劉瑯嬛羅愛武陳科良谷蒙蒙

肖倍倍2鄒士濤3何 超3周俊東3黃 波1

1（南華大學公共衛(wèi)生學院 衡陽 421001）

2（蘇州大學放射醫(yī)學與防護學院 蘇州 215123）

3（南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院 南京 215001）

FOXM1在食管鱗癌中的表達及對其放射敏感性的影響

劉瑯嬛1,2羅愛武1陳科良1谷蒙蒙2

肖倍倍2鄒士濤3何 超3周俊東3黃 波1

1（南華大學公共衛(wèi)生學院 衡陽 421001）

2（蘇州大學放射醫(yī)學與防護學院 蘇州 215123）

3（南京醫(yī)科大學附屬蘇州市立醫(yī)院 南京 215001）

采用Real-time PCR檢測40例食管鱗狀細胞癌及相對應癌旁組織中FOXM1(Forkhead box M1) mRNA表達情況；免疫組織化學方法檢測94例食管鱗狀細胞癌組織中FOXM1蛋白的表達情況，分析其與鱗狀細胞癌臨床病理之間的關系；采用針對FOXM1的siRNA沉默ECA-109、TE-1細胞中FOXM1基因表達水平，通過免疫熒光染色、克隆形成實驗檢測 FOXM1對食管鱗狀細胞癌放射敏感性的影響。結果表明，F(xiàn)OXM1 mRNA表達水平在食管癌組織中顯著高于癌旁組織(p<0.01)，其蛋白表達水平與病人生存期負相關。siRNA能有效干擾ECA-109細胞中的FOXM1表達水平，F(xiàn)OXM1沉默細胞中X-射線誘發(fā)的γH2AX焦點顯著多于對照細胞，F(xiàn)OXM1沉默細胞電離輻射后克隆形成能力顯著低于對照細胞。結果提示，F(xiàn)OXM1在食管鱗癌中的表達增加，其表達水平與病人預后負相關；FOXM1基因沉默可顯著增強細胞放射敏感性，因此，F(xiàn)OXM1有可能成為食管鱗癌的治療靶點。

食管鱗癌，F(xiàn)OXM1不良預后，輻射敏感性，DNA損傷修復

食管鱗癌是世界范圍內發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一[1]。目前，臨床上主要的治療手段為手術切除治療、化學治療和放射治療等[1]。據(jù)統(tǒng)計，70%以上的食管癌患者都會接受放射治療，然而單純放療5年生存率只有10%~30%，腫瘤局部未控率和復發(fā)率達60%~80%[2]。因此，尋找新的反映腫瘤敏感性的分子標志物，并對其機理進行深入研究，對于制定食管鱗癌放射治療策略具有重要意義，同時可開發(fā)放療增敏的新途徑。

FOXM1又稱MMP-2或FKHL-16，其基因由10個外顯子組成，蛋白中翼型螺旋DNA結合域位于第三個外顯子，含有110個氨基酸[3]。FOXM1通過此區(qū)域與多種基因的啟動子結合、調控下游基因轉錄，從而在G1/S、G2/M轉換和有絲分裂進程中發(fā)揮至關重要的作用[4]。另外，F(xiàn)OXM1的靶分子同時參與DNA損傷修復和染色質組裝等重要生命過程，因此，F(xiàn)OXM1蛋白表達水平與細胞電離輻射敏感性密切相關[5]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1在肺癌、乳腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中高表達[6]。為進一步探討FOXM1與食管鱗癌的關系，本研究通過Real-time PCR和免疫組織化學方法檢測FOXM1蛋白在食管鱗癌中的表達情況并分析其與各臨床病理參數(shù)和病人預后之間的關系；同時通過 RNA干擾的方法下調食管癌細胞中的 FOXM1的表達，進一步探討FOXM1對食管鱗癌細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本及細胞

人食管鱗癌組織94例及其中癌旁組織標本40例均取自在2008年12月至2009年12月間在南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院胸外科實施手術的患者，術前均有胃鏡病理確診為“鱗狀細胞癌”，所有患者均在腫瘤切除后進行了預防性放射治療。以上所有患者均簽名同意其組織標本被用于科學研究。94例食管鱗癌患者中，年齡小于60歲54例，大于等于60歲40例。男性75例，女性19例，T1期3例、T2期17例、T3期74例，所有標本均保存于蘇州市立醫(yī)院。人食管鱗癌ECA-109、TE-1細胞由蘇州市立醫(yī)院腫瘤實驗室保存。

1.1.2主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于 HyClone公司；Trizol 購于美國Life Technologies公司反轉錄試劑盒、Real-time PCR 反應試劑盒均購自 Ta Ka Ra 公司；FOXM1-si RNA 片段、陰性對照均由廣州銳博生物科技有限公司合成。兔抗人 FOXM1單克隆抗體購于 Cell Signaling Technology公司；鼠抗人b-actin單克隆抗體購于南通碧云天生物公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗購于南通碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR法檢測組織中 FOXM1基因mRNA表達水平

按照 Trizol試劑盒說明，抽提組織標本的總RNA，用 Thermo Gene company limited NANO DROP2000 Spectrophotometer 測RNA濃度。使用軟件Primer premier 5.0設計引物序列，并由上海捷瑞生物公司合成。PCR引物序列b-actin正向5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’；反向5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’；FOXM1正向5’-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3；反向5’-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3’采用RT-PCR試劑盒進行反轉錄及PCR擴增。PCR反應參數(shù)：預變性95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s；40循環(huán)；融解曲線95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃15 s、60 ℃ 15 s。采用?Ct法計算目的基因的表達值，以b-actin作為內參基因，其中Ct值為基因反應產(chǎn)物的熒光值達到設定域值時所用的反應循環(huán)數(shù)。目的基因相對表達量為2Ct(β-actin)?Ct(目的基因)。

1.2.2免疫組織化學染色

取組織標本，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，微波抗原修復，敷一抗二抗，DAB顯色，蘇木精復染，分化、返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封閉，光鏡下觀察結果。FOXM1陽性信號主要定位于細胞質中，呈現(xiàn)棕黃色，少量位于細胞核，根據(jù)其在細胞質或細胞核的染色程度及染色細胞百分率進行評分：無染色或者陽性率<10%為 0分；>10%的輕度染色或者陽性率 10%~40%的中度染色為1分；>40%的中度染色或者10%~40%強染色為2分；>40%的強染色為3分。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.3細胞培養(yǎng)

ECA-109、TE-1 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內，每 2 d 換液1 次，每 3~4 d傳代1 次，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4Western blot法

提取總蛋白，將提取的總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后，將蛋白移至 PVDF 膜上，以含 5% 脫脂奶粉的 TBST 液封閉 1 h，加入一抗，F(xiàn)OXM1，b-actin 4 ℃ 搖床孵育過夜，加入二抗，室溫孵育 1 h，將 PVDF 膜置于增強化學發(fā)光試劑中反應 1~3 min，于暗室中用 X膠片曝光，顯影、定影，觀察結果。

1.2.5FOXM1si-RNA合成及細胞轉染

轉染前將對數(shù)生長期的ECA-109細胞以3×105個/孔的密度接種在6孔板內，使用含 10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，24 h后轉染。將細胞分FOXM1siNC組、FOXM1siRNA1組、FOXM1RNA2組、FOXM1siRNA3組等4組?；静僮靼凑照f明書進行，雙鏈 siRNA 靶向 FOXM1基因的目的序列為：FOXM1siRNA1正向 5’GGACCACUUUCCCUACUUU dTdT 3’，反向3’ dTdT CCUGGUGAAAGGGAUGAAA 5’；FOXM1siRNA2正向5’ CGGAAAUGCUUGUGAUUCA dTdT 3’，反向3’ dTdT GCCUUUACGAACACUAAGU 5’；實驗組 FOXM1siRNA3 組 正 向 5’CCAGCUGGGAUCAAG AUUA dTdT 3’，反向3’dTdT GGUCGACCCUAGUUCUAAU 5’。24 h 后更換新的完全培養(yǎng)液。轉染后于24 h提細胞RNA 進行 RT-PCR，48 h 提取細胞蛋白進行 Western blot。

1.2.6免疫熒光

利用 X射線室溫下照射處于對數(shù)生長期的FOXM1siNC、FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3共3組ECA-109細胞，劑量為2 Gy。分別于輻照后0、0.5、1、2、8 h共5個時間點收集細胞，用4%的多聚甲醛固定30 min，固定后用PBS輕輕漂洗3次，每次5 min；用1% Triton X-100（PBS稀釋）室溫處理細胞30 min；用含有1% Triton X-100和10%胎牛血清的PBS封閉液封閉細胞30 min；用上述封閉液稀釋FOXM1抗體(1:1000)，4 ℃孵育過夜；PBS輕輕漂洗3次，每次5 min；加熒光二抗室溫孵育1 h。PBS輕輕漂洗3次，每次5 min；DAPI避光孵育5 min，對細胞進行核染，PBS輕輕漂洗3次，每次5 min，洗去多余的DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.7克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的各組細胞制成單細胞懸液，按不同細胞數(shù)接種于6孔板中（0 Gy 200個/孔、2 Gy 800個/孔、4 Gy 2 000個/孔、6 Gy 10 000個/孔、8 Gy 20 000個/孔），每個劑量點設3個平行樣本， 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，接受X線單次劑量照射。每3 d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10~14 d，當培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，甲醇固定20 min后，結晶紫染色20 min，顯微鏡下計數(shù)多于50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率(Plating efficiency, PE)和不同劑量點的細胞存活分數(shù)(Surviving fraction, SF)。

PE=未照射組克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，

SF=照射組克隆數(shù)/（接種細胞數(shù)×PE）。

2 結果

2.1 FOXM1在人食管鱗狀細胞癌組織中的表達

采用Real-time PCR法檢測了40例食管鱗癌組織及相應的癌旁組織中FOXM1 mRNA表達水平。由圖1可見，食管鱗癌組織中FOXM1mRNA相對表達水平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 FOXM1在食管鱗癌組織中的表達及與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關系

采用免疫組織化學方法對 94例食管鱗癌患者組織進行染色，按FOXM1蛋白表達量高低將患者分為 FOXM1蛋白高表達組與低表達組；采用Kaplan-meier法分析食管鱗癌中FOXM1蛋白的表達對患者除瘤術后生存期的影響，結果表明，F(xiàn)OXM1蛋白高表達組患者術后生存期較低表達組更短，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)（見圖2和圖3）。

2.3 siRNA介導的FOXM1基因沉默

設計 3條針對FOXM1基因的 siRNA序列(FOXM1 siRNA1、siRNA2、siRNA 3)，與對照序列(siNC)分別轉染至 ECA-109細胞。48 h后，F(xiàn)OXM1siNC采用Real-time PCR法檢測不同組中FOXM1 mRNA表達水平，由圖4(a)所示，3條不同的針對 FOXM1基因的 siRNA處理細胞后，較FOXM1siNC組分別下降了 72%、83%、84%（圖4(a)）。選擇其中效果較好的兩條序列進一步進行Western blot檢測，結果顯示，轉染siRNA2、siRNA3后ECA-109細胞中FOXM1蛋白表達水平明顯降低（圖4(b)）。

2.4 免疫熒光檢測電離輻射后γH2AX聚焦點動態(tài)變化

當DNA損傷發(fā)生后，損傷位點附件的組蛋白變體H2AX在139位點發(fā)生磷酸化形成γH2AX，因此，γH2AX聚焦點被普遍認為是雙鏈斷裂損傷(Double Strand Breaks, DSBs)分子標志物。從圖5可以看出，在0 ~ 1 h 之間γH2AX焦點逐漸增加，0.5、1 h時間點γH2AX焦點最多，到2 h γH2AX焦點開始降低，至8 h時，焦點繼續(xù)降低，DNA損傷逐步恢復。其中，在0.5、1、2、8 h時間點FOXM1siNC組 中 γH2AX 焦 點 比 FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3組少（圖6），差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。說明在相同的劑量下，在0.5、1、2、8 h時，下調FOXM1基因的食管鱗癌細胞DNA損傷更嚴重。

2.5 沉默F(xiàn)OXM1基因顯著增加食管癌細胞電離輻射敏感性

從圖7可以看出，在2、4、6、8 Gy劑量照射的情況下，F(xiàn)OXM1siNC組的細胞存活分數(shù)顯著高于FOXM1siRNA2、FOXM1siRNA3組，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。說明下調FOXM1的基因表達水平，能顯著增加ECA-109細胞電離輻射敏感性，降低其輻照后的存活能力。

3 討論

FOXM1是FOX轉錄因子家族成員之一，該轉錄因子家族已擁有超過50個以上的成員，分別參與調節(jié)細胞分化、增殖、代謝、凋亡等多種重要的生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在許多腫瘤細胞中高表達，Yang等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1在肺鱗癌細胞中高表達；且其表達量跟細胞分化程度以及良惡性程度相關，F(xiàn)OXM1的表達量高的細胞，多低分化、惡性程度高，易轉移，預后差；FOXM1在大部分乳腺癌中過表達，且表達量跟乳腺癌的病期呈正相關，隨著癌癥的發(fā)展，F(xiàn)OXM1的表達量不斷增高；Yu等[8]發(fā)現(xiàn)FOXM1可以通過反式激活PDGF-A (Platelet-derived growth factor-A)從而激活PDGF/AKT信號通路，而該通路已經(jīng)被證實可以通過在EMT (Epithelial to mesenchymal transition)過程中，阻止腫瘤細胞凋亡從而促進乳腺腫瘤細胞的增殖和轉移。其他的實驗表明，上調FOXM1表達水平能促進肝癌細胞的轉移，增加不良預后[9]。本研究通過對食管鱗癌及癌旁組織檢測發(fā)現(xiàn)FOXM1mRNA表達水平在食管鱗癌組織中更高，進一步證明了FOXM1在食管鱗癌中高表達。通過免疫組織化學結果得出，食管鱗癌組織中FOXM1蛋白的表達水平與患者術后生存期呈負相關性。

電離輻射可以引起不同形式的 DNA損傷，其中DNA雙鏈斷裂損傷是引起細胞死亡的主要原因，細胞對DNA雙鏈斷裂損傷修復能力是決定細胞放射敏感性的主要原因之一。有文獻報道，F(xiàn)OXM1敲除的小鼠胚胎成纖維細胞 (Mouse embryonic fibroblast, MEFs)中，電離輻射后gH2AX焦點較對照組野生型MEFs高[10]。在骨肉瘤U2OS細胞中，下調FOXM1后，同樣能檢測到高水平gH2AX焦點。在真核細胞中，DSB的修復機制主要有兩種，同源重組途徑(Homologous recombination, HR)和非同源末端 連 接途 徑 (Non-homologous end joining, NHEJ)[11]。FOXM1在HR中扮演著非常重要的角色。HR DSB修復蛋白BRIP (BRCA1-associated BACH1 helicase)被確認為是FOXM1直接轉錄的作用靶點，上調BRIP蛋白可以減少細胞的DNA損傷[12]。HR DSB另一重要的修復蛋白RAD51在膠質母細胞瘤中也被認為是FOXM1直接轉錄的作用靶點[13]。除此之外，F(xiàn)OXM1的作用靶基因 CKS1在下調FOXM1的宮頸癌細胞中的表達量也同時下調[14]，而降低CKS1表達后DNA損壞修復蛋白RAD51降低[15]；在U2OS細胞中沉默F(xiàn)OXM1基因，DNA修復相關基因 XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein)、BRCA2 (Breast cancer associate gene2)蛋白表達量也明顯降低[15]；在乳腺癌細胞中沉默F(xiàn)OXM1后，細胞DNA損傷增多，但并未在蛋白和mRNA水平下調XRCC1、BRCA2的表達，表明FOXM1通過調控多種DNA雙鏈斷裂損傷修復蛋白參與DNA修復過程，但其具體修復途徑還需進一步研究。

我們也通過免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)在FOXM1下調的食管癌細胞中 γH2AX 焦點明顯增加；且通過克隆形成實驗也進一步證實了輻照后FOXM1下調后食管鱗癌細胞的增殖能力降低。因此，我們可以猜測FOXM1在食管鱗癌細胞的DNA修復中起到重要作用。因細胞的DNA修復的機制比較復雜，F(xiàn)OXM1在其中發(fā)揮作用的機制還有待進一步研究。

FOXM1基因沉默可顯著增強食管鱗癌細胞的輻射敏感性。細胞輻射敏感性越強，則放療效果越好。放療能對腫瘤進行局部有效控制，有利于控制病灶轉移，還可以擴大手術適應癥，且中晚期食管鱗癌患者術前放療可以提高手術切除率及術后生存率[16]。而術后放療能夠殺滅單純手術治療殘留的腫瘤細胞，以達到控制腫瘤轉移和復發(fā)的目的，最終提高患者的生存[17]。研究所有患者在手術切除之后均進行了預防性放療，那么FOXM1極有可能是通過對放射治療效果的影響，從而影響患者術后生存期的。

綜上所述，在臨床上可通過基因療法對FOXM1進行干預，在行食管癌手術切除術之前，降低患者FOXM1基因表達量，從而增強食管鱗癌對放射的敏感性，達到控制病灶轉移、提高患者術后手術切除率的目的。也可以通過對食管癌病理組織FOXM1蛋白表達量的高低判斷，為食管癌患者術后預防性治療提供相關理論依據(jù)，并可以將其作為判斷預后的一個重要指針，通過加強對高表達患者的術后監(jiān)測，采取相應的措施，提高患者的術后生存期。因此，F(xiàn)OXM1有望成為食管鱗癌的治療靶點。

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Expression of FOXM1 and its effects on radiation sensitivity in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)

LIU Langhuan1,2LUO Aiwu1CHEN Keliang1GU Mengmeng2
XIAO Beibei2ZOU Shitao3HE Chao3ZHOU Jundong3HUANG Bo1
1(School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China)
2(School of Radiation Medicine and Protection, Medical College of Soochow University, Suzhou 215123, China)
3(Nanjing Medical University Affiliated Suzhou Hospital, Suzhou 215001, China)

Real-time PCR was used to examine the expression of FOXM1 (Forkhead box M1) in 40 esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) tissues, and the adjacent normal tissues. Immunohistochemistry was used toexamine the expression of FOXM1 protein in 94 ESCC tissues, and to analyze the relationship between ESCC and clinic pathologic. A small interfering RNA targeting FOXM1 was designed to silence the endogenous FOXM1 expression of ECA-109 and TE-1 cells. The effect of FOXM1 on radiation sensitive in esophageal squamous cell was observed by immunofluorescence stain, and colony formation assay. The results showed that FOXM1 mRNA expression level in esophageal cancer tissues was significantly higher than that of the adjacent tissues (p<0.01), and the protein level expression of it has negative correlation with the survival times; the designed siRNA could dramatically silence FOXM1 expression in ECA-109 cells; γH2AX focus induced by X-rays in FOXM1 silent cells was significantly higher than that in control cells; the clone formation ability of the silent FOXM1 group was significantly lower than that in the control group. The content of FOXM1 is improved in ESCC, and is negatively correlated with the prognosis of patients; the cell radiation sensitive proliferation is significantly improved in the silent FOXM1 ECA-109 cells. In conclusion, FOXM1 has the potential to be the treatment of esophageal squamous carcinoma target.

Esophageal squamous cell carcinoma, FOXM1 poor prognosis, Radiation sensitivity, DNA damage repair

LIU Langhuan (female) was born in May 1987 and graduated from Hunan Normal University Medical College in June 2010. Now she is a master candidate in University of South China majoring in radiation protection agent as a doctor.

PH.D. HUANG Bo, assosiate professer, E-mail: huangbo930@163.com

TL71

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.060202

湖南省自然科學基金項目(2016JJ2115)、南華大學博士啟動基金(2015XQD31)、湖南省衛(wèi)生計生委科研計劃課題項目(C2015-17)資助

劉瑯嬛，女，1987年5月出生，2010年6月畢業(yè)于湖南師范大學醫(yī)學院，現(xiàn)為南華大學在讀碩士研究生，研究方向為輻射防護劑研究，醫(yī)師

黃波，博士，副教授，E-mail: huangbo930@163.com

初稿2016-09-01；修回2016-10-30

Supported by the National Natural Science Foundation of Hunan Province (2016JJ2115), Doctor stand-up foundation of University of South China (2015XQD31), Health and Family Planning Commission Scientific Research of Hunan Province (C2015-17)

Received 1 September 2016; accepted 30 October 2016

CLCTL71