曹新益，徐慧敏，王司辰，黃 睿，沈 烽，何肖微，余鐘波，趙大勇

(1.河海大學(xué) 水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京 210098)

南京莫愁湖與紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系

曹新益1，2，徐慧敏1，2，王司辰1，2，黃 睿1，2，沈 烽1，2，何肖微1，2，余鐘波1，2，趙大勇1，2

(1.河海大學(xué) 水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué)水文水資源學(xué)院，江蘇 南京 210098)

應(yīng)用16S rRNA基因末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明，莫愁湖和紫霞湖的浮游細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)在夏季和秋季時(shí)最高，在春季和冬季時(shí)最低；紫霞湖冬季浮游細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)顯著大于莫愁湖。非度量多維尺度(NMDS)分析結(jié)果顯示，莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的季節(jié)性變化。Mantel檢驗(yàn)、典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)表明，影響莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最顯著的環(huán)境因子是溫度和pH值，營(yíng)養(yǎng)物對(duì)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響程度取決于湖泊的營(yíng)養(yǎng)水平。為進(jìn)一步研究不同程度富營(yíng)養(yǎng)化水體中的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異提供了幫助。

莫愁湖；紫霞湖；浮游細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；季節(jié)性變化；環(huán)境因子；多元統(tǒng)計(jì)；末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

莫愁湖是南京市一個(gè)重要的景觀類湖泊，近年隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，其生態(tài)環(huán)境遭到破壞，水質(zhì)屬劣Ⅴ類水平[1]，已經(jīng)呈現(xiàn)較為嚴(yán)重的富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)。莫愁湖富營(yíng)養(yǎng)化的主要限制因子為氮[2]，近年來采取底泥疏浚、截污等措施，水質(zhì)有了明顯改善。紫霞湖是位于南京市中山陵風(fēng)景區(qū)的人工蓄水湖泊，外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)給較少，為典型的低緯度貧營(yíng)養(yǎng)型湖泊[2-3]。目前，對(duì)莫愁湖的富營(yíng)養(yǎng)化、真核浮游生物、浮游植物、重金屬污染[2，4-6]和紫霞湖的浮游動(dòng)物、浮游植物、重金屬污染[2，4，7]方面的研究報(bào)道較多，但對(duì)兩湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究較少。

浮游生物作為水體生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)種，是高等水生動(dòng)植物賴以生存的重要物質(zhì)與能量基礎(chǔ)，在生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[8]。浮游細(xì)菌是指浮游生物中的原核生物類群，主要包含古細(xì)菌、自養(yǎng)細(xì)菌和異養(yǎng)細(xì)菌[3]。浮游細(xì)菌對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈基本環(huán)節(jié)的發(fā)展有著決定性作用，浮游細(xì)菌在水體生態(tài)系統(tǒng)中的作用以及影響浮游細(xì)菌的環(huán)境因素受到研究者的廣泛關(guān)注[9]。區(qū)域特點(diǎn)和湖泊水體的營(yíng)養(yǎng)水平均可以影響湖泊浮游細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的組成，導(dǎo)致水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成發(fā)生變化[10]。浮游細(xì)菌數(shù)量多，在污染物降解和氮磷等營(yíng)養(yǎng)物循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用[11]。浮游細(xì)菌受外部環(huán)境的影響非常顯著[12]，因此，浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的改變可以在一定程度上反映該水體環(huán)境狀態(tài)，研究表明浮游細(xì)菌在水質(zhì)調(diào)控中起著重要作用[13-14]，目前對(duì)于浮游細(xì)菌群落在富營(yíng)養(yǎng)化水體中的分布研究取得了很大進(jìn)展[15-16]。

研究表明，水體生態(tài)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)鹽既可通過“上行效應(yīng)”直接對(duì)細(xì)菌群落的組成和分布造成影響[17-19]，也可通過對(duì)水體細(xì)菌捕食者的組成和豐度的擾動(dòng)間接影響水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[20]。目前，越來越多的研究者開始關(guān)注浮游細(xì)菌與環(huán)境因子之間的關(guān)系[21-22]，由于浮游細(xì)菌與環(huán)境因子的關(guān)系較為復(fù)雜，目前大部分研究仍在摸索階段[23]。Haukka等[24]和Wu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在向淡水生態(tài)系統(tǒng)中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后，浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這種變化可能與水體營(yíng)養(yǎng)水平的升高有關(guān)，這表明淡水湖泊的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)可能是影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素。

作為降解者的微生物群落，浮游細(xì)菌個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境變化敏感，其群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性能夠在一定程度上反映水體環(huán)境質(zhì)量狀況[8]，因此，調(diào)查年內(nèi)莫愁湖和紫霞湖中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的變化有助于更好地理解其生態(tài)系統(tǒng)。邊園琦等[3]對(duì)紫霞湖的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，但并未研究紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化；沈烽等[26]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)莫愁湖和紫霞湖的浮游細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，但并未探究浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系；Bai等[16]研究了高原湖泊滇池沉積物細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)沉積物細(xì)菌多樣性的分布存在時(shí)空差異，并且受季節(jié)變化的影響；Ma等[27]研究粵東海水增養(yǎng)殖區(qū)浮游細(xì)菌數(shù)量變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，季節(jié)是影響浮游細(xì)菌數(shù)量的重要因素。季節(jié)變化會(huì)導(dǎo)致湖泊水體溫度、pH值等環(huán)境因子的變化，同時(shí)改變浮游植物光合作用強(qiáng)度，導(dǎo)致水體中有機(jī)物含量變化[28]。因此，研究湖泊浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化、探究導(dǎo)致這種變化的影響因子是必要的。

末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)技術(shù)是一種新興的分子生物學(xué)技術(shù)[29-30]，該技術(shù)不必進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)即可進(jìn)行細(xì)菌群落分析[31]，可以有效地應(yīng)用于微生物群落的對(duì)比分析和微生物多樣性分析[32]。自1997年Liu等[33]應(yīng)用T-RFLP技術(shù)研究微生物的多樣性以來，T-RFLP技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于土壤[34-36]、植物根系[37]、污水處理[38]、湖泊沉積物[39]、淡水水體[40]等方面的研究。

作者應(yīng)用T-RFLP技術(shù)對(duì)南京莫愁湖和紫霞湖一年內(nèi)四個(gè)季節(jié)的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，研究2個(gè)湖泊浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)差異，通過多元統(tǒng)計(jì)方法研究浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系，探討影響莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子，擬為莫愁湖和紫霞湖污染水體的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)，豐富對(duì)城市湖泊水體浮游細(xì)菌多樣性、浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 水樣采集

在2011年1月至2012年1月間，每個(gè)季節(jié)對(duì)莫愁湖和紫霞湖各采集一次水樣，每次采集3～4個(gè)平行樣本，采樣點(diǎn)均勻分布在湖區(qū)內(nèi)。

使用采水器采集距水面0.5 m處的水樣1 000 mL，分裝在滅菌藍(lán)蓋玻璃瓶中(期間現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定水樣的溫度及pH值)，密封，避光保存在4 ℃保溫箱中，盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 理化指標(biāo)分析

1.3 T-RFLP分析

取上述經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾的水樣，參照文獻(xiàn)[39]進(jìn)行DNA提取。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用細(xì)菌通用引物對(duì)27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和926r(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)。PCR反應(yīng)體系和循環(huán)條件參照文獻(xiàn)[41]。擴(kuò)增體系為50 μL，包含 5×PCR buffer 10 μL、0.25 mmol·L-1dNTP、2.5 mmol·L-1鎂離子、0.2 mmol·L-1上下游引物、10 ng DNA模板、2 U Taq酶，加去離子水至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸7 min。4 ℃保存，進(jìn)行下游分析。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后使用核酸片段分析儀(CEQ8000型，Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行T-RFLP分析，分析時(shí)控制堿基長(zhǎng)度介于60～600 bp、相對(duì)豐度超過1%的片段的末端限制性片段，即T-RFs。按T-RFs占各個(gè)樣品的豐度百分比進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再分別計(jì)算每個(gè)樣品浮游細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)(Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù))，以研究水體中浮游細(xì)菌群落的多樣性和均一度。

對(duì)每組樣品的多樣性指數(shù)做anova檢驗(yàn)，用a、b、c、d分別標(biāo)注多樣性指數(shù)有顯著差異的樣品(P<0.05)。

1.4 alpha多樣性指數(shù)分析

采用Shannon(H′)和Simpson指數(shù)(D)進(jìn)行浮游細(xì)菌群落的多樣性評(píng)價(jià)[39]。

(1)

(2)

式中：S為物種總數(shù)；Pi為第i個(gè)峰面積占總面積的比例，即T-RFs的相對(duì)豐度。

1.5 多元統(tǒng)計(jì)分析

利用R語言軟件(R programming language,version 3.2.3)中的Vegan軟件包完成如下分析：非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling,NMDS)分析、典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correlation analysis,CCA)、envfit分析、Mantel及偏Mantel檢驗(yàn)、方差分解分析(variation partitioning analysis,VPA)。其中，NMDS分析用于判定不同樣品間浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，CCA用于研究環(huán)境因子對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，Mantel及偏Mantel檢驗(yàn)用于探究環(huán)境差異與浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的相關(guān)性，VPA用于研究不同環(huán)境因子對(duì)浮游細(xì)菌群落差異的影響程度。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣理化指標(biāo)分析(表1)

表1 莫愁湖和紫霞湖水樣理化指標(biāo)分析

Tab.1 Physicochemical parameters of water samples from Mochou Lake and Zixia Lake

依Thomas標(biāo)準(zhǔn)[40]：“富”級(jí)：無機(jī)氮>1.5 mg·L-1，TP>0.1 mg·L-1；“中-富”級(jí)：無機(jī)氮0.5～1.5 mg·L-1，TP 0.03～0.1 mg·L-1。從表1可以看出，莫愁湖的TN在4個(gè)季節(jié)都達(dá)到了“中-富”級(jí)水平，TP都達(dá)到了“富”級(jí)水平，而紫霞湖的TN在4個(gè)季節(jié)都達(dá)到了“富”級(jí)水平，TP則為“中-富”級(jí)水平；2個(gè)湖泊的TP在夏季明顯升高(分別達(dá)到0.80 mg·L-1和0.10 mg·L-1)，莫愁湖的TP整體上高于紫霞湖；2個(gè)湖泊的TN整體而言比較穩(wěn)定，均在夏季達(dá)到最高值(分別達(dá)到2.37 mg·L-1和4.78 mg·L-1)，紫霞湖的TN整體上高于莫愁湖。這是因?yàn)?，莫愁湖作為景觀湖泊，其主要污染源為生活污水和生活垃圾，污染程度更加嚴(yán)重；紫霞湖作為風(fēng)景區(qū)的人工蓄水湖泊，污染程度相對(duì)較輕。

2.2 alpha多樣性指數(shù)分析

根據(jù)T-RFLP圖譜結(jié)果，分別計(jì)算不同季節(jié)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖中不同的字母標(biāo)注表示2個(gè)組有顯著性差異(P<0.05，anova檢驗(yàn))

從圖1 中Simpson指數(shù)(圖1a、c)可以看出，春季莫愁湖和紫霞湖的浮游細(xì)菌群落的多樣性均要顯著低于其它3個(gè)季節(jié)。Shannon指數(shù)(圖1b、d)顯示，春季莫愁湖的浮游細(xì)菌群落的多樣性要顯著低于夏季和秋季，與冬季無顯著性差異；而紫霞湖浮游細(xì)菌群落多樣性要顯著低于其它3個(gè)季節(jié)，這與沈烽等[26]的研究結(jié)果是一致的。

不同季節(jié)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)對(duì)比如圖2所示。

圖中不同的字母標(biāo)注表示2個(gè)組有顯著性差異(P<0.05，T檢驗(yàn))

從圖2中Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可以看出，莫愁湖和紫霞湖在春季、夏季和秋季的浮游細(xì)菌群落多樣性無顯著性差異，冬季的浮游細(xì)菌群落多樣性有顯著性差異。這個(gè)結(jié)果可能與2個(gè)湖泊不同的營(yíng)養(yǎng)類型有關(guān)[24]。

2.3 不同季節(jié)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

通過計(jì)算樣品間T-RFLP的距離(Bray-Curtis距離)，采用NMDS分析方法探究不同季節(jié)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的可能差異，結(jié)果如圖3所示。

圖中每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣品

圖3 不同季節(jié)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的NMDS分析

Fig.3 NMDS analysis of bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake in four seasons

從圖3a可以看出，莫愁湖春季、冬季和夏秋季的點(diǎn)重疊很小，夏季與秋季的點(diǎn)重疊較大，春季與冬季的點(diǎn)則無重疊，表明莫愁湖夏季、秋季的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，春季、夏秋季和冬季的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有比較顯著的差異。從圖3b可以看出，紫霞湖夏季、秋季和冬季的點(diǎn)相對(duì)接近，春季的點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立，表明紫霞湖夏季、秋季和冬季的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，春季的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其它3個(gè)季節(jié)有較明顯的差異。

2.4 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

2.4.1 CCA

莫愁湖與紫霞湖的數(shù)據(jù)CCA排序前四軸最大值分別為2.94和3.92，為了便于比較，因此均使用單峰模型[26]。使用CCA探究環(huán)境變量對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，其中環(huán)境因子用帶箭頭的直線表示，直線越長(zhǎng)則此環(huán)境因子與浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性越大，直線和排序軸的夾角越小則此環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性越大。如圖4所示。

圖4 莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的典范對(duì)應(yīng)分析

從圖4可看出，莫愁湖的排序軸1軸和2軸分別解釋了11.27%和9.48%的樣本變異，紫霞湖的排序軸1軸和2軸分別解釋了10.66%和7.30%的樣本變異。

2.4.2 envfit分析

使用envfit分析檢驗(yàn)每個(gè)環(huán)境因子的顯著性，結(jié)果如表2所示。

表2 環(huán)境因子的CCA排序軸的相關(guān)性分析

Tab.2 Correlation analysis of CCA ordination axises for environmental factors

注:顯著水平基于1000次置換；***表示P<0.001，極顯著；**表示P<0.01，較顯著；*表示P<0.05，顯著。下表同。

2.4.3 Mantel檢驗(yàn)

使用Mantel檢驗(yàn)分析樣品浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異與環(huán)境變量差異的相關(guān)性。樣品間浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異通過計(jì)算Bray-Curtis距離來確定，樣品間環(huán)境變量差異通過歐氏距離來確定，結(jié)果如表3所示。

表3 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境變量的Mantel檢驗(yàn)

Tab.3 Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

2.4.4 偏Mantel檢驗(yàn)

偏Mantel檢驗(yàn)是控制其它變量，分析一個(gè)變量與另一個(gè)變量的關(guān)系。浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境變量的偏Mantel檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

2.5 討論

(1)通過T-RFLP技術(shù)研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨季節(jié)的變化。alpha多樣性指數(shù)分析表明，不同季節(jié)湖泊浮游細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)是不同的。莫愁湖和紫霞湖的浮游細(xì)菌群落的Simpson指數(shù)在春季最低，而在夏季、秋季和冬季差異不大。這一方面是因?yàn)橄那锛竟?jié)湖泊水體中的大型植物和浮游植物大量繁殖，光合作用產(chǎn)生的大量有機(jī)物為細(xì)菌自由生長(zhǎng)繁殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面是因?yàn)槎杭舅w溫度相對(duì)較低，抑制了細(xì)菌的新陳代謝和生長(zhǎng)增殖速率，而夏秋季則相反[28]。2個(gè)湖泊春季、夏季和秋季的alpha多樣性指數(shù)沒有顯著性差異，紫霞湖冬季alpha多樣性指數(shù)要顯著高于莫愁湖，主要原因可能是：莫愁湖作為景觀湖泊受人類活動(dòng)影響較大，一年四季均有污水排入[6]，導(dǎo)致莫愁湖一年四季均處在較高的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)；紫霞湖作為人工蓄水湖泊受人類活動(dòng)影響較小，1月份是枯水期，紫霞湖在此期間山間外來水流入湖泊較少，菌群未能富集，水體的浮游細(xì)菌多樣性相應(yīng)較高，而4月份處于豐水期，在此期間有大量外來水流入湖泊，菌群富集，水體的浮游細(xì)菌多樣性相應(yīng)降低[42]。劉蘭英等[42]對(duì)福州左海湖的研究，高程等[43]對(duì)北京城區(qū)湖泊浮游細(xì)菌的研究，邢鵬等[44]、秦伯強(qiáng)等[45]和Wu等[25]對(duì)太湖浮游細(xì)菌的研究也得到了類似的結(jié)論。

表4 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境變量的偏Mantel檢驗(yàn)

Tab.4 Partial Mantel test for the bacterioplankton community structure and environmental variables

(2)采用以Bray-Curtis距離為基礎(chǔ)的NMDS分析探究莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨季節(jié)的變化。結(jié)果表明，莫愁湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在夏季和秋季差異不大，而春季、冬季和夏秋季的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，這與沈烽等[26]對(duì)太湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果是一致的；紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在夏季、秋季和冬季差異不大，春季與其它季節(jié)差異較大。

(3)運(yùn)用CCA方法探究莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明，莫愁湖和紫霞湖的溫度、pH值對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均有著極其重要的影響，營(yíng)養(yǎng)物有一定影響但不如前兩者，尤其是對(duì)于紫霞湖的影響。研究表明，浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性與空間[46]、時(shí)間[42-43]、環(huán)境變量(如溫度、pH值和營(yíng)養(yǎng)物)有關(guān)[47]，這與本研究結(jié)果是一致的。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果表明，莫愁湖的溫度差異和pH值差異對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異有著極顯著的影響(P<0.001)，莫愁湖的營(yíng)養(yǎng)物差異的影響顯著(P<0.05)，但紫霞湖的營(yíng)養(yǎng)物差異的影響并不顯著，這可能與2個(gè)湖泊的營(yíng)養(yǎng)水平不同有關(guān)[48]。

研究表明，①在營(yíng)養(yǎng)水平較低的湖泊中，營(yíng)養(yǎng)物會(huì)通過“上行效應(yīng)”直接影響水體浮游細(xì)菌群落的生長(zhǎng)[18-19，49]。②pH值會(huì)顯著影響湖泊水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[49-50]，一方面，不同梯度的pH值會(huì)不同程度地影響各類細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況(包括絕滅、繁衍、種的形成等[51])，從而直接影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性；另一方面，不同的pH值梯度會(huì)不同程度地影響湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的其它環(huán)境因子，從而間接影響水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。③溫度對(duì)水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有選擇作用，是影響湖泊浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子之一[52-54]。

本研究中，各采樣點(diǎn)屬于弱堿性環(huán)境，適合大部分細(xì)菌生長(zhǎng)，同時(shí)也存在一定的pH值梯度，而溫度在一年內(nèi)的變化十分明顯，因此會(huì)對(duì)浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定的選擇性。

(4)T-RFLP技術(shù)具有分析精細(xì)、分析能力強(qiáng)、易于自動(dòng)化、分辨率高和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)[55]，被廣泛應(yīng)用于大范圍長(zhǎng)時(shí)間尺度的微生物群落結(jié)構(gòu)研究[26]。但若不注意其諸多過程中的技術(shù)細(xì)節(jié)，有可能引起分析誤差，導(dǎo)致無法完全準(zhǔn)確地反映環(huán)境樣品中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性信息。因而為了確保分析結(jié)果的真實(shí)可靠，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需采用多個(gè)具有代表性的重復(fù)樣品，使用相同方法重復(fù)提取各樣品總DNA，提高分析結(jié)果的可靠性[56]。

3 結(jié)論

應(yīng)用16S rRNA基因末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)方法研究了南京莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系。結(jié)果表明，莫愁湖和紫霞湖的alpha多樣性指數(shù)在夏季和秋季時(shí)最高，在春季和冬季時(shí)最低；紫霞湖冬季浮游細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)顯著大于莫愁湖。非度量多維尺度(NMDS)分析結(jié)果顯示，莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的季節(jié)性變化。Mantel檢驗(yàn)、典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)表明，影響莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最顯著的環(huán)境因子是溫度和pH值，營(yíng)養(yǎng)物對(duì)莫愁湖和紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響程度取決于湖泊的營(yíng)養(yǎng)水平。為進(jìn)一步研究不同程度富營(yíng)養(yǎng)化水體中的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異提供了幫助。

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Seasonal Variation of Bacterioplankton Community Structure and Its Relationship with Environmental Factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing

CAO Xin-yi1,2,XU Hui-min1,2,WANG Si-chen1,2,HUANG Rui1,2,SHEN Feng1,2,HE Xiao-wei1,2,YU Zhong-bo1,2,ZHAO Da-yong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofHydrology-WaterResourcesandHydraulicEngineering,HohaiUniversity,Nanjing210098,China;2.CollegeofHydrologyandWaterResources,HohaiUniversity,Nanjing210098,China)

Seasonal variation of bacterioplankton community structure and its relationship with environmental factors of Mochou Lake and Zixia Lake in Nanjing were studied by 16S rRNA terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology and multivariate statistical methods.The results showed that,alpha-diversity indexes of bacterioplankton community from Mochou Lake and Zixia Lake were the highest in summer and autumn,and the lowest in spring and winter.The alpha-diversity index of bacterioplankton community from Zixia Lake was significantly greater than that from Mochou Lake in winter.Non-metric multidimensional scaling(NMDS) analysis showed that,bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake had a seasonal variation.Mantel test,canonical correlation analysis(CCA) showed the most significant environmental factors which affected the bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were temperature and pH value.Effects of nutrient on bacterioplankton community structure of Mochou Lake and Zixia Lake were depended on the nutrient levels in lake.Overall,this study provides a help to research difference of bacterioplankton community structure in various eutrophic waters.

Mochou Lake;Zixia Lake;bacterioplankton;community structure;seasonal variation;environme-ntal factor;multivariate statistics;terminal restriction fragment length polymorphism(T-RFLP) technology

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41371098)，水文水資源與水利工程科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)研究經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(20145027312，20155019012)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2015B14214)

2016-07-07

曹新益(1993-)，男，江蘇邳州人，碩士研究生，研究方向：水生態(tài)環(huán)境保護(hù)與修復(fù)，E-mail:76565886@qq.com；通訊作者：趙大勇，教授，E-mail:dyzhao@hhu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.004

曹新益，徐慧敏，王司辰，等.南京莫愁湖與紫霞湖浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(12)：19-26，30.

Q 178.1 X 172

A

1672-5425(2016)12-0019-08