陳鳳超+陳民才+顏彤彤

[摘要] 目的 觀察鼠胚胎成纖維細胞三維培養(yǎng)修復(fù)大鼠全層皮膚缺損的效果，并對其機制進行分析。 方法 采用組織塊法培養(yǎng)鼠胚胎成纖維細胞，將鼠尾膠原溶液和以血清重懸的鼠胚胎成纖維細胞溶液混合后形成凝膠構(gòu)建組織工程皮膚，移植于大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面。實驗組30只全層皮膚缺損大鼠采用組織工程皮膚進行修復(fù)。對照組30只全層皮膚缺損大鼠不做任何處理。兩組創(chuàng)面分別進行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，計算微血管密度，觀察其愈合過程。 結(jié)果 術(shù)后20 d實驗組用組織工程皮膚覆蓋的大鼠背部創(chuàng)面已完全愈合，新生上皮外觀與結(jié)構(gòu)和正常皮膚相似；對照組創(chuàng)面仍有痂皮覆蓋，去除痂皮可見肉芽組織紅潤致密，創(chuàng)面周圍新生上皮呈粉紅色，邊緣銳利皺縮。實驗組創(chuàng)面組織中CD31表達及微血管密度均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 鼠胚胎成纖維細胞三維培養(yǎng)對動物皮膚全層缺損的修復(fù)有很好的效果，在修復(fù)皮膚損傷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 胚胎成纖維細胞；三維培養(yǎng)；皮膚缺損；微血管密度

[中圖分類號] R641 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（c）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of three dimensional culture of rat embryonic fibroblasts in the treatment of full-thickness skin defect in rats. Methods Full-thickness skin wound was created on the back of rats. Tissue block method was used to culture rat embryonic fibroblast cells. The rat embryonic fibroblast cells resuspended in serum were mixed with tail collagen solution to structure tissue engineered skin. In the experimental group， full thickness skin defect rats （n=30） were transplanted with tissue engineered skin in the wound area. In the control group， full-thickness skin defect rats （n=30） were not given any special treatment. The microvascular density was calculated and the healing process was observed by HE staining and immunohistochemistry method. Results 20 d after operation， in the experimental group the wound areas transplanted with tissue engineering skin on the back of rat were completely healed； the appearances and structures of newborn epithelium were similar to the normal skin. The wounds of the control group did not show healing and were covered with scar； removing scab skin visibled granulation tissues were ruddy and compact； there were pink wounds around new epithelium， and shrinkage around tissue edges. In the experimental group， and the expression of CD31 and microvessel density in wound tissues were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. Conclusion Three dimensional culture of rat embryonic fibroblast cells has good curative effect for repairing the whole layer of skin defect in rats. This culture method may have a good clinical application prospects in the repair of skin damage.

[Key words] Embryo fibroblast； Three-dimensional culture； Skin defect； Microvessel density

皮膚是體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲的屏障。皮膚軟組織缺損嚴重可導(dǎo)致皮膚自我修復(fù)困難，經(jīng)久不愈，感染，甚至危及生命。目前臨床上主要采用自體皮膚移植或自體異體混合移植進行修復(fù)[1-3]，異體皮膚移植容易產(chǎn)生免疫排斥，嚴重影響創(chuàng)面修復(fù)效果。成纖維細胞膠原凝膠（fibroblast populated collagen gel）是指用膠原溶液制備凝膠，對成纖維細胞進行三維立體培養(yǎng)而形成的一種修復(fù)皮膚破損的體外模型。該模型在結(jié)構(gòu)和功能上都和皮膚的真皮層非常相近，有利于修復(fù)創(chuàng)面及改善預(yù)后效果[4-6]。本研究將成纖維細胞三維培養(yǎng)作為真皮替代物觀察對大鼠全層皮膚缺損修復(fù)的效果，為成纖維細胞膠原凝膠在皮膚組織工程及臨床中的應(yīng)用提供了進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

孕齡16～19 d的SD大鼠10只；雄性SD大鼠60只，5月齡，體重200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要儀器

VD-1320潔凈工作臺（德國Hermle），3111CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo），倒置生物顯微鏡（北京市半導(dǎo)體設(shè)備廠），培養(yǎng)皿，手術(shù)刀柄、刀片，巾鉗，持針器，有齒鑷，藥杯，彎盤，縫合針，蚊式鉗，消毒鉗，剪刀，眼科剪，眼科鑷，縫合線等。

1.3 主要試劑及藥品

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、膠原酶、小牛血清，均購于美國GIBCO公司；人IL-6、TGF-β1 ELISA試劑盒，購于北京達科為生物技術(shù)有限公司；蘇木精染色液、伊紅染色液，購于廣州市欣源貿(mào)易有限公司，批號分別為474077、C0109。

1.4 方法

1.4.1 成纖維細胞培養(yǎng) 將10只處于妊娠16～19 d的大鼠處死，酒精浸泡消毒，無菌條件下分離胚胎，取鼠胚胎皮膚，用含雙抗的PBS清洗2～3次，將皮膚切成1～1.5 mm2小塊。用鑷子將切好的組織塊貼到培養(yǎng)瓶內(nèi)，在CO2孵箱內(nèi)孵育4 h，加入少量培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，然后將培養(yǎng)基加至正常量，隔2 d換1次液，當(dāng)成纖維細胞達到60%～70%，傳代培養(yǎng)。

1.4.2 鼠尾膠原制備 將上述處死的大鼠的尾部剪下，用75%乙醇浸泡消毒30 min，在無菌條件下抽出肌腱，用生理鹽水反復(fù)沖洗，剪碎，置于0.1%乙酸溶液中浸泡48 h。4℃低溫離心（10 000 r/min，30 mim）后取上清。放置在4℃冰箱過夜，取出后用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值，用100 g/L氯化鈉溶液反復(fù)鹽析，離心（1000 r/min，5 min）棄上清。用0.1%的乙酸溶解，保存在4℃冰箱備用。

1.4.3 成纖維細胞膠原凝膠制備 取上述第5代鼠胚胎成纖維細胞，對數(shù)生長期時用胰蛋白酶37℃消化10 min，加入小牛血清終止反應(yīng)，20℃離心（1000 r/min，5 min）棄去上清液，加DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，細胞濃度為2×1010個/L。細胞懸液∶5×DMEM∶膠原溶液按1∶2∶7比例混勻，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH為6。置于35℃培養(yǎng)箱孵育10 min，再加入適量的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育培養(yǎng)。

1.4.4 全層皮膚缺損模型制備及分組 SD雄性大鼠稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛（0.01 mL/g）麻醉。背部術(shù)區(qū)去毛，碘伏消毒，用眼科剪在背部中央剪去一個1 cm×1 cm大小的創(chuàng)面，制成全層皮膚缺損模型。根據(jù)皮膚修復(fù)方法不同將實驗大鼠分為兩組，每組30只。實驗組動物采用胚胎成纖維細胞膠原凝膠移植修復(fù)，對照組動物不做處理。各組創(chuàng)面均用紗布覆蓋。

1.5 指標(biāo)檢測

對SD雄性大鼠背部造成全層皮膚缺損，分別在修復(fù)治療后5、10、15、20 d觀察各組大鼠皮膚愈合情況，愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合的創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%，拍照記錄。術(shù)后5、10、15、20 d各處死大鼠6只，取創(chuàng)面組織，冰凍切片，一組進行HE染色，并于顯微鏡下觀察。另一組石蠟包埋，切0.5 μm薄片，用抗CD31單克隆抗體對皮膚組織標(biāo)本進行免疫組化染色。先用低倍光學(xué)顯微鏡觀察，選擇CD31陽性表達密度較高的6個區(qū)域，在高倍鏡下計數(shù)血管數(shù)，計算微血管密度（micro vessel density，MVD），即每平方毫米的微血管數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合情況

實驗組（胚胎成纖維細胞膠原凝膠）修復(fù)的創(chuàng)面在術(shù)后5、10、15、20 d各個時間點的愈合率均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），見表1。術(shù)后5 d，實驗組創(chuàng)面無感染，對照組出現(xiàn)紅腫、感染等不良反應(yīng)。術(shù)后10 d，實驗組創(chuàng)面邊緣呈粉紅色，新生肉芽紅潤、致密，觸之易出血，可見上皮生長明顯加速；對照組創(chuàng)面周圍紅腫，有白色膿苔覆蓋，去除膿苔可見蒼老水腫肉芽組織，創(chuàng)面邊緣圓鈍，新生上皮爬行不明顯。術(shù)后15 d，實驗組創(chuàng)面明顯縮小，新生上皮呈粉白色，發(fā)亮，肉芽新鮮紅潤致密；對照組創(chuàng)面有所縮小，仍有白色膿苔覆蓋，去除膿苔可見創(chuàng)面邊緣較圓鈍，肉芽水腫。術(shù)后20 d，實驗組創(chuàng)面基本愈合，個別可見干燥痂皮，周圍上皮皺縮并可見有細毛長出；對照組創(chuàng)面明顯縮小，創(chuàng)面肉芽組織紅潤致密，創(chuàng)面周圍新生上皮呈粉紅色，邊緣銳利皺縮。

2.2 HE染色結(jié)果

術(shù)后5 d，實驗組大鼠愈合處標(biāo)本顯示有大量纖維細胞、微血管分布，并分泌大量膠原；對照組創(chuàng)面無明顯修復(fù)現(xiàn)象，部分有炎性反應(yīng)。術(shù)后10 d，實驗組大鼠創(chuàng)面可見新生皮膚附屬器及各層結(jié)構(gòu)開始分化，膠原纖維排列緊密；對照組膠原纖維排列疏松，膠原分泌少。術(shù)后15 d，實驗組創(chuàng)面表皮層次清晰，皮膚附屬器及各層結(jié)構(gòu)新生分化完全；對照組膠原纖維排列緊密，膠原分泌增多，皮膚結(jié)構(gòu)與周圍正常皮膚相似。術(shù)后20 d，實驗組創(chuàng)面可以觀察到表皮的基底層、顆粒層和角質(zhì)層；對照組創(chuàng)面亦可見大量纖維細胞和膠原，但各層新生結(jié)構(gòu)都處于修復(fù)階段。見圖1（封三）。

2.3 創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮細胞CD31表達及微血管密度

術(shù)后5 d，實驗組CD31陽性細胞圍成很多大小不一的血管腔，對照組部分血管腔呈類圓形，部分無明顯管腔。術(shù)后5、10、15、20 d各時間點實驗組創(chuàng)面組織微血管密度較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2（封三）、表2。

3 討論

目前研究的組織工程皮膚和生物敷料種類繁多，存在著耐磨性差、免疫排斥、培養(yǎng)時間長、治療費用昂貴等突出問題[7-8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，體外擴增同種異體鼠胚胎成纖維細胞作為種子細胞進行三維培養(yǎng)，并用來修復(fù)鼠皮膚缺損，同時觀察其治療效果，這可能是一條修復(fù)皮膚缺損行之有效的途徑[9]。

成纖維細胞膠原凝膠是指用膠原溶液制備凝膠，對成纖維細胞進行三維立體培養(yǎng)而形成的一種組織樣結(jié)構(gòu)。鼠胚胎成纖維細胞易于獲取，可以在體外進行大規(guī)模培養(yǎng)，并有性質(zhì)穩(wěn)定、增殖力強、持續(xù)分泌、抗原性低等優(yōu)點，是非常理想的組織工程種子細胞[10-11]。膠原是存在于結(jié)締組織并由三條肽鏈形成的螺旋狀纖維狀蛋白，是細胞外基質(zhì)、動物韌帶以及肌腱的主要組成部分，具有無毒、無害、生物相容性好、降解產(chǎn)物可被肌體吸收等優(yōu)點[12]。臨床與實驗證明膠原有促進表皮細胞生長、引導(dǎo)上皮細胞長入損傷區(qū)、促進細胞再生和皮膚組織合成代謝的作用[13-14]，其主要作用機制是膠原（蛋白）含有細胞代謝所需要的必需氨基酸，可以加速成纖維細胞增殖分化，并且其三維空間結(jié)構(gòu)可以在細胞遷移時起支持和潤滑的作用[15-16]。除此之外，使用成纖維細胞膠原凝膠覆蓋傷口，可以加速局部皮膚的血管化速度，促進血液循壞和新陳代謝，從而有利于缺損皮膚的修復(fù)[17-19]。

體內(nèi)細胞的生長環(huán)境都是三維的，是細胞與細胞、細胞與細胞間質(zhì)相互作用形成的一個和諧統(tǒng)一的整體。所以，三維培養(yǎng)的細胞才能夠更合理地反映體內(nèi)細胞的生物學(xué)特征[20]。三維細胞培養(yǎng)復(fù)合物更加接近皮膚的天然結(jié)構(gòu)，更有利于皮膚創(chuàng)傷的修復(fù)。本實驗對鼠胚胎成纖維細胞三維培養(yǎng)修復(fù)大鼠全層皮膚缺損進行研究，結(jié)果表明，三維培養(yǎng)的成纖維細胞依附于鼠膠原纖維可較好地修復(fù)皮膚破損，愈合率高，術(shù)后20 d創(chuàng)面基本愈合，無免疫排斥，而對照組大鼠術(shù)后都不同程度出現(xiàn)皮膚紅腫、感染、肉芽組織蒼老水腫、上皮生長明顯緩慢等問題。實驗組的新生血管MVD值術(shù)后各時間點均明顯高于對照組（P < 0.05）。對照組創(chuàng)面愈合遲緩，分析新生血管化障礙和/或延遲可能是其難以愈合的重要原因之一；而實驗組胚胎成纖維細胞組織工程皮膚可以促進創(chuàng)面內(nèi)殘存的血管內(nèi)皮細胞增殖、分化、遷移，促進創(chuàng)面血管化，使得局部血供增加，抗感染能力明顯加強，從而加速創(chuàng)面愈合。通過HE染色可以看出，移植的胚胎成纖維細胞在體內(nèi)能夠繼續(xù)分泌膠原和細胞生長因子，促進毛細血管的生成，刺激成纖維細胞增殖和分化，從而有利于肉芽組織形成，進而加速創(chuàng)面愈合。本研究為成纖維細胞膠原凝膠在皮膚組織工程及創(chuàng)傷整形外科中的應(yīng)用提供了進一步的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2016-07-05 本文編輯：程 銘）