梁尚華

CHM及PHM病理組織中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表達(dá)差異

梁尚華

目的探討完全性葡萄胎(CHM)和部分性葡萄胎(PHM)病理組織中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表達(dá)差異。方法對醫(yī)院婦科收治63例葡萄胎患者進(jìn)行回顧性分析，其中CHM組患者33例，PHM組30例，采取免疫組織化學(xué)染色法檢測病理組織中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表達(dá)，并與31例正常妊娠婦女做對比，。結(jié)果CHM組和PHM組的p57kip2、p53、CD117及EGFR陽性表達(dá)率分別為(3.03%、93.94%、87.88%、12.12%)和(83.33%、36.67%、63.33%、36.67%)；CD34分?jǐn)?shù)分別為（12.23±2.27）%、（14.45±2.42）%，CHM組與PHM組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CHM組與正常組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），PHM組與正常組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論以免疫組化法檢測葡萄胎病理組織中p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表達(dá)水平，通過其表達(dá)水平高低程度，可有效鑒別CHM與PHM。

完全性葡萄胎；部分性葡萄胎；p57kip2；CD34；p53；CD117；EGFR

葡萄胎是育齡期婦女常見的妊娠滋養(yǎng)層疾病，是細(xì)胞良性病變，可分為完全性葡萄胎(CHM)和部分性葡萄胎(PHM)。其發(fā)生的原因通常為不正常的受精導(dǎo)致，在病理學(xué)中表現(xiàn)為滋養(yǎng)葉細(xì)胞出現(xiàn)不對稱性的增生、絨毛水腫及絨毛間質(zhì)血管減少。通常年齡在20～30歲之間的婦女為高發(fā)人群，約20%左右的CHM可繼發(fā)成為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病，其中2%左右的CHM可發(fā)展為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，而PHM則極低的概率發(fā)展為絨癌[1]。CHM又可分為單親來源和雙親來源的兩種，其中后者沒有正常妊娠的可能[2]。因CHM和PHM的惡變率有著顯著的差異，有必要將兩者準(zhǔn)確的鑒別診斷。在臨床上通過臨床特征、超聲、大致形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)等不同手段對其進(jìn)行診斷，但在疾病早期，CHM及PHM的病理學(xué)特征不明顯，具有隱藏性，所以對兩者的鑒別診斷比較困難。本研究通過采用免疫組織化學(xué)染色法檢測p57kip2、CD34、p53、CD117及 EGFR在 CHM 及PHM的表達(dá)差異，可有效的鑒別CHM和PHM，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2014年3月～2015年3月我院婦科收治的63例葡萄胎患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)首次清宮后，病理檢查確診為葡萄胎。另選擇同期31例正常妊娠婦女為正常組對照。3組一般資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 收集CHM及PHM組患者行子宮或病灶清除后的病變組織，正常組則收集早孕人工流產(chǎn)的絨毛膜細(xì)胞作為標(biāo)本。標(biāo)本新鮮取材，采用常規(guī)酒精梯度脫水，并經(jīng)二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋。

1.2.2 實驗設(shè)備與材料 實驗儀器為：切片機(jī)、電熱恒溫箱、流式細(xì)胞儀、臺式微量高速離心機(jī)、不同規(guī)格的離心管、流式細(xì)胞管、微量加樣器、顯微鏡和尼龍過濾網(wǎng)。實驗試劑為：DBA酶底物顯色試劑盒、二步法抗免疫組化檢測試劑盒、SP染色試劑盒（均為上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、胃蛋白酶、二甲苯、PBS磷酸鹽緩沖液、無水乙醇、兔抗人多克隆抗體（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）、檸檬酸修復(fù)液等。

1.2.3 免疫組化染色方法 （1）組織切片：將石蠟包埋組織在切片機(jī)上連續(xù)切片5～6張，厚度為4～5 μm；（2）脫蠟：在恒溫箱內(nèi)設(shè)定70℃溫度烘烤45 min。加入5 ml二甲苯后緩慢搖晃，5 min后再加入同量二甲苯接著搖晃5 min，分兩次浸泡在低溫的無水乙醇中，每次5 min，無絮狀物浮起即可視為脫蠟干凈。然后依次加入95%、85%及75%乙醇各5 min，蒸餾水洗滌；（3）離心：加入胃蛋白酶制成的胃液消化液(pH 1.5)5 ml進(jìn)行消化處理，放置到37℃恒溫箱內(nèi)20 min，取出后加入生理鹽水立即終止消化，使用尼龍過濾網(wǎng)過濾。濾液倒入離心管，以2000 r/min離心5 min。上清去掉后，加入PBS磷酸鹽緩沖液5 ml進(jìn)行漂洗。然后以600 r/min離心2 min，然后再加入5 ml PBS磷酸鹽緩沖液，如此反復(fù)進(jìn)行5次。加入碘化丙定500 μl，進(jìn)行10 s的混合搖勻，然后進(jìn)行30 min的室溫避光反應(yīng)；（4）組織抗原修復(fù)：將切片浸入1000 ml抗原修復(fù)液(pH 6.0)內(nèi)，置入微波爐中高火檔加熱煮沸10 min，自然冷卻后用PBS磷酸鹽沖洗3次；（5）消除內(nèi)源性過氧化物物活性：使用3%的H2O2溫室孵育15 min，用PBS磷酸鹽沖洗3次；（6）滴加一抗50 μl放入4℃冰箱保鮮層孵育過夜，次日取出用PBS磷酸鹽沖洗3次；然后加入二抗，37℃恒溫箱內(nèi)孵育15 min，用PBS磷酸鹽沖洗3次；（7）顯色：清擦組織周圍多余水分后，加入DAB溶液，放入顯微鏡下觀察，顯色后用自來水洗掉，終止顯色；最后使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，并用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn) 對 p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR免疫組化染色陽性時均呈棕黃色，每張切片在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇9個不重疊視野，每視野計數(shù)100個細(xì)胞。采用半定量評分法，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞比例計分：（1）陽性細(xì)胞比例＜5%，記0分；（2）陽性細(xì)胞比例在5%～25%，記1分；（3）陽性細(xì)胞比例在26%～50%，記2分；（4）陽性細(xì)胞比例在51%～80%，記3分；（5）陽性細(xì)胞比例＞80%，記4分。細(xì)胞著色程度計分：細(xì)胞無色時，記0分；細(xì)胞顯淡黃色時，記1分；細(xì)胞為棕黃色時，記2分；細(xì)胞呈棕褐色時，記3分。兩個分?jǐn)?shù)相加得出總分，以此判斷結(jié)果等級：陰性：得分＜2分；弱陽性：得分為2～3分；陽性：得分為4～5分；強(qiáng)陽性：得分＞5分。采用微血管密度（MVD）計數(shù)法對 CD34進(jìn)行評價，先在100倍顯微鏡下選取組織內(nèi)血管最多的區(qū)域，然后在400倍下，選取5個視野（染色清晰、背景對照良好）計數(shù)微血管數(shù)，取平均值作為MVD反映CD34水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料以例和率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p57kip2和p53在3組中的表達(dá)比較 CHM組的p57kip2陽性率低于PHM組及正常組（P＜0.01），而p53陽性率高于PHM組及正常組（P＜0.01）；PHM組與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 p57kip2和p53在3組中的表達(dá)比較[n（%)］

2.2 CD34、CD117及EGFR在3組中的表達(dá)比較

CHM組的CD34值低于PHM組及正常組 （P＜0.01），CD117陽性率高于PHM組及正常組 （P＜0.05），而EGFR陽性率低于PHM組及正常組（P＜0.01）；PHM組與正常組之間無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05）。見表3。

表3 CD34、CD117及EGFR在3組中的表達(dá)比較

3 討論

3.1 葡萄胎的病因 葡萄胎（HM）是發(fā)生在育齡期婦女的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞上、起源于胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的疾病。其病理學(xué)表現(xiàn)為水腫池的形成、絨毛水腫及滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生，且呈不對稱分布，分為CHM和PHM[3]。相關(guān)研究認(rèn)為，HM由于印跡基因功能缺失而導(dǎo)致。印跡基因分為，（1）父系印跡基因：母方染色體基因印跡失活，而父系染色體基因得到表達(dá)；（2）母系印跡基因：父方染色體印跡失活，而母系染色體基因得到表達(dá)。CHM是僅有兩條父系染色體孤雄的兩倍體；PHM則是一條母系染色體和兩條父系染色體的三倍體[4]。CHM及PHM在病理組織學(xué)形態(tài)上存在諸多相似特征，鑒別診斷比較困難。CHM繼發(fā)成為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的概率較高，而PHM則有極低的概率可發(fā)展為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤[5]。

3.2 p57kip2、CD34、p53、CD117及 EGFR在葡萄胎中的表達(dá)意義 p57kip2是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制基因的一個印跡基因，通過免疫組織化學(xué)染色可將其作為葡萄胎妊娠的輔助鑒別標(biāo)志物[6]。在PHM和正常妊娠的絨毛間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，因母源性等位基因的存在，所以其蛋白呈強(qiáng)性表達(dá)；而在CHM中由于其為純父系來源，缺乏母系的遺傳物質(zhì)，所以，p57kip2在CHM的絨毛膜細(xì)胞內(nèi)缺乏表達(dá)。

今發(fā)現(xiàn)為止，p53是與人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，不僅對細(xì)胞生長進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，還可引起細(xì)胞程序性死亡[7]。p53缺失突變可導(dǎo)致細(xì)胞無限繁殖，從而引發(fā)早期的腫瘤形成。因為CHM可繼發(fā)成為妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的概率較高，所以，p53也可以作為區(qū)分CHM和PHM的標(biāo)記。

EGFR即血管內(nèi)皮生長因子，又稱血管調(diào)理素，其可以增加血管通透性，可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖速度及誘導(dǎo)血管形成等調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞作用[8]。其參與對子宮內(nèi)膜的浸潤，從而引發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞疾病。

CD34屬于鈣黏蛋白家族成員，其參與細(xì)胞活化過程和細(xì)胞的增殖與分化，是炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及腫瘤轉(zhuǎn)移等生理病理過程的分子基礎(chǔ)[9]。CD117是免疫球蛋白家族成員，當(dāng)其在CHM中異常表達(dá)后，其激活和活化永無停止，且不再受調(diào)節(jié)，導(dǎo)致自動磷酸化，促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞異常增殖與凋亡抑制，最終形成妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤[10]。

綜上所述，檢測葡萄胎病理組織中 p57kip2、CD34、p53、CD117及EGFR的表達(dá)水平，通過其表達(dá)水平高低程度，可有效鑒別CHM與PHM。

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Expression difference of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in CHM and PHM pathological tissues

Liang Shanghua Department of Pathology,Beijing Di'an Clinical Laboratory Co.,Ltd.,Beijing,102600,China

Objective To explore the expression difference of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in complete hydatidiform mole(CHM)and partial hydatidiform mole(PHM)pathological tissues.MethodsA total of 63 hydatidiform mole patients admitted to the Department of Gynaecology of our hospital were retrospectively analyzed and divided into the CHM group(n=33)and the PHM group(n=30).Immunohistochemical staining method was used to detect the expression of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in pathological tissues.The results were compared with those in 31 normal pregnant women.ResultsThe positive expression rate of p57kip2,p53,CD117 and EGFR in the CHM group and the PHM group were(3.03%,93.94%,87.88%and 12.12%)and(83.33%, 36.67%,63.33%and 36.67%)respectively;the percentages of CD34 were(12.23±2.27)%and(14.45±2.42)%respectively.The difference between thee CHM group and the PHM group was significant(P＜0.05).The difference between the CHM group and the normal group was significant,too (P＜0.05).There was no significant difference between the PHM group and the normal group(P＞0.05).ConclusionThe expression levels of p57kip2,CD34,p53,CD117 and EGFR in HM pathological tissues are detected by immunohistochemical method;and the expression levels may be used to effectively distinguish CHM and PHM.

CHM;PHM;p57kip2;CD34;CD117;p53;EGFR

R 714.2

A

1004-0188（2016）12-1425-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.021

2016-06-20）

102600北京，北京迪安臨床檢驗所有限公司病理科

梁尚華，E-mail：1445034065@qq.com