銹鋼和玻璃片上存在顯著性差異。ES52在質量濃度為1.5 g/L和2 g/L時，在不銹鋼和玻璃片上存在顯著性差異。因此可以判定，5株菌當用過氧乙酸處于中間質量濃度1.5 g/L和2 g/L處理后，在不銹鋼片上和玻璃片上均存在顯著性的差異（P< 0.05），不銹鋼片上的菌存活量較玻璃片上存活的菌多。

表1 過氧乙酸對不同材料表面克羅諾桿菌殺菌作用

表2 二氧化氯對不同材料表面克羅諾桿菌殺菌作用

2.2二氧化氯對克羅諾桿菌殺菌作用

5株克羅諾桿菌在不同材料表面進行二氧化氯消毒劑的處理試驗的差異性分析結果如表2所示。5株菌在二氧化氯濃度為3 g/L處理時，在3種材料上均未檢測出有菌。5株菌在二氧化氯濃度為1.5 g/L時，在不銹鋼片，聚四氟乙烯片，玻璃片三者之間均呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。5株菌在二氧化氯濃度為0.5，1，1.5，2.5g/L時，不銹鋼和玻璃片兩者之間呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05）。總體來說，在二氧化氯的濃度處于中低濃度時，在不銹鋼和玻璃片之間呈現(xiàn)出顯著性差異（P<0.05），不銹鋼片上的菌存活量較玻璃片上存活的菌多。

2.3過氧化氫對克羅諾桿菌殺菌作用

5株克羅諾桿菌在不同材料表面進行過氧化氫消毒劑的處理試驗的差異性分析如表3所示。5株菌當用過氧化氫質量濃度為35 g/L處理后，在三種材料上均未檢測出有菌。5株菌在用過氧化氫質量濃度小于30 g/L處理后，在不銹鋼片和玻璃片上都存在顯著性差異（P<0.05）。由此可以推斷，當用過氧化氫消毒劑處理時，在不銹鋼和玻璃片間存在顯著性差異（P< 0.05），而這種差異主要表現(xiàn)在過氧化氫處于中低質量濃度時。

表3 過氧化氫對不同材料表面克羅諾桿菌殺菌作用

通過以上3種消毒劑對不銹鋼、聚四氟乙烯和玻璃表面克羅諾桿菌殺菌作用的試驗結果來看，當3種消毒劑處于一定濃度時，不銹鋼表面殘存活菌數(shù)量明顯多于玻璃表面殘存活菌數(shù)量，這一結果與張娜[14]等人的研究結果相一致。不銹鋼和玻璃片之間的顯著性差異可能是由于不銹鋼片表面粗糙，具有明顯的溝壑結構，在用消毒劑處理時，更有利于菌的存活。而玻璃片表面較光滑所以活菌數(shù)較少。因此,由本研究可推斷出，材料表面的粗糙度是影響消毒劑對表面殺菌效果的重要因素之一。

3 結論

通過3種化學消毒劑過氧乙酸、二氧化氯、過氧化氫對在不銹鋼片、聚四氟乙烯片、玻璃片上的克羅諾桿菌進行殺菌處理，結果表明，當過氧乙酸、過氧化氫的質量濃度分別為3 g/L和35 g/L，二氧化氯為3 g/L時，在3種材料上均未檢測出克羅諾桿菌。且當3種消毒劑濃度處于中間濃度時，不銹鋼表面殘存活菌數(shù)量明顯多于玻璃表面殘存活菌數(shù)量，存在顯著性差異。

[1]陳雅蘅,周幗萍.食品工業(yè)中克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)的污染與控制[J].中國釀造,2013,32(7):16-19.

[2]裴曉燕,劉秀梅.中國市售配方粉中阪崎腸桿菌和其它腸桿菌的污染狀況[J].中國食品學報,2006（5）:6-10.

[3]徐灣,姜華.我國克羅諾桿菌污染現(xiàn)狀與預防控制措施研究進展[J].中國病原生物學雜志,2015,10(9):848-851.

[4]洪程基,李毅.溫州市嬰幼兒感染性腹瀉疾病中阪崎腸桿菌的檢測研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2015,25（2）：193-195.

[5]FEI P,MAN C.Genotyping and source tracking of the Cronobacter sakazakii and C.malonaticus isolated from powdered infant formula and an infant formula production factory in China[J].Applied and en?vironmental microbiology,2015:01390-15.

[6]董曉暉,吳清平.克羅諾桿菌檢測研究進展[J].華中農業(yè)大學學報, 2013（1）:130-136.

[7]MULLANE N R,IVERSEN C,HEALY B,et al.Enterobacter saka?zakii an emerging bacterial pathogen with implications for infant health [J].Minerva Pediatrica,2007,59(2):137-148.

[8]LI R,FEI P.Tea polyphenols inactivate Cronobacter sakazakii isolated from powdered infant formula[J].Journal of dairy science.2015 Nov 28.

[9]婁彬彬,滿朝新,費鵬,等.阪崎克羅諾桿菌的16S rDNA鑒定分型[J].中國食物與營養(yǎng),2015,21(7):39-42.

[10]牛婕婷,滿朝新,等.阪崎克羅諾桿菌的ITS序列分析[J].中國食物與營養(yǎng),2015,21(3):27-30.

[11]KIM H,BENCHAT L R.Survival and growth of Enterobacter sakaza?kii on fresh-cut fruits and vegetables and in unpasteurized juice as af?fected by storage temperature[J].J.Food Prot，2005，68:2541-2552.

[12]廖明治,田麗萍.乳制品生產過程中阪崎腸桿菌的控制研究[J].乳業(yè)科學與技術,2011,34(1):33-35.

[13]張翼,陳雅蘅,周幗萍,等.克羅諾桿菌的生物膜檢測和藥敏性分析[J].食品科學,?2015,36(21):129-134.

[14]張娜,韓北忠.食品接觸表面對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響[J].食品研究與開發(fā),2006,27(7):33-8.

[15]KIM H,RYN J H,BEUCHAT L R.Effectiveness of disinfectants in killing Enterobacter sakazakii in suspension,dried on the surface of stainless steel,and in a biofilm[J].Applied and Environmental Micro?biology，2007,73(4):1256-1265.

《中國乳品工業(yè)》雜志摘要寫作要求

1摘要寫作要求

按報道性摘要書寫，字數(shù)300字左右，以提供文章內容梗概為目的，不加評論及補充解釋，摘要中應包括研究目的、方法及過程、結果與結論、創(chuàng)新性和創(chuàng)新點。中英文摘要內容應一致。

2摘要寫作注意事項

2.1 著重反映新內容和特別強調的觀點。

2.2 排除在本學科領域已成常識的內容。

2.3 不得簡單地重復題名中已有的信息。

2.4 書寫要合乎語法、保持上下文的邏輯關系。

2.5 結構要嚴謹，表達要簡明，語義要確切，不分段落。

2.6 用第三人稱的寫法。應采用“對……進行了研究”、“報告了……現(xiàn)狀”、“進行了……調查”等記述方法，不要使用“本文”、“作者”等為主語。

2.7 采用規(guī)范化的名詞術語（包括地方、機構名和人名）。

2.8 縮略語、略稱、代號，除了相鄰專業(yè)的讀者也能清楚理解的以外，在首次出現(xiàn)處必須加以說明。

3英文摘要寫作注意事項

3.1 避免在摘要的第一句重復使用題目或題目的一部分。

3.2 用簡潔、明確的語言（一般不超過150個單詞），盡量用短句并避免句型單調。

3.3 描述作者的工作一般用過去時態(tài)，陳述由這些工作所得的結論時用現(xiàn)在時態(tài)。

3.4 盡量用主動語態(tài)代替被動語態(tài)。

3.5 盡量用語義清楚并為人熟知的詞匯，對于大眾熟知的縮寫語可直接使用。

Effects of common disinfectants on the survival of Cronobacter spp.on the surfac?es of different materials

NIU Jie-tinga,PAN Rui-lia,ZHOU Yan-honga,LOU Bin-bina,JIANG Xiaa,ZHAO Si-yua,FEI Penga, MAN Chao-xinb,JIANG Yu-juna,b
(Northeast Agricultural University a.Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science；b.Na?tional Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

5 strains of Cronobacter isolated from PIF and production processing were as the research object in this study.The research was car?ried out to study the effects of common disinfectants on the survival of Cronobacter spp.on the surfaces of stainlesssteel,teflon and glass.The results showed that:when the concentration of the disinfectants in the middle,the log CFU/coupon of Cronobacter on stainless steel surface was more than that on glass surface,there was a significant difference.When the w/v of peracetic acid,chlorine dioxide,hydrogen peroxide was 0.3%,3 000 ppm and 3.5%,respectively,Cronobacter spp.were not detected on the material surfaces.This study provided theoretical basis for the prevention and control,did contribute to select suitable materials to reduce the contamination of Cronobacter in powdered infant for?mula.

Cronobacter；stainless steel；teflon；glass；disinfectants

TS252.1

A

1001-2230（2016）09-0012-04

2016-01-07

國家科技支撐計劃課題（2013BAD18B11）；黑龍江省杰出青年基金項目（JC201415）；黑龍江省科研機構創(chuàng)新能力提升專項計劃項目（YC13D005）。

牛婕婷（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

姜毓君