成強(qiáng)，陳京都，吳紅軍，王龍根

(揚(yáng)州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225101)

超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃代謝物

成強(qiáng)，陳京都*，吳紅軍，王龍根

(揚(yáng)州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225101)

采用超高壓液相色譜-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀優(yōu)化了漁業(yè)養(yǎng)殖水和底泥中4種硝基呋喃代謝物殘留檢測(cè)的方法。確定以2-硝基苯甲醛為衍生劑，樣品經(jīng)60 ℃高溫振蕩衍生4 h，再經(jīng)乙酸乙酯提取，C18色譜柱分離，在正離子反應(yīng)模式下以大氣壓電噴霧源電離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。方法中4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.1 ng/mL(g)，定量限為0.25 ng/mL(g)，在0.25～10 ng/mL(g) 線性范圍良好，0.5、2.0、5.0 ng/mL(g) 3個(gè)添加水平回收率范圍為91.3%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。本方法具有重復(fù)性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確以及快速的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃類藥物殘留的監(jiān)控要求。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2016,6(4):37-43]

硝基呋喃代謝物；液質(zhì)聯(lián)用；養(yǎng)殖環(huán)境；底泥；衍生溫度

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，曾應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，用于治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病、潰瘍病等。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對(duì)人體有致癌、致畸等毒性作用[1]，歐盟已于1995年起禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類藥物[2]；中國(guó)農(nóng)業(yè)部也于2002年12月發(fā)布第235號(hào)公告及2005年10月發(fā)布第560號(hào)公告[3-4]，禁止在飼養(yǎng)過(guò)程中使用硝基呋喃類藥物，硝基呋喃類藥物在動(dòng)物性食品中不得檢出。衛(wèi)生部于2010年3月將硝基呋喃類藥物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入可能違法添加的非食用物質(zhì)黑名單[5]。

硝基呋喃類原藥在生物體內(nèi)代謝迅速，其代謝產(chǎn)物分別為氨基脲(SEM)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)和3-氨基-2-惡唑烷基酮(AOZ)，這些代謝物易與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，故常通過(guò)檢測(cè)其代謝物的含量來(lái)反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況[6-7]。目前關(guān)于硝基呋喃代謝物殘留研究多集中在動(dòng)物可食性組織樣品上[8-13]，常用的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫法(ELISA )和液質(zhì)聯(lián)用法( LC-MS/MS )[14-16]，并已出臺(tái)了相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[17]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，硝基呋喃類藥物的使用多為全池撒播，藥物在養(yǎng)殖環(huán)境中殘留直接影響到水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。然而，目前關(guān)于養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃代謝物殘留分析的研究較少，且其方法較為復(fù)雜或時(shí)間較長(zhǎng)[18-21]。因此，研究快速且準(zhǔn)確檢測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃代謝物殘留檢測(cè)技術(shù)，可以從養(yǎng)殖源頭監(jiān)控其使用情況，為監(jiān)管部門提供有力的技術(shù)支撐。

本研究對(duì)樣品前處理方法、色譜條件以及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期通過(guò)提高衍生溫度、縮短衍生反應(yīng)時(shí)間，來(lái)實(shí)現(xiàn)漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中4種硝基呋喃代謝物的超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

安捷倫1290-6460超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司)，并配有大氣壓電噴霧源(ESI)；恒溫水浴振蕩器(江蘇金城國(guó)勝公司)；氮吹儀(北京萊伯泰科公司)；渦旋振蕩器(IKA 公司)；離心機(jī)(Sigma公司)；電子天平(莆田亞太公司)。

實(shí)驗(yàn)所用的甲醇、乙腈為農(nóng)殘級(jí)；甲酸、乙酸乙酯、二甲亞砜為色譜純級(jí)；乙酸銨、磷酸二氫鉀為優(yōu)級(jí)純；2-硝基苯甲醛為色譜純級(jí)，使用前稱取75.6 mg溶于10 mL二甲亞砜中，現(xiàn)配現(xiàn)用；實(shí)驗(yàn)用水取自Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品包括5-甲基嗎琳-3-氨基-2-惡唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙丙酰脲(AHD)、3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)和氨基脲(SEM)，均為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品，純度≥ 99%。

內(nèi)標(biāo)物包括5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標(biāo)物AMOZ-D5、1-氨基-2-內(nèi)酰脲的同位素內(nèi)標(biāo)物AHD-13C3、3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標(biāo)物AOZ-D4、氨基脲的同位素內(nèi)標(biāo)物SEM-13C-15N2，均為德國(guó)Witega公司產(chǎn)品，純度≥ 99%。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取4種標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，并定容配制成50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冷藏保存，保存期為6個(gè)月。準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成50和5 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋配置成50 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1衍生化

養(yǎng)殖水和底泥預(yù)先除去雜質(zhì)，底泥在陰涼處自然風(fēng)干，磨碎過(guò)20目篩。分別準(zhǔn)確量取10 mL水和稱取2 g底泥加入50 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)物，渦旋1 min。再加入5 mL鹽酸溶液和300 μL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋1 min，充分混合均勻。置于恒溫水浴振蕩器中，避光水浴振蕩，分別設(shè)置37、50、60和80 ℃ 4種水浴溫度，振蕩時(shí)間分別設(shè)置為1、2、4、8和16 h，其中37 ℃下僅設(shè)置振蕩16 h。

1.3.2 提取與凈化

取出離心管冷卻至室溫，加入適量(約8～10 mL)磷酸二氫鉀溶液，混合均勻，調(diào)節(jié)pH至7.0。加入10 mL乙酸乙酯，渦旋2 min后，6 000 r/min離心5 min，取上層乙酸乙酯，然后重復(fù)提取1次，合并上層乙酸乙酯在40 ℃下氮吹至干。使用1 mL初始流動(dòng)相定容，過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

分別準(zhǔn)確移取5 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200 μL于3個(gè)離心管中，分別準(zhǔn)確移取50 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200 μL于3個(gè)離心管中，在這6個(gè)離心管中分別加入50 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL。衍生過(guò)程參照1.3.1進(jìn)行，提取與凈化參照1.3.2進(jìn)行。最后標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度依次為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL。

1.5 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件：實(shí)驗(yàn)所使用色譜柱為安捷倫 Zobax Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm)；流動(dòng)相為乙腈和乙酸銨甲酸溶液，乙酸銨濃度為2 mmoL/L，甲酸含量為0.1%；流動(dòng)相流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1，其中A為水相，B為有機(jī)相。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

Tab.1 Elution process of the separation

時(shí)間Time體積分?jǐn)?shù)/%VolumefractionφAφB0．0090100．7590104．0030704．5010904．5110905．009010

注：A為2 mmoL/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)；B為乙腈。

質(zhì)譜參數(shù)(ESI)：干燥氣溫度(gas temperature)為350 ℃，干燥氣流量(gas flow)為11 mL/min，毛細(xì)管電壓(capillary)為4 000 V，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，具體參數(shù)見(jiàn)表2。

1.6 回收率的測(cè)定

4種硝基呋喃代謝物設(shè)置0.5、2.0、5.0 μL 3個(gè)添加濃度水平，按照1.3進(jìn)行樣品前處理，采用1.5色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積定量，計(jì)算回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了獲得目標(biāo)化合物較高的響應(yīng)值，需要在較高濃度條件下優(yōu)化要測(cè)定的目標(biāo)藥物的質(zhì)譜條件。4種硝基呋喃代謝物采用濃度10 ng/mL的單標(biāo)溶液，37 ℃恒溫振蕩16 h衍生化后進(jìn)行。首先，通過(guò)全掃描模式確定各個(gè)藥物的母離子的質(zhì)荷比，然后通過(guò)子離子掃描確定定量和定性子離子的質(zhì)荷比，根據(jù)確定的母離子和子離子選擇最佳傳輸電壓和碰撞能量，最后再進(jìn)行其他參數(shù)的優(yōu)化。最終確定的最佳質(zhì)譜條件見(jiàn)表2，標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入甲酸不僅可以改善各組分的峰型，還可以提高離子化的效率。因此，本研究所使用的流動(dòng)相為乙腈和乙酸銨甲酸溶液，其中乙酸銨濃度為2 mmoL/L，甲酸含量為0.1%。流動(dòng)相流速過(guò)大會(huì)降低離子化效率，過(guò)低又會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間，且本研究中采用的色譜柱為短柱子，故綜合考慮確定采用0.2 mL/min作為流動(dòng)相的流速。

圖1 硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)譜圖A、B、C、D分別表示AMOZ、SEM、 AHD、 AOZ標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)譜圖。每排左、中、右圖分別表示定量離子質(zhì)譜圖、子離子豐度比和子離子質(zhì)荷比。Fig.1 Mass spectra of nitrofuran metabolites standard working solutionA, B, C, D respectively showed AMOZ, SEM, AHD, AOZ mass spectrogram. The left, middle and right figures in every row respectively showed quantitative ion mass spectra, product ion abundance ratio and ratio product ion mass-to-charge ratio.

表2 4種硝基呋喃代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

Tab.2 Mass spectrometry parameters for four nitrofuran metabolites

化合物母離子子離子傳輸電壓/V碰撞能量/eVCompoundParentionProductionFragmentCollisionenergyAMOZ335291?112810011230AMOZ-D53402961128AHD249134?1121010411222AHD-13C325213412814AOZ236134?11091048026AOZ-D42401341288SEM209192?1121313011222SEM-13C-15N22129211218

注：標(biāo)*的子離子為定量離子。

與液相色譜法相比，超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法不需要目標(biāo)物完全獲得分離，采用表1中流動(dòng)相梯度洗脫條件，雖然不能很好分離目標(biāo)化合物，但是4個(gè)目標(biāo)物的保留時(shí)間均在4 min以內(nèi)(圖2)，如果 4 min 后馬上將流動(dòng)相回復(fù)至初始比例，會(huì)導(dǎo)致樣品中部分雜質(zhì)殘留在色譜柱中，使基線噪音增加、保留時(shí)間重現(xiàn)性變差以及靈敏度降低。因此，本研究在4 min之后繼續(xù)將有機(jī)相的比例提高至90%，然后再將流動(dòng)相比例恢復(fù)至初始比例。采用表1的梯度洗脫條件和0.2 mL/min流動(dòng)相流速，可以在很短時(shí)間內(nèi)就能完成一次樣品的檢測(cè)，節(jié)省了時(shí)間成本，并減少了有機(jī)試劑的使用。

圖2 硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液總離子流圖Fig.2 The TIC of nitrofuranmetabolites standard working solution

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

本研究主要探討了衍生化溫度以及衍生時(shí)間對(duì)硝基呋喃代謝物殘留測(cè)定的影響。選擇37 ℃恒溫振蕩16 h衍生化作為參考，對(duì)另外幾種溫度和時(shí)間的衍生效果進(jìn)行比較(表3)。從結(jié)果可以看出，在相同衍生時(shí)間下，隨著溫度的提高衍生效率提高，但是在80 ℃時(shí)，效率降低，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，60 ℃衍生化的效果最好，因此，選擇60 ℃作為本研究的衍生化溫度。在60 ℃條件下進(jìn)行衍生化，隨著時(shí)間增加，效果提高，但是在4 h后衍生化效果基本保持不變。綜上，本研究采用60 ℃恒溫振蕩4 h作為養(yǎng)殖水和底泥中硝基呋喃代謝物的衍生化條件。

表3 不同衍生溫度和時(shí)間條件下4種硝基呋喃代謝物峰面積

Tab.3 The peak areas of 4 derivative compounds at differernt temperature and time of derivative reactions

n=3

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并加入適量?jī)?nèi)標(biāo)混合溶液，按照上述方法操作，使最終溶液的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，混合內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL。內(nèi)標(biāo)法定量，做線性回歸分析并繪制校準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表4。分別在空白水樣和底泥樣品中添加4種待測(cè)組分，信噪比(S/N)為3時(shí)計(jì)算檢出限 ( LOD )，S/N為10時(shí)計(jì)算定量限 (LOQ)，4種硝基呋喃代謝物的LOD和 LOQ見(jiàn)表4。

2.4.2 回收率和精密度

用不含4種待測(cè)組分的水樣和底泥進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品前處理同1.3 節(jié)。選取0.5、2.0、5.0 ng/mL(g)作為添加量，每個(gè)添加水平進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表 5。從表5可以看出，在3個(gè)添加水平，養(yǎng)殖水中4種硝基呋喃代謝物的回收率范圍為91.3%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.4%～7.5%，底泥中4種硝基呋喃代謝物的回收率范圍為92.3%～101.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.7%～7.6%?？梢钥闯?，該方法可以滿足養(yǎng)殖水和底泥中4種硝基呋喃代謝物殘留的檢測(cè)。

表4 硝基呋喃代謝物檢測(cè)方法的工作曲線、檢出限和定量限

Tab.4 The linear regression equations, LOD and LOQ of the detection method for nitrofuran metabolites

化合物Compound線性方程Linerrange相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficients檢出限/[ng·mL-1(g)-1]LOD定量限/[ng·mL-1(g)-1]LOQAMOZY=1．089194x+0．0059830．99990．10．25SEMY=0．697087x+0．1862990．99750．10．25AHDY=1．919787x-0．0899170．99980．10．25AOZY=0．792944x+0．0127930．99970．10．25

表5 養(yǎng)殖水和底泥中4種硝基呋喃代謝物加標(biāo)回收率和精密度

Tab.5 Recoveries and relative standard deviation of the detection method in water and sediment for four nitrofuran metabolites

n=3

化合物Compound添加濃度/[ng·mL-1(g-1)]Spikedconcentrtion養(yǎng)殖水Water底泥Sediment回收率/%Recovery相對(duì)偏差/%RSD回收率/%Recovery相對(duì)偏差/%RSDAMOZ0．595．33．292．37．62．095．82．993．36．25．099．01．896．23．6SEM0．590．75．692．34．32．092．53．4923．95．095．32．7101．32．7AHD0．596．07．5935．72．095．71．896．23．55．099．3199．33．6AOZ0．591．3793．58．62．0102．22．794．73．75．099．11．496．74．1

3 結(jié)論

本研究建立了超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)養(yǎng)殖水和底泥中4種硝基呋喃代謝物殘留的方法。該方法檢出限為0.1 ng/mL(g)，定量限為0.25 ng/mL(g)，在0.25～10 ng/mL(g) 范圍線性關(guān)系良好，回收率范圍為91.3%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。該方法具有重復(fù)性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖水和底泥中4種硝基呋喃代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量，能夠滿足漁業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境中硝基呋喃類藥物殘留的監(jiān)控要求。

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Determination of nitrofuran metabolites in fisheries environment by ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

CHENG Qiang, CHEN Jingdu*, WU Hongjun, WANG Longgen

(Yangzhou City Agricultural Products Quality Supervision and Inspection Center, Yangzhou 225101, China)

A rapid method based on ultrasound assisted derivatization (UAD) with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was proposed for determination of 4 nitrofuran metabolite residues in fisheries water and sediment. It was determined that 2-nitrobenzaldehyde was used as a derivating agent. The sample was derived after 60 ℃ oscillation for 4 h. It was then extracted by ethylacetate and separated by a C18column. It was confirmed by multiple reaction monitoring (MRM) mode with electrospray ionization source using internal standard method. Under the optimized extraction conditions, the limits of detection (LODs) for the derivatized nitrofuran metabolites were 0.1 ng/mL and the limits of quantification (LOQs ) were 0.25 ng/mL (g). Good linearities were obtained over the range of 0.25～10 ng/mL (g). The satisfactory recoveries for the blank water samples at three spiked levels (0.5, 2.0 and 5.0 ng/mL (g)) ranged from 91.3% to 102.2%, with all relative standard deviations under 10%. The method is proved to be fast and effective for simultaneously qualitative and quantitative inspection of the metabolites of nitrofuran in fisheries environment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(4):37-43]

nitrofuran metabolites; derivatization temperature; fisheries environment; sediment; UPLC-MS/MS

CHEN Jingdu, chenjingdu1985@163.com

2016-01-22；接收日期：2016-03-18

揚(yáng)州市綠揚(yáng)金鳳計(jì)劃資助(揚(yáng)人才辦[2014]5號(hào))

成強(qiáng)(1972-)，男，碩士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品藥物代謝動(dòng)力學(xué)與質(zhì)量安全，614037373@qq.com 通信作者：陳京都，博士，農(nóng)藝師，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)技術(shù)，chenjingdu1985@163.com

S94；O657.63

A

2095-1833(2016)04-0037-07