劉維維 葉昱輝 胡 君 聶素萍 何 慧

大豆分離蛋白及7S、11S蛋白對(duì)肝臟的保護(hù)作用

劉維維 葉昱輝 胡 君 聶素萍 何 慧

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院；環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

為探究大豆蛋白是否具有保肝作用，采用昆明種雄性小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，建立四氯化碳急性肝損傷模型，通過(guò)灌胃方式1次／d給予不同組別小鼠不同劑量、不同成分（大豆分離蛋白SPI、11S、7S）的蛋白（300、500、700 mg／kg），并設(shè)一組大豆蛋白飼料組（SPI占比為20%），持續(xù)15 d，于末次給藥后注射CCl4油溶液（10 mL／kg，0.15%）。通過(guò)測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力，肝臟中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力及肝臟指數(shù)評(píng)價(jià)保肝效果。結(jié)果顯示，每天攝入700 mg／kg的SPI對(duì)由四氯化碳致肝損傷鼠有顯著的保護(hù)作用；與模型組相比，700 mg／kg的7S蛋白能顯著抑制由四氯化碳引起的血清中ALT、AST活力升高和小鼠肝臟中MDA含量的升高，并能顯著提高其肝臟中的GSH含量、GSH-Px活力（P＜0.05）。大豆蛋白可抵御CCl4致化學(xué)性肝損傷，其中的7S蛋白是主要的保肝活性成分。

大豆分離蛋白 7S蛋白 11S蛋白 四氯化碳 保肝作用

大豆蛋白是含有人體8種必需氨基酸的全價(jià)植物蛋白，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可與牛奶相媲美。食用大豆蛋白可以彌補(bǔ)攝入動(dòng)物蛋白時(shí)伴隨的膽固醇升高和谷物攝入時(shí)的氨基酸不平衡的缺陷。1999年，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）發(fā)布了大豆蛋白的健康聲明，即“每天食用25 g大豆蛋白能夠降低心臟病、心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)”。然而，目前我國(guó)居民豆類蛋白攝入量較少，特別是大豆蛋白的攝入量?jī)H為5%，遠(yuǎn)低于推薦量的20%［1］。我國(guó)大豆主要用于生產(chǎn)豆油，其下腳料豆粕富含蛋白質(zhì)，如何使其中的蛋白質(zhì)得到高值化利用，具有重要意義。

近年來(lái)，脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌的發(fā)病率不斷上升，肝癌發(fā)病率僅次于肺癌、消化道癌，位居第3位。肝臟素有人體的“生命塔”之稱，是人體重要的免疫器官，人體的各種代謝解毒、免疫功能都需要肝臟承擔(dān)。因此，尋求高活性保肝藥物具有重要意義。目前我國(guó)已研制開發(fā)的對(duì)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用的保健食品已有二十余種，可按來(lái)源分為4類：由中草藥或其提取物研制如靈芝多糖、大豆皂苷、枸杞等；公認(rèn)的具有抗氧化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如?；撬帷⑽?、維生素E等；一些特殊動(dòng)物如牡蠣、螞蟻、甲魚等；特殊的生物因子如胎盤因子、多肽等［2］。但這些成分原料來(lái)源有限或含量較低，又比如生物活性肽常常有苦味，將其作為日常飲食中的起到保肝作用的成分尚具有一定難度。有文獻(xiàn)報(bào)道，將大鼠飲食中的酪蛋白替換為大豆分離蛋白（SPI）后，可顯著降低酒精對(duì)肝臟的損害程度［3］。本研究采用四氯化碳致小鼠化學(xué)性急性肝損傷模型研究大豆蛋白的保肝作用，并考察大豆蛋白中7S、11S對(duì)保肝作用的貢獻(xiàn)，這方面的研究目前鮮見報(bào)道；本研究旨在揭示大豆蛋白中具有保肝作用的活性因子，為后續(xù)開發(fā)蛋白類保肝食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 主要試劑及原料

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.48%）：山東萬(wàn)得福實(shí)業(yè)集團(tuán)；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；四氯化碳（CCl4）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、過(guò)硫酸銨（AP）、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250、TEMED等；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器

PB-10 sartorius標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)：德國(guó)賽多利斯股份公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TDL-5A離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀：海能儀器股份有限公司；Multiskan Go全波長(zhǎng)讀數(shù)儀：Thermo scientific；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.1.3 溶液配制

PBS 浸提液：0.02 mol／L NaH2PO4，0.02 mol／L NaH2PO4，pH8.0。

分離膠緩沖液：18.17 gTris，0.4 gSDS 雙蒸水溶解，調(diào)pH 至8.8，定容至100 mL。

濃縮膠緩沖液：6.06 gTris，0.4 gSDS 雙蒸水溶解，調(diào)pH 至6.8，定容至100 mL。

Acr／Bis貯備液：30 gAcr，0.8 gBis 雙蒸水溶解定容至100 mL。

樣品緩沖液：雙蒸水4 mL，0.5 mol／L Tris-HCl（pH 6.8）緩沖液1.0 mL，甘油0.8 mL，10%SDS 1.6 mL，巰基乙醇0.4 mL，0.1% 溴酚藍(lán)0.2 mL，總體積8 mL，4 ℃保存。

染色液：1 g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于250 mL甲醇及100 mL冰醋酸，溶解后定容至1 000 mL。

脫色液：10%醋酸。

1.2 方法

1.2.1 大豆分離蛋白中11S、7S的提取分離

參考大豆蛋白分離相關(guān)文獻(xiàn)［4-6］，采用堿溶酸沉法對(duì)大豆分離蛋白中的11S，7S進(jìn)行提取分離。主要步驟如下：將SPI與配置好的pH 8的PBS以1∶16（m／V）攪拌混勻，45℃浸提40 min，3 500 r／min 離心10 min，取上清，1 mol／L HCl調(diào)pH 至6.4，4℃冷沉12 h，3 500 r／min 離心10 min，沉淀即為11S。上清用1 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH 至5.25，3 500 r／min 離心10 min，棄沉淀取上清，1 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH 至4.8，3 500 r／min離心10 min，此時(shí)所得沉淀即為7S蛋白。采用SDS-PAGE 測(cè)定所得11S、7S 蛋白純度［7］。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)采用清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，體重（20±2）g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0005。

1.2.2.1 大豆分離蛋白保肝作用

小鼠經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將70只體重（20±2）g的昆明雄性小鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照（水飛薊素）組、灌胃蛋白組、大豆蛋白飼料組（飼料中蛋白質(zhì)全為SPI，占飼料比例為20%）。所有組均飲用自來(lái)水，除大豆蛋白飼料組外，其他均采用普通飼料飼養(yǎng)。灌胃量為10 mL／kg bw，正常組及模型組給予生理鹽水（0.9%），陽(yáng)性對(duì)照組按每日50 mg／kg bw灌胃水飛薊素水溶液，給蛋白組中低、中、高劑量組分別按每日300、500、700 mg／kg bw灌胃大豆分離蛋白水溶液。連續(xù)給藥15 d，于末次給藥后2 h，正常組腹腔注射橄欖油，其余各組均腹腔注射0.15%CCl4橄欖油溶液，注射量均為10 mL／kg，注射后禁食不禁水，16 h后處死動(dòng)物，取血液和肝臟，供后續(xù)試驗(yàn)用。

1.2.2.2 大豆分離蛋白中11S、7S 保肝作用

本次試驗(yàn)組共設(shè)10組，分別為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、SPI組（700 mg／kg）、11S 蛋白和7S 蛋白低、中、高劑量組（300、500、700 mg／kg bw），處理方式同上。

1.2.3 血清及肝臟指標(biāo)檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA、GSH含量，GSH-Px活力，計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量（g）／體重（g）。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSSstatistics 19進(jìn)行單因素方差分析，Ducan氏多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 從大豆分離蛋白中分離11S、7S結(jié)果

大豆蛋白中的蛋白種類按沉降系數(shù)不同可分為4 類：2S、7S、11S、15S，它們所占比例分別為8%、35%、52%、5%［8］。其中SPI中7S蛋白和11S蛋白兩者占了近90%；為了考察大豆蛋白中何者對(duì)保肝作用貢獻(xiàn)大，本試驗(yàn)從SPI中分離出了7S蛋白和11S蛋白，凱氏定氮法［9］測(cè)得蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為91.82%和95.21%；為排除蛋白中多酚類物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，本試驗(yàn)測(cè)得灌胃所用蛋白中多酚含量［10］分別為0.371 mg／g 和0.377 mg／g，高劑量組小鼠每日隨蛋白攝入的多酚（0.26 mg／kg bw）與報(bào)道有效劑量（150 mg／kg bw）［11］相比可以忽略；經(jīng)SDS-PAGE電泳法檢驗(yàn)所提取蛋白的純度［12］，其純度分別為91.20%和89.14% （見圖1）。

圖1 SPI中提取出的11S、7S蛋白SDS-PAGE圖譜

2.2 大豆分離蛋白的保肝作用評(píng)價(jià)

由表1、表2可以看出，模型組與正常組相比，血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA含量及肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），而肝臟中GSH含量、GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。與模型組相比，公認(rèn)的現(xiàn)已臨床使用的水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA含量及肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），而肝臟中GSH含量、GSH-Px活力明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，大豆蛋白飼料組血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA含量降低顯著（P＜0.05），肝臟中GSH-Px活力顯著升高（P＜0.05），6個(gè)指標(biāo)均與陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明若將飲食中的蛋白全部替換為大豆分離蛋白，對(duì)化學(xué)性肝損傷有一定的拮抗作用。對(duì)于灌胃給SPI組，低劑量時(shí)，血清中酶活力，肝臟中GSH含量與模型組相比無(wú)顯著差異；而中、高劑量組，血清中ALT、AST酶活力，肝臟中MDA、GSH含量、GSH-Px活力及肝臟指數(shù)與模型組相比有顯著差異（P＜0.05），而高劑量各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于中劑量組，說(shuō)明小鼠每天攝入700 mg／kg的SPI即可在一定程度上抵御化學(xué)性肝損傷。

表1 SPI對(duì)四氯化碳急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST的影響

表2 SPI對(duì)四氯化碳急性肝損傷小鼠肝臟中MDA、GSH含量、GSH-Px活力和肝臟指數(shù)的影響

2.3 7S、11S蛋白的保肝作用評(píng)價(jià)

由表3、表4可知，與正常組相比，模型組血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA含量及肝臟指數(shù)顯著升高，肝臟中GSH含量、GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組各指標(biāo)均有顯著改善，SPI組（700 mg／kg）各指標(biāo)亦均有顯著改善（P＜0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果相近或略遜于陽(yáng)性對(duì)照組。

表3 11S、7S蛋白對(duì)四氯化碳急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活力的影響

表4 11S、7S蛋白對(duì)四氯化碳急性肝損傷小鼠肝臟中MDA、GSH含量、GSH-Px活力及肝臟指數(shù)的影響

與模型組相比，3個(gè)11S劑量對(duì)血清中ALT活力、肝臟中MDA含量無(wú)顯著降低作用；但中、低劑量對(duì)血清中AST活力有顯著降低作用（P＜0.05）；此外，中劑量組肝臟中的GSH含量、GSH-Px活力與模型組相比升高顯著；高劑量只對(duì)GSH-Px活力有明顯改善作用。與模型組相比，3組不同劑量的7S蛋白，低劑量組除能夠顯著降低肝臟中MDA含量外，對(duì)其他指標(biāo)均無(wú)顯著改善作用；中劑量能夠顯著降低血清中AST活力和肝臟中MDA、GSH含量，血清中ALT活力介于模型組和陽(yáng)性對(duì)照組之間，但未達(dá)顯著水平；而高劑量組各指標(biāo)與模型組相比均有顯著改善作用，且與SPI組相比，肝臟中MDA含量降低顯著，GSH-Px活力顯著升高。

3 討論

大豆蛋白作為少數(shù)的含有人體所需全部氨基酸的植物蛋白，對(duì)其功能性質(zhì)的研究歷來(lái)已久，從大豆中含量極微的異黃酮到大豆蛋白，目前已報(bào)道的大豆蛋白的功能活性眾多，如降低血清中膽固醇含量［13-14］、預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎［15］、延緩腎病進(jìn)程［16］、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用。Yang等［3，17］研究了大豆蛋白對(duì)脂肪變性致肝損傷及酒精性肝損傷的影響，試驗(yàn)結(jié)果表明若飲食中的蛋白全由大豆蛋白提供，與模型組相比，肝臟各項(xiàng)指標(biāo)均顯著改善。

研究保肝作用常用血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。正常生理狀態(tài)時(shí)，ALT和AST主要分布在肝臟的肝上皮細(xì)胞內(nèi)，血清中含量極少。當(dāng)肝臟受到四氯化碳損害時(shí)，四氯化碳在細(xì)胞色素P450作用下生成CCl3.，使肝上皮細(xì)胞受到破壞，ALT、AST被釋放到血清中，導(dǎo)致血清中ALT、AST含量上升，其上升程度與肝臟所受的損傷程度一致，是目前最常用的肝功能指標(biāo)［18］。此外，生成的自由基還能與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸反應(yīng)，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA是這一反應(yīng)過(guò)程的穩(wěn)定產(chǎn)物，而體內(nèi)的自由基急劇增加會(huì)消耗大量的SOD、GSH、GSH-Px等具有抗氧化功能的成分。所以，通過(guò)測(cè)定血清中ALT、AST活力，肝臟中MDA、GSH含量及GSH-Px活力，可以了解肝臟的受損情況。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，SPI灌胃組中，高劑量組各指標(biāo)改善作用優(yōu)于低、中劑量組，其灌胃效果與每天食用SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%飼料組相當(dāng)，兩組間各指標(biāo)無(wú)顯著差異；其GSH-Px活力指標(biāo)甚至優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。這一結(jié)果與Yang等［3］在酒精性肝損傷模型中的結(jié)果一致。國(guó)內(nèi)外對(duì)大豆蛋白的保肝作用研究大都采用大豆分離蛋白為研究對(duì)象，大豆蛋白中不同種類蛋白的保肝效果鮮見報(bào)道。為進(jìn)一步探究SPI中不同蛋白的保肝作用，選取了700 mg／kg劑量的SPI作為對(duì)照，其中11S蛋白低、中、高劑量均不能改善ALT、MDA指標(biāo)，說(shuō)明11S雖為SPI中含量最高的成分，但其對(duì)保肝作用的貢獻(xiàn)有限；而7S蛋白高、中、低劑量組中，低劑量組僅對(duì)MDA有顯著改善作用，中劑量組對(duì)AST、MDA、GSH有顯著改善作用，而高劑量對(duì)所有指標(biāo)均有顯著改善作用，說(shuō)明7S蛋白對(duì)SPI保肝作用的貢獻(xiàn)優(yōu)于11S蛋白；并且存在劑量依賴關(guān)系。此外，與同劑量（700 mg／kg）的SPI組相比，7S蛋白組肝臟中GSH含量及GSH-Px活力顯著升高，MDA顯著降低（P＜0.05），提示7S蛋白是SPI中對(duì)保肝作用的主要貢獻(xiàn)者。

在本試驗(yàn)中，每天給與小鼠700 mg／kg的大豆蛋白即可對(duì)四氯化碳引起的肝損傷起到拮抗作用。按攝入量小鼠∶人體（60 kg）＝9.01∶1 計(jì)算［19］，此劑量低于FDA推薦量25 g／d大豆蛋白，說(shuō)明日常膳食中攝入少量大豆蛋白可有效減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)肝臟造成的損傷。

4 結(jié)論

700 mg／kg的大豆分離蛋白對(duì)四氯化碳致小鼠的化學(xué)性肝損傷具有拮抗作用，其中的7S蛋白是主要的保肝活性因子。

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Hepatoprotection of Soybean Protein Isolate and 7S，11SProteins

Liu Weiwei Ye Yuhui Hu Jun Nie Suping He Hui
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Wuhan 430070）

The present study was designed to investigate the hepatoprotective effect of soybean protein isolate（SPI）against carbon tetrachloride-induced damage in KunMing male mice.SPI and 11S，7Sproteins at a dose of

300，500，700 mg／kg was orally administered to mice，we also added a group of mice which was given SPI fodder（20%SPI was contained）for 15 days.On the last dose，0.15%of CCl4 （olive oil）were administered to mice followed last given drugs.The activity of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）in serum，malondialdehyde（MDA）and glutathione（GSH）level，glutathione peroxidase（GSH-Px）activity in liver and liver index were determined.The result showed that pretreatment of mice with SPI（700 mg／kg）had significant hepatoprotection against CCl4-induced liver damage.Compared with CCl4model group，7Ssoy protein （700 mg／kg）reduced the activity of ALT，AST in serum and the MDA level in liver，and improved GSH level and GSH-Px activity significantly （P ＜0.05）.Our findings suggested that SPI could be a candidate used for preventing liver damage induced by chemicals and 7Ssoy protein was main hepatoprotective activity contributor.

soybean protein isolates （SPI），7S soy protein，11S soy protein，carbon tetrachloride （CCl4），hepatoprotection

TS218

A

1003-0174（2016）11-0032-06

863計(jì)劃（2013AA102206）

2015-03-03

劉維維，女，1992年出生，博士，食品科學(xué)

何慧，女，1960年出生，教授，食品化學(xué)