周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華

骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞

周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華

目的體外培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)，并觀察其成脂肪細(xì)胞分化能力。方法無(wú)菌取SD大鼠骨髓制作細(xì)胞懸液，差速貼壁法培養(yǎng)第三次貼壁細(xì)胞，傳代擴(kuò)增，取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞分析檢測(cè)CD34、CD44、CD45、CD90、CD144 (VE-cadherin)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(KDR)表達(dá)；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit檢測(cè)細(xì)胞成脂肪分化能力。結(jié)果通過(guò)差速貼壁法可獲得相對(duì)單一的BMNCs，流式細(xì)胞分析表明培養(yǎng)的BMNCs細(xì)胞表達(dá)CD34、CD44、CD45及CD90等表面標(biāo)志，但不表達(dá)CD144和KDR；在未經(jīng)誘導(dǎo)的情況下，培養(yǎng)的BMNCs能自發(fā)分化為脂肪細(xì)胞；培養(yǎng)BMNCs成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后在第3、5、7 d，成脂率分別為（22.4±3.8）%、（55.6±11.4）%以及（82.4±17.7）%，顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)第1 d[（1.3±1.1）%，P＜0.01]。結(jié)論骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)后可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。

骨髓單個(gè)核細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；脂肪細(xì)胞分化

人脂肪細(xì)胞在整個(gè)成年期都存在更新?lián)Q代，具有脂肪分化潛能的干、祖細(xì)胞的持續(xù)性供應(yīng)對(duì)于維持脂肪生成極其重要。最新研究表明，骨髓源性干細(xì)胞（BBSCs）可參與脂肪生成。對(duì)于一般患者，BSCs對(duì)皮下脂肪細(xì)胞的貢獻(xiàn)率大約占10%，對(duì)于肥胖患者則可高達(dá)25%，證明至少在骨髓移植患者，骨髓可以被認(rèn)為是脂肪前體細(xì)胞的儲(chǔ)存庫(kù)[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）可向脂肪細(xì)胞分化，然而其向脂肪細(xì)胞分化能力并不一致，甚至有文獻(xiàn)報(bào)道人原代培養(yǎng)的BMSC在體外誘導(dǎo)時(shí)，絕大部分細(xì)胞并不能分化為脂肪細(xì)胞[2]，因此，除了BMSCs外，骨髓內(nèi)其他細(xì)胞極可能也具有脂肪細(xì)胞分化潛能。本實(shí)驗(yàn)利用差速貼壁法獲得相對(duì)單一的骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMNCs），經(jīng)體外培養(yǎng)后研究其成脂肪細(xì)胞分化能力，以期為脂肪生成和脂肪組織再生研究提供理論和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002]提供的1～2月齡雄性SD大鼠。DMEM/F12干粉培養(yǎng)基 （Hyclone公司），STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清（PAA公司），內(nèi)皮生長(zhǎng)因子添加劑（ECGs,Millipore），內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基 -2（EBM-2，Lonza），4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma），CO2培養(yǎng)箱 （Harris公司），流式細(xì)胞分析儀(FACScan, Becton Dickinson)，倒置熒光相差顯微鏡(Leica)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 脫臼處死1～2月齡雄性SD大鼠，無(wú)菌取髓制作細(xì)胞懸液，EBM-2培養(yǎng)基差速貼壁法培養(yǎng)第三次貼壁細(xì)胞，傳代擴(kuò)增，取3～5代（P3）細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞分析 取P3細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，與相應(yīng)抗體混合，4℃孵育45 min，加入冷PBS 1 ml，洗滌2次，再加入冷PBS 500 μl，混勻，放入流式管中，4℃避光保存。對(duì)非直接熒光標(biāo)記抗體，用冷PBS稀釋第一抗體，4℃孵育1.5 h，離心棄上清；加入第二抗體，4℃孵育避光30 min，將細(xì)胞重新懸浮于500 μl PBS中混勻，放入流式管中，4℃避光保存，用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.2.3 成脂肪細(xì)胞分化 收集P4細(xì)胞，接種到12孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞100%甚至過(guò)度融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入成脂肪分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定，加入油紅O染色。為進(jìn)行細(xì)胞成脂肪細(xì)胞百分率計(jì)算，采用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，計(jì)算公式為：脂肪細(xì)胞百分率=（油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù))× 100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMNCs的體外培養(yǎng)及生長(zhǎng)特征 由于骨髓內(nèi)不同細(xì)胞的貼壁時(shí)間和營(yíng)養(yǎng)要求不同，因此，通過(guò)差速貼壁可以達(dá)到初步純化細(xì)胞的目的。應(yīng)用DMEM/F12和EBM-2培養(yǎng)基分別培養(yǎng)第一次貼壁細(xì)胞（FACs)、第二次貼壁細(xì)胞（SACs）和第三次貼壁細(xì)胞（TACs），48 h后觀察培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)，EBM-2培養(yǎng)的PACs（圖1A）密度明顯高于DMEM/F12培養(yǎng)組(圖1D)；DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的SACs見(jiàn)有少量形態(tài)已發(fā)生改變的細(xì)胞生長(zhǎng)(圖1E)，而EBM-2培養(yǎng)組可見(jiàn)少量梭形細(xì)胞和大量形態(tài)尚未發(fā)生改變的細(xì)胞(圖1B)；對(duì)于TACs，EBM-2培養(yǎng)可見(jiàn)大量形態(tài)未發(fā)生改變的貼壁細(xì)胞 (圖1C)，DMEM/F12組幾乎未見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞(圖1F)。TACs培養(yǎng)4～6 d(圖1G和H)，大量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，主要呈長(zhǎng)三角形或“海蝦樣”形狀，至約第10 d，細(xì)胞呈融合生長(zhǎng)狀態(tài)（圖1I)。

圖1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及生長(zhǎng)特征

2.2 培養(yǎng)BMNCs表面標(biāo)志表達(dá)分析 流式細(xì)胞分析表明，培養(yǎng)的BMNCs細(xì)胞CD34表達(dá)率為（86.6±6.7）%，CD44為（92.1±7.9）%，CD45為（88.4± 3.6）%，CD9為（81.3±7.8）%，幾乎不表達(dá)CD144(VE-cadherin)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR-2）(也稱(chēng)KDR）（圖2）。

2.3 BMNCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化 在未經(jīng)誘導(dǎo)的情況下，BMNCs原代培養(yǎng)第4 d，發(fā)現(xiàn)少數(shù)培養(yǎng)的BMNCs疑似自發(fā)分化為脂肪細(xì)胞（圖3A和B）。在成脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)的條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)第1 d，有少量脂肪細(xì)胞出現(xiàn)，在第3、5、7 d，BMNCs成脂率分別為（22.4±3.8）%、（55.6±11.4）%以及（82.4±17.7）%，顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)第1 d（P＜0.01）。

圖2 細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)的流式細(xì)胞分析

圖3 培養(yǎng)的BMNCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

3 討論

脂肪組織在人能量平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而成熟脂肪細(xì)胞不能通過(guò)有絲分裂增殖，增生是通過(guò)脂肪細(xì)胞前體細(xì)胞以及干、祖細(xì)胞分化得以實(shí)現(xiàn)[3]。既往研究顯示，BMSCs、脂肪干細(xì)胞以及一些脂肪前體細(xì)胞可分化為脂肪細(xì)胞，但是其能力并不一致。有文獻(xiàn)報(bào)道，人原代培養(yǎng)的BMSC在體外誘導(dǎo)時(shí)，絕大部分細(xì)胞并不能分化為脂肪細(xì)胞[2]，如果BMSCs并不是骨髓脂肪細(xì)胞的主要來(lái)源，那么骨髓內(nèi)就還存在其他可以分化為脂肪細(xì)胞的干、祖或前體脂肪細(xì)胞。

正常情況下骨髓內(nèi)含有BMSCs、造血干細(xì)胞（HSCs）、內(nèi)皮細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞，采用差速貼壁法培養(yǎng)全骨髓，可獲得相對(duì)單一的 BMNCs[4]。EBM-2培養(yǎng)基可促進(jìn)多種細(xì)胞生長(zhǎng)；ECGs適合于低血清或無(wú)血清條件下刺激內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）等細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DMEM/F12和EBM-2培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PACs、SACs、TACs，DMEM/F12培養(yǎng)的TACs基本上無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)，而EBM-2培養(yǎng)下見(jiàn)大量細(xì)胞生長(zhǎng)，表明TACs基本上排除了BMSCs、成纖維細(xì)胞等早期貼壁細(xì)胞的污染，獲得了相對(duì)單一的BMNCs。流式細(xì)胞分析表明，BMNCs表達(dá)CD34、CD44、CD45以及CD90等表面標(biāo)志，這與文獻(xiàn)報(bào)道的MSCs表面標(biāo)志表達(dá)有明顯區(qū)別，MSCs未見(jiàn)有CD34、CD45表達(dá)[6]，而本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的BMNCs CD34表達(dá)率高達(dá)（86.6±6.7）%。骨髓中，CD34是HSCs的主要標(biāo)志，表明培養(yǎng)的BMNCs應(yīng)由HSCs分化而來(lái)；CD45為典型的淋巴細(xì)胞標(biāo)志，培養(yǎng)細(xì)胞CD45表達(dá)率為（88.4±3.6）%，提示BMNCs可能具有重要免疫學(xué)特性。由于文獻(xiàn)中常用EBM-2培養(yǎng)EPC，但是培養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)VE-cadherin和KDR這兩種比較典型的EPCs標(biāo)志，表明該細(xì)胞和EPCs一樣來(lái)源于HSCs，但是具有不完全一樣的生物學(xué)特性。即使在未經(jīng)誘導(dǎo)情況下，BMNCs原代培養(yǎng)第4 d，也可以發(fā)現(xiàn)少數(shù)BMNCs疑似自發(fā)分化為脂肪細(xì)胞。成脂肪分化實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)后第7 d，成脂率高達(dá)（82.4±17.7）%，表明培養(yǎng)的BMNCs具有較高的成脂肪細(xì)胞分化能力。

目前關(guān)于脂肪分化的文獻(xiàn)多數(shù)聚焦于BMSCs、脂肪干細(xì)胞等的脂肪分化研究[7]，鮮見(jiàn)有對(duì)骨髓源性的其他類(lèi)型細(xì)胞脂肪分化的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓源性BMNCs可以分化為脂肪細(xì)胞，表明骨髓脂肪細(xì)胞除BMSCs外，尚存在其他重要來(lái)源，而且與MSCs的脂肪分化能力相比，BMNCs可能較BMSCs在脂肪增生中發(fā)揮更為主導(dǎo)的作用[2]，這為脂肪組織更新和增生的深入研究提供了部分新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，獲得的細(xì)胞具有極強(qiáng)的增殖和脂肪分化能力，并且可以傳代培養(yǎng)，因此，可能為脂肪分化相關(guān)研究提供一種較好的細(xì)胞模型。

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Differentiation of BMNCs cultivated in vitro into fat cells

Zhou Fang1,2,Wang Jinxiang1,Li Zi'an1,Liu Jufen1,Bai Yingying1,2,Yang Jianyong1,Zhu Guangxu1,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;2.Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the capacity of in vitro cultured bone marrow mononuclear cells(BMNCs)to differentiate into fat cells.MethodsThe bone marrow of SD rats was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension.The third adherent cells were cultivated by differential adhesion method for passage and amplification.Passage three (P3)-passage five (P5)of the third adherent cells were used in the experiments.The expressions of CD34,CD44,CD45,CD90,CD144(VE-cadherin)and the vascular endothelial growth factor receptor-2(KDR)were detected by flow cytometry;the capacity of cells to differentiate into fat cells was detected by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.ResultsRelatively homogeneous BMNCs were obtained by differential adhesion method.Flow cytometry indicated that the cultured BMNCs cells expressed CD34,CD44,CD45 and CD90 while did not express CD144 and KDR.Even in the absence of adipocyte differentiation induction,the cultured BMNCs might be spontaneously differentiated into fat cells.On the 3rd,5th and 7th day since BMNCs were induced to fat cells,the fat cell percentages were(22.4± 3.8)%,(55.6±11.4)%and(82.4±17.7)%respectively,which were all significantly higher than that on the first day of induction culture [(1.3±1.1)%,P＜0.01].ConclusionBMNCs cultivated in vitro may be differentiated into fat cells.

BMNC;MSC;fat cell differentiation

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1382-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.009

2016-06-27）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81170316）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B00）；云南省科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（20140810）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心,干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（周 芳，王金祥，李自安，劉菊芬，白盈盈，楊建勇，朱光旭，潘興華）；昆明醫(yī)科大學(xué)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院（周 芳，白盈盈）

朱光旭：E-mail:zhguxu@aliyun.com;潘興華：E-mail: panxinghua@aliyun.com