宋 緣劉 敬陳積紅李文建胡 偉劉 璐

1（蘭州大學(xué)藥學(xué)院 蘭州 730000）

2（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）

真菌黑色素輻射防護(hù)作用綜述

宋 緣1,2劉 敬2陳積紅2李文建2胡 偉2劉 璐2

1（蘭州大學(xué)藥學(xué)院 蘭州 730000）

2（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000）

從電子轉(zhuǎn)移和能量傳遞作用、自由基清除作用、金屬螯合作用及光保護(hù)作用等方面總結(jié)了近年來對(duì)真菌黑色素輻射防護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)展。在未來研究中，真菌黑色素二級(jí)結(jié)構(gòu)的確定，能量傳遞作用以及在生物體內(nèi)的輻射防護(hù)作用將成為其研究的突破方向。

黑色素，真菌，輻射防護(hù)

黑色素是一種在自然界廣泛存在的高分子量色素，顏色從深棕色到黑色，主要存在于動(dòng)物、植物及微生物中。人們對(duì)黑色素的關(guān)注是以研究黑色素瘤開始的。20世紀(jì)60年代，人們開啟了對(duì)黑色素瘤內(nèi)科治療系統(tǒng)性的研究，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤對(duì)放療，化療等治療手段具有明顯的抗性[1]，黑色素可能是影響黑色瘤治療效果的原因之一[2]。之后，有學(xué)者研究了大量的黑化以及未被黑化的糞霉菌發(fā)現(xiàn)，黑化菌株和人類疾病息息相關(guān)[3]，同樣，黑化的隱球菌也是人類和動(dòng)物的主要致病菌之一[4]。因此，黑色素雖然不是有機(jī)體生存的必須物質(zhì)，但它能夠顯著增強(qiáng)個(gè)體在極端環(huán)境中的存活能力及競(jìng)爭(zhēng)力，是真菌在高溫、干旱、高濃度鹽和重金屬存在的情況下的重要保護(hù)因素；同時(shí)也是增強(qiáng)真菌致病性的重要因素[5-7]。

近年來，隨著研究的深入，黑色素對(duì)真菌在輻射條件下生存及競(jìng)爭(zhēng)力的重要性受到了關(guān)注。如：黑色真菌能夠污染 1986年切爾諾貝利核事故后含有各種長(zhǎng)壽命放射性核素的4號(hào)反應(yīng)堆[8]；在以色列螺旋谷，紫外輻射強(qiáng)烈的南坡黑曲霉孢子中黑色素含量是陰涼北坡的3倍（南坡日照是北坡的2~8倍）[9]。這些現(xiàn)象都說明真菌黑色素具有保護(hù)真菌免受輻射損傷的功能，使其能在放射環(huán)境中成為優(yōu)勢(shì)種群。目前對(duì)黑色素聚合物的結(jié)構(gòu)沒有確切的研究結(jié)論[10-11]，但對(duì)它的單體機(jī)構(gòu)及生物化學(xué)性質(zhì)已經(jīng)得到了相當(dāng)?shù)难芯拷Y(jié)果。最具應(yīng)用潛力的是它能夠吸收所有波段的電磁輻射，具有一定的輻射防護(hù)功能。將一定量的黑色素納米金粒子注入小鼠體內(nèi)，能夠有效的減輕輻射對(duì)小鼠造血系統(tǒng)及DNA損傷，且不會(huì)產(chǎn)生其他的副作用[12-13]，這一研究結(jié)果暗示黑色素可能是一種極具潛力的輻射防護(hù)劑。本文綜述真菌黑色素的結(jié)構(gòu)以及近年來對(duì)真菌黑色素防護(hù)功能的研究成果。

黑色素屬于一種非晶態(tài)半導(dǎo)體[14-15]。按照合成前體的不同可將黑色素分為多巴黑色素(Dihydroxyphenylalanine melanin, DOPA)，主要源自動(dòng)物、谷氨酰胺酰-3,4-二羥基苯黑色素(Glutaminyl-3,4 -dihydroxybenzene melanin, GDHB)，雙孢子蘑菇、兒茶酚黑色素（Catechol melanin，黑粉菌）、1,8-二羥萘黑色素(1,8-dihy- droxynaphthalene melanin, DHN)，多數(shù)黑色真菌[10]。其中，針對(duì) DOPA黑色素的研究最詳盡，而DHN黑色素則是目前定性最好的真菌黑色素。DOPA黑色素是以二羥基吲哚為單體，經(jīng)聚合形成的高分子復(fù)合物。DHN黑色素則是以1,8-二羥基萘為單體形成的高分子復(fù)合物（圖1）。DOPA黑色素與DHN黑色素在元素組成的差別表現(xiàn)為DHN黑色素不含氮元素，而DOPA黑色素含有氮元素。

各種黑色素在結(jié)構(gòu)上雖然有所差別，但它們的物理化學(xué)性質(zhì)及其對(duì)輻射的響應(yīng)卻具有很強(qiáng)的一致性[17]，均表現(xiàn)出獨(dú)特的物理化學(xué)特性（親水性差、難溶，具有紫外至紅外的全光譜吸收特性，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜等），其對(duì)細(xì)胞防護(hù)作用的研究還處于探索階段?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，在輻射環(huán)境中，黑色素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在4個(gè)方面：(1)電子轉(zhuǎn)移和能量傳遞[8,18-19]；(2)清除電離輻射誘發(fā)的具有細(xì)胞毒作用的自由基[9,20-21]；(3)金屬螯合作用[22-23]；(4)光保護(hù)作用[24-26]。

1 電子轉(zhuǎn)移和能量傳遞作用

在高放射環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的許多真菌，尤其是黑色的真菌，輻射抗性很強(qiáng)，LD10接近或超過1 kGy。Charles[8]以及 Dadachova[19]發(fā)現(xiàn)，某些黑色真菌如從切爾諾貝利反應(yīng)堆中分離的真菌通過加速生長(zhǎng)響應(yīng)電離輻射。因此，他們認(rèn)為黑色真菌能夠利用輻射能量促進(jìn)其自身的生長(zhǎng)代謝。

在 Dadachova[19]的相關(guān)研究中表明，電離輻射改變了黑色素的電子自旋共振信號(hào)，與電子結(jié)構(gòu)的改變一致。生物利用能量一般有如下過程：(1)含葉綠素生物通過光合作用利用太陽能將空氣中的CO2和水合成糖，并釋放出氧氣；(2)糖通過糖酵解途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為能量分子ATP，糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸在轉(zhuǎn)化為乙酰 CoA后經(jīng)檸檬酸循環(huán)途徑氧化生成能量物質(zhì)ATP。其中，檸檬酸循環(huán)和糖酵解除了直接生成少量ATP(或GTP)外，還生成大量的還原型輔酶NADH+H+和FADH2。在線粒體中這些還原型輔酶和輔基進(jìn)入電子傳遞和氧化磷酸化途徑，消耗分子氧，在電子傳遞的同時(shí)將線粒體基質(zhì)中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到膜間隙，形成質(zhì)子梯度，當(dāng)質(zhì)子重新進(jìn)入線粒體基質(zhì)時(shí)驅(qū)動(dòng)ATP合成酶合成ATP。由此可以看出，在生物合成可直接利用的能量分子ATP的過程中，電子傳遞和氧化磷酸化是一個(gè)必不可少的步驟。如果有證據(jù)能夠表明黑色真菌能夠利用輻射能量合成糖或者能夠驅(qū)動(dòng)線粒體內(nèi)的電子傳遞和氧化磷酸化過程，并參與了ATP的生成，則可得出黑色真菌能夠吸收利用輻射能量用于自身生存生長(zhǎng)的結(jié)論。目前沒有直接證據(jù)表明輻射能量參與了這些過程，但是有一些間接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，如受輻射的黑色素與未受輻射黑色素相比，其還原NADH的能力增強(qiáng)4倍，黑化的皮炎瓶霉菌和新型隱球菌比未黑化的細(xì)胞生長(zhǎng)速率具有顯著的提高，代謝活性升高，干重生物量增加，且電離輻射增強(qiáng)了黑化細(xì)胞內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移特性[15]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，輻射條件下黑化細(xì)胞生長(zhǎng)更快并具有更強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移特性，但并不是黑色素參與能量?jī)?chǔ)存與轉(zhuǎn)換的直接證據(jù)。對(duì)于黑色素能否轉(zhuǎn)化輻射能量尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

從分子角度研究，以黑色酵母皮炎芽生菌為模型，用RNA測(cè)序技術(shù)，比較了輻射和未輻射條件下，野生菌株和黑色素缺乏菌株的轉(zhuǎn)錄譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超過3 000個(gè)基因在持續(xù)暴露于低劑量電離輻射發(fā)生差別表達(dá)，且一半在任意方向上發(fā)生至少2倍調(diào)節(jié)。功能分析表明，很多氨基酸和糖類代謝和細(xì)胞周期進(jìn)程的基因被下調(diào)，大量抗氧化基因和影響膜流動(dòng)性的基因在兩個(gè)受輻射細(xì)胞株中上調(diào)，然而，受輻射的野生型中核糖體起源基因上調(diào)，而受輻射的突變體中未發(fā)生，暗示黑色素可能有助于促進(jìn)將輻射能量用于蛋白質(zhì)翻譯[27]。還有實(shí)驗(yàn)利用真菌新型隱球菌暴露在兩個(gè)不同峰值能量(150、320 kVp)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)黑色素調(diào)節(jié)的輻射誘導(dǎo)的增殖增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，黑色素與高能電離光子的直接或間接相互作用是一個(gè)重要的親增殖因素[17]。

以上跡象表明，黑色真菌不僅能夠在高輻射環(huán)境中存活下來，甚至比無黑色素對(duì)照活得更好，但是對(duì)于黑色素能否利用輻射能量用于細(xì)胞生長(zhǎng)，仍需更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。

2 自由基清除作用

除了能量的轉(zhuǎn)移作用外，還有一種觀點(diǎn)認(rèn)為黑色素的輻射防護(hù)作用是通過它淬滅輻射產(chǎn)生的具有細(xì)胞毒作用的短命自由基，防止產(chǎn)生活性氧進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷[9,28]實(shí)現(xiàn)的。

黑色素本身就是一種穩(wěn)定的自由基，不同真菌所含的不同黑色素是由DOPA、鄰苯二酚、GDHB、DHN或含有各種醌、羥基醌和半醌混合物的類似底物經(jīng)氧化聚合形成黑色素聚合物[10]，這種結(jié)構(gòu)決定了黑色素成為一種穩(wěn)定的自由基，能夠吸收由環(huán)境脅迫產(chǎn)生的自由基[29]。當(dāng)輻射作用于細(xì)胞時(shí)，輻射會(huì)直接作用于DNA或者輻解細(xì)胞質(zhì)和溶劑等，產(chǎn)生大量的自由基，從而導(dǎo)致輻射生物學(xué)效應(yīng)。一方面，黑色素通過能量轉(zhuǎn)換作用把輻射和電子能量轉(zhuǎn)換為其自身分子結(jié)構(gòu)中的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)活性（以熱的形式散逸）保護(hù)細(xì)胞不受損傷；另一方面，這種能量吸收和消散的能力充當(dāng)有細(xì)胞毒的自由基水槽的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在γ輻射中，由于γ輻射康普頓反沖電子開啟了自由基鏈反應(yīng)，當(dāng)產(chǎn)生的大量自由基通過黑色素時(shí)高能反沖電子逐步喪失能量，直到它的能量低到被黑色素中的穩(wěn)定自由基所俘獲，逐步降低康普頓電子的能量，控制高能反沖電子的耗散，阻止二次電離和有害自由基的產(chǎn)生[10,19,30]。通過元素分析和高效液相的研究，推斷這種能力可以用黑色素中含有富含p電子寡聚體單位來解釋。

真菌黑色素這種對(duì)自由基的清除作用，提高了真菌在強(qiáng)氧化環(huán)境下的存活率。Wang等[31]研究發(fā)現(xiàn)：在各種自由基存在的環(huán)境下，黑化的新隱形球菌的存活率是未黑化球菌的10倍，稻瘟病菌的黑色素使它免受宿主水稻葉片產(chǎn)生的氧自由基的毒害；而未黑化的稻瘟病菌突變體無病源性且對(duì)氧自由基更敏感[9]。這暗示著黑色素在真菌致病機(jī)制中起重要作用，特別是DOPA黑色素和DHN黑色素能夠淬滅自由基被認(rèn)為是毒力的重要因素[16]。

3 金屬螯合作用

金屬離子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要的作用，但是當(dāng)離子濃度超過了一定的范圍，就會(huì)抑制有關(guān)酶的活性，氧化細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)離子和小分子化合物的外泄，這些傷害可能是與金屬離子在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中產(chǎn)生有害自由基相關(guān)[32-35]。研究發(fā)現(xiàn)：真菌黑色素具有強(qiáng)大的金屬吸附螯合作用[32,36-37]，有些真菌黑色素是銅的高效生物吸收劑，對(duì)銅離子的響應(yīng)使真菌可以產(chǎn)生更多的黑色素；有些真菌黑色素的土壤腐殖質(zhì)能夠使銅和鐵絡(luò)合，在置換金屬離子及它們?cè)谏锵到y(tǒng)中起重要作用；還有一些真菌黑色素也能結(jié)合有毒的錫化合物[35]；黑色素還能與鈣離子發(fā)生螯合作用，與Ca2+結(jié)合的能力保護(hù)黑素細(xì)胞和角蛋白細(xì)胞免于H2O2等活性氧引起的DNA鏈斷裂，調(diào)控體內(nèi)的抗氧化水平[20,38]。黑色素對(duì)金屬的這種螯合作用可能是因?yàn)樗鼘?duì)各種金屬離子存在著一系列潛在的結(jié)合和生物吸附位點(diǎn)，保護(hù)細(xì)胞免于輻射、酶裂解和自由基的傷害。另外，黑色素也可以阻止金屬離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[39]。

黑色素對(duì)金屬螯合作用分情況而定：如果金屬對(duì)有機(jī)體是有毒的，則黑色素可防止它們進(jìn)入細(xì)胞；如果金屬對(duì)細(xì)胞生理是重要的而又在環(huán)境中很少，則黑色素可以富集它們[29]。如Fogarty等[40]發(fā)現(xiàn)在平衡態(tài)，三丁基氯化錫濃度為2.5 mmol/L，著色的和白化的出芽短梗霉分別吸收三丁基氯化錫大約0.9、0.7 mol/mg干重，而提純的胞外黑色素對(duì)三丁基氯化錫的吸收則為22 mol/mg干重且平衡濃度僅為 0.4 mmol/L。生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入黑色素降低了CuSO4和三丁基氯化錫的毒性影響也歸功于黑色素對(duì)金屬的螯合。Robertha等[41]研究發(fā)現(xiàn)，不同前體合成的黑色素對(duì)111In，213Bi，225Ac等放射核素有較強(qiáng)的吸附能力，這項(xiàng)研究結(jié)果啟示我們可以將黑色素應(yīng)用于輻射防護(hù)材料的相關(guān)領(lǐng)域。

4 光保護(hù)作用

真菌黑色素還具有光保護(hù)作用，一般而言，真菌黑色素對(duì)光的吸收范圍包括所有的紫外和可見光，主要是針對(duì)于紫外線的防護(hù)作用[42-43]。與帶電粒子和電離光子等電離輻射不同，紫外線為非電離輻射，不能引起作用物質(zhì)的電離，只能引起分子的振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)和電子能級(jí)的躍遷[44]。在紫外光譜中，UVA幾乎不被DNA直接吸收，但是可以產(chǎn)生活性氧作用于DNA，UVB直接作用于DNA，對(duì)細(xì)胞的損傷較為嚴(yán)重[45]，UVC對(duì)DNA的損傷主要遵循其吸收曲線，其主要損傷包括堿基變換和鍵斷裂[46-50]。

孵育混合液中的黑色素懸液能夠保護(hù)酶類免遭UV失活，這是黑色素保護(hù)作用的直接生理學(xué)作用的解釋[10]；Wang等[50]發(fā)現(xiàn)，在254 nm波長(zhǎng)的照射下，培養(yǎng)8 d的新型隱球菌，有L-DOPA存在的情況下生長(zhǎng)的菌株比沒有L-DOPA在生長(zhǎng)的菌株更加耐受 UV，可能是因?yàn)楹诨募?xì)胞壁阻擋了高能光子，避免細(xì)胞受到損傷；用可見光和UV輻照冬孢子，發(fā)現(xiàn)與白化突變菌株相比，黑化的野生菌株具有更強(qiáng)萌發(fā)抑制抗性[51]；微生物黑色素抗輻射作用的另一個(gè)指示是在切爾諾貝利放射性污染的土壤中微生物組成向黑化種變異，他們同時(shí)發(fā)現(xiàn)來自污染地區(qū)的真菌對(duì)光也有同樣響應(yīng)[9]。

5 展望

真菌黑色素主要通過以上幾種方式發(fā)揮了強(qiáng)大的輻射防護(hù)作用，使其在醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。雖然，對(duì)于黑色素輻射防護(hù)功能的研究尚處于起步階段，受科學(xué)發(fā)展規(guī)律的限制，某些研究，比如黑色素能量傳遞載體的作用，尚有缺陷，但隨著對(duì)真菌黑色素的研究日益深入，相信會(huì)得出更多有說服力的實(shí)驗(yàn)成果。作為黑色素的主要來源之一，真菌具有分布廣泛，經(jīng)濟(jì)易得的優(yōu)點(diǎn)，是從事黑色素研究的最佳材料。

真菌黑色素合成途徑的多樣性有利于實(shí)驗(yàn)者更加全面深入研究探索，但是也增加了結(jié)構(gòu)研究難度。黑色素作為一種潛在的輻射防護(hù)藥物，確定其準(zhǔn)確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，才能更好的研究黑色素在輻射防護(hù)方面作用機(jī)制，充分發(fā)揮真菌黑色素在輻射防護(hù)方面的作用。在今后的研究中，黑色素的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及能量傳遞作用將是可能突破的方向，而其在生物體內(nèi)的輻射防護(hù)作用研究也將為未來開發(fā)成輻射防護(hù)藥物打開思路。

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Progress in fungi melanin radioprotection

SONG Yuan1,2LIU Jing2CHEN Jihong2LI Wenjian2HU Wei2LIU Lu2
1(School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)
2(Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

The progress of fungal melanins’ radioprotection mechanism was summarized in four aspects: electron transfer and energy transmission, radicals scavenging, binding of metals, and photoprotection. The breakthrough in the future research will be focused on the determination of secondary structure, the energy transfer effect, and the radioprotection in organism .

Melanin, Fungi, Radiation protection

SONG Yuan (female) was born in May 1991, and graduated from China Pharmaceutical University in June 2014. Now she is a master candidate in Lanzhou University, majoring in Pharmacy, E-mail: cpulinyao0953425@126.com

Ph.D. LIU Jing, associate professor, E-mail: liuj@impcas.ac.cn; Ph.D. LI Wenjian, Professor, E-mail: wjli@impcas.ac.cn.

TL71，Q691

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.06.01.01

CLCTL71, Q691

“西部之光”一般項(xiàng)目(2011)資助

宋緣，女，1991年5月出生，2014年6月畢業(yè)于中國(guó)藥科大學(xué)，現(xiàn)為蘭州大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)樗帉W(xué)，E-mail: cpulinyao0953425@126.com

劉敬，博士，副研究員，E-mail: liuj@impcas.ac.cn；李文建，博士，研究員，E-mail: wjli@impcas.ac.cn

初稿2016-08-15；修回2016-10-30

Supported by the “Western Light” Foundation (2011)

Received 15 August 2016; accepted 30 October 2016