柯彩霞，徐德蛟，閆云君*，徐莉*

1.華中科技大學生命科學與技術學院，湖北武漢430074；2.湖北省孝感市鄒崗中心衛(wèi)生院，湖北孝感432100

生物酶法拆分手性藥物的研究進展

柯彩霞1，徐德蛟2，閆云君1*，徐莉1*

1.華中科技大學生命科學與技術學院，湖北武漢430074；2.湖北省孝感市鄒崗中心衛(wèi)生院，湖北孝感432100

在現有手性藥物的制備過程中，通常使用化學催化、氣相或液相色譜分離純化的方法，而耗能大、花費高、副產物多等是其主要缺點.近年來，生物酶法拆分手性藥物的研究逐漸增多，多類生物酶已被報道具有催化手性拆分的能力，其對不同類底物的應用是目前研究的重點之一.在生物酶法拆分手性藥物的過程中，反應溶劑與?；w是影響對映選擇拆分效率的主要因素；另外，合理應用酶的固定化技術能有效的提高拆分效率，使其具有工業(yè)應用的可能.生物酶法拆分手性藥物因具有副產物少、操作簡便、環(huán)境友好等優(yōu)點而備受關注，有望補充或替換化學法在手性藥物制備中的作用.隨著結構生物學、現代分子生物學的發(fā)展與酶法拆分手性藥物研究的不斷深入，通過對酶分子空間結構與催化機理的分析研究，人工合成具有特定催化功能的酶成為可能，生物酶法拆分手性藥物技術的應用有望得到較大的突破.

酶法拆分；手性藥物；對映選擇性；異構體

1 引言

在自然環(huán)境中，大部分化合物具有同分子式、相互呈鏡象但不能重疊的兩種結構形式，如同人的左右手一樣，這類化合物稱為對映體或旋光異構體，含有手性因素的藥物即為手性藥物.手性藥物的不同對映異構體在藥理活性、代謝過程、代謝速率及毒性等方面往往存在著顯著的差異.多數手性藥物中只有一種對映體具有實際治療作用，而另一種對映體不僅沒有藥效，而且可能抵消部分有效對映體的作用，甚至產生嚴重不良反應或毒性［1］.因此，美國食品與藥物管理局（FDA）發(fā)布了手性藥物的指導原則，要求所有在美國上市的消旋體藥物必須說明其中所含對映體各自的藥理作用、毒性和臨床效果，并對新上市的手性藥物提供5年專賣權，以保證和鼓勵相關藥物的研發(fā)［2］.近年來，中國、日本、歐盟等均發(fā)布過相應的政策規(guī)范手性藥物的生產和應用，這些政府行為和人們對單一手性醫(yī)藥的需求共同促進了光學純單一手性藥物的發(fā)展，使得手性藥物占有的市場份額逐年增加，世界手性藥物銷售以每年15%以上的速度增長.光學純藥品的年增長速率（155%）遠遠高于非光學純藥品的年增長速率（8%），手性藥物市場巨大［3］.

手性藥物的制備經常先進行不對稱合成或拆分化學合成路線中某個手性中間體，再合成單一手性藥物.外消旋體拆分、手性催化合成和底物誘導的手性合成是獲得手性藥物的三種策略［4］，其中外消旋體拆分技術是醫(yī)藥領域研究的重點和熱點之一，化學拆分、色譜拆分、生物酶拆分等是外消旋體拆分技術研究中的常用關鍵技術.而生物酶法與其他方法相比具有催化效率高、規(guī)模易放大、條件溫和、工藝簡單、選擇性好、環(huán)境友好等優(yōu)勢［5］，且能獲得化學合成難以得到的產物，克服或彌補相應的困難和不足，具有很好的發(fā)展前景.

2 生物酶法手性藥物拆分的研究現狀

酶作為一種天然催化劑，在許多應用研究中占據著不可忽視的重要性，酶的應用范圍也在逐步擴大，隨著研究的不斷深入，不論是在生物體系還是非生物體系內，水相或非水相反應當中，酶促反應的應用都有著一定的發(fā)展.而在手性藥物的拆分中，由于大部分藥物的低水溶性，酶的非水相反應效率十分關鍵.在現有的研究當中，已知多種水解酶類，酯酶、脂肪酶、酰胺酶、腈水合酶、酰化酶等均能用于外消旋體的拆分，部分相應研究如表1所示，其中脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）應用較多、效果較好［6］.脂肪酶屬于三酰甘油?；饷福瑏碓簇S富，尤其在微生物中可獲得多種脂肪酶.脂肪酶在水相與非水相中的應用廣泛，且具有反應溫度廣、pH耐受性好以及底物專一性等特點，商業(yè)化脂肪酶絕大多數都是微生物脂肪酶［7］.

表1 不同種類生物酶在外消旋體拆分中的應用Tab.1Applications of different types of enzyme in racemic resolution

由于脂肪酶催化反應多樣、環(huán)境友好、副產物少等特點，脂肪酶在手性藥物拆分的應用日益廣泛，在伯醇、仲醇、叔醇、二元醇、芳香醇等底物的拆分上均有一定的應用［15］.例如Fujimoto等［16］于1986年第一次成功將生物酶法用于非軸對稱的手性化合物拆分，在有機相中，（R）-，（S）-聯萘二丁酸酯的對映選擇ee值分別為96%、94%，整體反應轉化率達50%，近年來，洋蔥伯克霍爾德菌、熒光假單胞菌屬的脂肪酶也被廣泛應用于非軸對稱手性拆分中.而迄今為止，拆分叔醇的應用較少，研究人員認為脂肪酶的活性位點與叔醇結構結合相對困難，導致這一類應用較難開展.Krishna等報道了利用南極假絲酵母Candida antarctica lipase A（CAL-A）以乙酸乙烯酯為?；w對應性拆分叔醇88、89、90、91的工作［17-19］，取得了一定的進展.

3 影響酶法拆分手性藥物效率的主要因素

研究表明，除了選擇適合的生物酶進行手性藥物拆分之外，在反應體系中選擇合適的反應溶劑與酰基供體，是獲得高對映選擇拆分效率的重要因素.

3.1 反應溶劑的影響

反應溶劑的選擇對一個反應的進行有著至關重要的作用，它對底物的溶解度和酶促反應的效率都有著極大的影響，因而在研究當中，不同反應溶劑的比較選擇實驗是最基礎必備的環(huán)節(jié).岳珂［20］在利用解假絲酵母（Candida lipolytica）拆分一苯乙醇的研究中，篩選到二氯甲烷為最適溶劑，將E值從9.5提高到了34.5.李相等［21］用洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶拆分一苯乙醇，通過對13中常用溶劑進行篩選，通過酶活與對映選擇性的綜合考量，選擇正庚烷最為最適的反應溶劑.除此之外，離子液體作為反應溶劑的應用也受到了廣泛研究，Antonia P.等［22］用南極假絲酵母C.antarctica lipase B（CAL-B），以離子液體為反應溶劑拆分一苯乙醇，在最佳反應條件下，經過12 h，反應ee值可達到92%～99%.

3.2 ?；w的影響

在手性拆分的反應過程中，酶與底物的結合效率至關重要，通常認為酶分子先要與酰基供體形成?；?酶復合物，進而發(fā)生轉酯反應，以達到拆分效果.因此，不同的酶在拆分同一反應時，通常所需選擇的最適?；w也不同.例如，在異辛烷為溶劑的體系中拆分外消旋布洛芬，黃霜霜等［23］選用皺褶假絲酵母脂肪酶（C.rugosa lipase，CRL），以11種伯醇，3種仲醇，3種叔醇和1種二醇為底物與外消旋布洛芬反應進行了最適?；w篩選，發(fā)現當使用異辛醇為?；w時，拆分效率最好，ee值超過90%；在使用甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇作為供體時，拆分效率較差，ee值均不到20%.而在郭華穎的研究當中［24］，使用擴展青霉菌TS414拆分布洛芬的過程中，使用正丙醇為供體時拆分效率反而最高，異丙醇最低.一般認為這是由于不同酶的活性中心結構域的空間結構不同，導致不同底物與之結合的能力和效率不一，故在進行生物酶法手性藥物的拆分時，?；w的篩選非常重要.

4 酶的固定化技術對拆分效率的影響

酶的固定化技術是指通過物理和（或）化學的作用，使酶蛋白附著或結合在一定的載體基質上，或限定在有限的空間內.許多酶蛋白在經過固定化后會失活或活性降低，而有一部分酶蛋白仍然具有催化活性，這一類固定化酶通常具有比游離酶更好的穩(wěn)定性，且易于分離與重復使用，能降低工業(yè)成本，在工業(yè)應用上有極大的潛力.利用固定化技術可提高非水相酶促反應的效率，解決游離酶拆分手性藥物效率低、反應時間長的缺陷，為生物酶拆分手性藥物的實際應用奠定了基礎［25-27］.魏曉飛［28］用溶膠-凝膠固定化的枯草桿菌脂肪酶催化拆分2-甲基-1-丁醇，在最佳實驗條件下，立體對性選擇性E值達到13.05，剩余2-甲基-1-醇光學純度可達到97%以上.崔彥君［29］利用磁性高分子材料固定化玫瑰假絲酵母脂肪酶催化酮洛芬酯類，相較于游離酶，該固定化脂肪酶的拆分效率具有顯著的提升，在重復利用5次之內能保持較好的拆分效率.閆云君團隊先后利用大孔樹脂、碳納米管固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶，將其游離酶完全拆分1-苯乙醇所需的時間從48 h分別縮短至了30 min和10 min取得了極為有效的成果［30-31］.酶的固定化技術對酶催化效率的積極影響，使其在生物酶拆分手性藥物研究領域內具有不可忽視的重要性，極大的發(fā)展?jié)摿?

5 展望

手性藥物的制備具有極大的市場潛力，現今市面上的單一對映體手性藥物多通過化學手段制備而成，其中氣相色譜和高效液相色譜法的化學分離法是對應產業(yè)中采用的主要手段，但手性柱費用高、產物易污染、容易產生副產物是其主要的缺陷.相比于化學拆分技術，酶法拆分技術在生產的資本投入方面有較明顯的優(yōu)勢，酶法操作簡便且不易污染，近年來固定化技術在酶的非水相反應效率提升中取得了較顯著的研究進展，如閆云君團隊在手性拆分1-苯乙醇的反應中，制備了一種高催化效率的固定化酶，將非水相轉酯反應時間從幾天縮短到十幾分鐘［30］，展示了脂肪酶在手性拆分反應中的潛力，簡便的反應條件和大大縮短的時間成本使得酶法拆分的產業(yè)化應用具有極大的工業(yè)潛力.近年來，隨著分子生物學與生物信息學研究手段的發(fā)展，酶分子的空間結構與催化機理研究逐步深入，人工合成具有特定催化功能的酶是未來酶促反應研究領域內最具發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较蛑?相信在不久的將來，隨著微生物資源的開發(fā)利用，能夠尋找、開發(fā)得到更多適用于多種基質、具有高度選擇性的酶，使得酶法拆分手性藥物的制備中具有更為廣闊的應用和更加巨大的工業(yè)利用價值.

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本文編輯：張瑞

Advance in Enzymatic Resolution of Chiral Drugs

KE Caixia1，XU Dejiao2，YAN Yunjun1*，XU Li1*
1.School of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China；2.Zougang People's Hospital，Xiaogan 432100，China

Chemical catalysis，gas or liquid chromatography separation and purification are the main technologies in chiral drug preparation，which result in high energy consumption，high cost，and multi-byproducts and so on.Enzymatic resolution in chiral drugs preparation was attracted increasing attention in recent years.Many kinds of enzyme were investigated on their resolution ability towards different substrates，and their application has become a topic subject.It was found that the reaction solvent and acyl donor are the most important factors to enantio selective efficiency.A proper immobilization technology can significantly enhance the enzyme activity and pave the way to industrialization.The enzymatic resolution of chiral drugs could play a key role in chiral pharmacy production with less byproducts，simple operation and environmental frendliness.Based on the rapid progress in structure biology，especially deep understand of enzyme structure and catalytic mechanism，the enzymatic chiral resolution is expected to be made great advances with the development of modern techniques of molecular biology and chiral drug.

enzymatic chiral resolution；chiral drug；enantioselective；isomer

Q93-335

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2016.06.001

1674-2869（2016）06-0517-04

2016-08-06

國家自然科學基金項目（31170078）；國家863課題（2014AA093510）

柯彩霞，碩士研究生.E-mail：kecaixia@hust.edu.cn

*通訊作者：徐莉，博士，副教授.E-mail：xuli@hust.edu.cn

閆云君，博士，教授.E-mail：yanyunjun@hust.edu.cn