董貝貝　張智申　謝克亮　于泳浩

【摘要】 目的 探討血紅素結(jié)合蛋白（HPX）是否通過(guò)上調(diào)血紅素氧合酶-1（HO-1）改善大鼠腦缺血再灌注（IR）損傷。方法 60只雄性SD大鼠， 7～8周齡， 體重250～280 g， 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為五組：假手術(shù)（Sham）組、缺血再灌注（MCAO）組、溶劑（疊氮鈉）（MCAO+Vehicle）組、HPX（MCAO+HPX）組和HO-1抑制劑組（MCAO+HPX+ZnppⅨ）組， 每組12只。采用大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）法制備大鼠缺血再灌注模型， MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠分別在IR即刻經(jīng)側(cè)腦室單次注射生理鹽水（10 μl， 0.9%）、疊氮鈉（10 μl， 0.1%）、HPX（10 μl， 1.86 g/L）和10 μl HPX+ZnppⅨ混合液（HPX 1.86 g/L+疊氮鈉0.1%）。IR后24 h、7 d分別采用Carcia評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（NBS）， 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)半暗帶區(qū)腦組織中HO-1 mRNA水平。結(jié)果 IR后24 h Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+ HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠的NBS評(píng)分分別為（15.50±2.43）、（5.17±1.60）、（5.00±2.10）、（10.83±1.47）、（5.33±1.97）分， 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.819， P<0.05）；IR后7 d Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+ HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠的NBS評(píng)分分別為（16.83±1.60）、（8.83±3.31）、（9.17±3.19）、（12.50±3.08）、（9.33±2.07）分， 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.113， P<0.05）。與Sham組相比， MCAO組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平顯著增加（P<0.05）；與MCAO組相比， MCAO+Vehicle組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平無(wú)明顯變化（P>0.05）；與MCAO+Vehicle組大鼠相比， MCAO+HPX組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)論 HPX可通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】 腦缺血再灌注損傷；血紅素結(jié)合蛋白；血紅素氧合酶-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.29.193

Hemopexin in HO-1 up-regulation for improving rat neuroethology after cerebral ischemia reperfusion injury DONG Bei-bei， ZHANG Zhi-shen， XIE Ke-liang， et al. Department of Anesthesiology， Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China

【Abstract】 Objective To investigate whether or not hemopexin （HPX） can improve rat cerebral ischemia reperfusion（IR） injury by its heme oxygenase-1 （HO-1） up-regulation. Methods A total of 60 male SD rats， aging 7～8 weeks and weighting 250～280 g， were divided by random number table into sham operation （Sham） group， ischemia reperfusion （MCAO） group， solvent （sodium azide） （MCAO+Vehicle） group， HPX （MCAO+HPX） group and HO-1 inhibitor （MCAO+HPX+ ZnppⅨ） group， with 12 rats in each group. Middle cerebral artery occlusion （MCAO） was applied to prepare model of rat ischemia reperfusion. MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group received respectively single injection through paracele immediate at IR by normal saline （10 μl， 0.9%）， sodium azide （10 μl， 0.1%）， HPX （10 μl， 1.86g/L） and 10 μl HPX+ZnppⅨ （HPX 1.86 g/L+ sodium azide 0.1%）. Carcia evaluation was applied in 24 h and 7 d after IR for neurobehavior score （NBS）， along with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） for HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue. Results In 24 h after IR， Sham group， MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group had NBS scores respectively as （15.50±2.43）， （5.17±1.60）， （5.00±2.10）， （10.83±1.47） and （5.33±1.97） points， and the difference had statistical significance （F=34.819， P<0.05）. In 7 d after IR， Sham group， MCAO group， MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group and MCAO+HPX+ZnppⅨ group had NBS scores respectively as （16.83±1.60）， （8.83±3.31）， （9.17±3.19）， （12.50±3.08） and （9.33±2.07） points. Their difference had statistical significance （F=13.113， P<0.05）. Comparing with Sham group， MCAO group had obviously higher HO-1mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P<0.05）. Comparing with MCAO group， MCAO+Vehicle group had no obvious change in HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P>0.05）. Comparing with MCAO+Vehicle group， MCAO+HPX group had remarkably higher HO-1 mRNA level in ischemic penumbra brain tissue after 24 h and 7 d of IR （P<0.05）. Conclusion HPX can improve rat neurobehavioral manifestation after ischemia reperfusion by its HO-1 up-regulation.

【Key words】 Cerebral ischemia reperfusion injury； Hemopexin； Heme oxygenase-1

對(duì)腦卒中患者進(jìn)行溶栓治療會(huì)發(fā)生再灌注損傷， 缺血再灌注損傷涉及到氧化應(yīng)激[1]、細(xì)胞凋亡[2]、線粒體紊亂[3]等諸多機(jī)制 ， 針對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行干預(yù)的效果并不理想。過(guò)多的游離血紅素有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性， 能夠造成內(nèi)皮損傷[4]， HPX能夠清除過(guò)多游離血紅素， 而HO-1是游離血紅素代謝的關(guān)鍵限速酶。作者的前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示：HPX 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和脈管上皮細(xì)胞均有表達(dá)， 側(cè)腦室注射HPX可縮小大鼠腦梗死容積[5]。然而國(guó)內(nèi)外針對(duì)HPX的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制的研究相對(duì)缺乏， 因此本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上， 探討HPX是否通過(guò)提高HO-1表達(dá)改善腦缺血再灌注損傷后行為學(xué)表現(xiàn)， 為促進(jìn)腦卒中患者的認(rèn)知功能恢復(fù)提供新思路。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源 成年雄性SD大鼠60只， 7～8周齡， 體重250～280 g， 購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 許可證號(hào)：SCXK（軍）2009-003。分籠飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原菌環(huán)境：溫度（22±2）℃， 相對(duì)濕度約55%～60%， 每日12 h晝夜交替， 自由飲食、飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為五組：Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+ HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組， 每組12只。本研究已獲天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1. 2 腦缺血再灌注模型制備 采用線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型， 參照文獻(xiàn)所述[6]， 10%水合氯醛（0.3 g/kg）腹腔注射麻醉， 暴露并分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）， 右頸外動(dòng)脈（ECA）及頸動(dòng)脈分叉， 直視下用眼科剪于CCA距離動(dòng)脈分叉5～15 mm處剪一小口， 右手改用眼科鑷持準(zhǔn)備好的栓線（購(gòu)自北京西濃科技有限公司）經(jīng)此小口置入CCA內(nèi)向前送入顱內(nèi)， 至稍感阻力， 拉緊固定栓線。待栓塞1 h大鼠蘇醒后， 采用Longa法[7]評(píng)估大鼠行為表現(xiàn)， 評(píng)分1～3分提示造模成功。Sham組大鼠相同條件下暴露分離右側(cè)CCA， 右側(cè)ECA及頸動(dòng)脈分叉， 結(jié)扎右側(cè)CCA和ECA， 但不插入栓線， 關(guān)閉切口。手術(shù)過(guò)程中使用電熱毯維持大鼠體溫， 使其直腸溫度維持在（37.0±0.5）℃。

1. 3 方法 參照文獻(xiàn)所述[8]， MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ 組大鼠分別在IR后即刻在立體定位儀下經(jīng)側(cè)腦室注射方式單次給予生理鹽水（10 μl， 0.9%）、疊氮鈉（NaN3）（10 μl， 0.1%）、HPX（10 μl， 1.86 g/L）和10 μl HPX+ZnppⅨ混合液（HPX 1.86 g/L+0.1%疊氮鈉）。

1. 4 觀察指標(biāo)

1. 4. 1 NBS評(píng)分 參照文獻(xiàn)所述[9]， IR后24 h、7 d采用Carcia評(píng)分法由一個(gè)不了解本研究實(shí)驗(yàn)分組情況的研究人員評(píng)價(jià)各組大鼠NBS評(píng)分。該評(píng)分法分為運(yùn)動(dòng)功能和感覺(jué)功能評(píng)價(jià)兩方面， 最高18分， 最低3分， 得分越高說(shuō)明動(dòng)物的神經(jīng)行為表現(xiàn)越好， 得分3～7分說(shuō)明重度神經(jīng)功能障礙， 8～11分為中度神經(jīng)功能障礙， 12～18分為輕度神經(jīng)功能障礙。

1. 4. 2 RT-PCR法檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)HO-1 mRNA水平變化 Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組和MCAO+HPX組， 每組選取6只大鼠， 水合氯醛深麻醉， 然后進(jìn)行左心室灌注， 直至肝臟色發(fā)白， 右心耳開(kāi)口處流出的灌注液體基本變成清亮， 這時(shí)可認(rèn)為灌注有效。經(jīng)灌注死亡后斷頸取大鼠缺血半暗帶腦組織， 提取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 使用SYBR Green法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)， 以GAPDH為內(nèi)對(duì)照。HO-1引物長(zhǎng)度77bp， 上游引物5′-CGACAGCATGTCCCAGGATT-3′， 下游引物5′-TCGCTCTATCTCCTCTTCCAGG-3′；GAPDH引物長(zhǎng)度95 bp， 上游引物5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′， 下游引物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。用iQTM多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司， 美國(guó)）進(jìn)行擴(kuò)增并分析處理數(shù)據(jù)。用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 組間比較用單因素方差分析， 兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 NBS評(píng)分 IR后24 h Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+ HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠的NBS評(píng)分分別為（15.50±2.43）、（5.17±1.60）、（5.00±2.10）、（10.83±1.47）、（5.33±1.97）分， 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.819， P<0.05）；IR后7 d Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+ HPX組、MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠的NBS評(píng)分分別為（16.83±1.60）、（8.83±3.31）、（9.17±3.19）、（12.50±3.08）、（9.33±2.07）分， 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.113， P<0.05）。與Sham組相比， MCAO組大鼠在IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分顯著降低（P<0.05）；與MCAO組相比， MCAO+Vehicle組大鼠在IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分無(wú)明顯變化（P>0.05）；與MCAO+Vehicle組相比， MCAO+HPX組大鼠IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分顯著升高（P<0.05）；與MCAO+HPX組相比， MCAO+HPX+ZnppⅨ組大鼠IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖1。

2. 2 缺血半暗帶組織HO-1 mRNA水平 與Sham組比較， MCAO組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平顯著增加（P<0.05）；與MCAO組比較， MCAO+Vehicle組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平無(wú)明顯變化（P>0.05）；與MCAO+Vehicle組比較， MCAO+HPX組大鼠IR后24 h、7 d缺血半暗帶區(qū)腦組織HO-1 mRNA水平顯著升高（P<0.05）。

3 討論

大腦中動(dòng)脈是頸內(nèi)動(dòng)脈的直接延續(xù)， 是血管缺血閉塞發(fā)生率最高的動(dòng)脈分支；然而大腦中動(dòng)脈提供大腦半球約80%的血供， 一旦發(fā)生閉塞， 造成的臨床癥狀更加廣泛嚴(yán)重。因此本研究通過(guò)采用經(jīng)典的MCAO法建立大鼠腦IR模型， 這與臨床上缺血性腦卒中發(fā)生的特點(diǎn)相一致。多種神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)方法比較表明， Carcia評(píng)分法與缺血性腦卒中大鼠的梗死容積有更好的相關(guān)性[10]， 因此本研究采用Carcia評(píng)分法評(píng)價(jià)大鼠IR后的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示， 與Sham組相比， MCAO大鼠IR后24 h和7 d的NBS明顯降低， 側(cè)腦室注射HPX能明顯的提高大鼠IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分， 給予HPX時(shí)同時(shí)給予HO-1抑制劑ZnppⅨ后， HPX提高大鼠IR后的NBS評(píng)分的作用消失；大鼠IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分降低到HPX治療前的水平， 側(cè)腦室注射疊氮鈉對(duì)大鼠IR后24 h和7 d的NBS評(píng)分無(wú)明顯影響， 表明HPX能夠有效改善大鼠IR后的神經(jīng)功能缺損， 提高其神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)， HO-1可能是HPX發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用的關(guān)鍵分子。

游離血紅素為親脂性結(jié)構(gòu)， 主要用于血紅蛋白、細(xì)胞色素P450、過(guò)氧化氫酶等的合成， 同時(shí)也還是調(diào)節(jié)這些蛋白基因表達(dá)的重要因子。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)， 過(guò)多的游離血紅素有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用， 該毒性作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元中最為顯著， 多種組織損傷時(shí)伴隨游離血紅素的過(guò)度釋放[11]。游離血紅素的親脂性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能夠很容易的插入血管內(nèi)皮細(xì)胞膜脂質(zhì)分子中， 破壞內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的完整性， 與此同時(shí)， 游離血紅素還參與了血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)， 從而引起血管內(nèi)皮功能障礙[12]。HPX是血漿中與游離血紅素親和力最強(qiáng)的蛋白， 可清除過(guò)多有害游離血紅素。作者前期研究表明HPX在腦缺血后的脈管系統(tǒng)中表達(dá)增加， 側(cè)腦室注射HPX能夠呈劑量依賴性顯著縮小大鼠的腦梗死容積[5]。HO-1是催化血紅素分解的限速酶， 其作為機(jī)體內(nèi)源性的保護(hù)因子， 是細(xì)胞應(yīng)激最敏感的指標(biāo)之一， 對(duì)多種血管源性損傷發(fā)揮保護(hù)作用[13]。缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)HO-1的表達(dá)增加， 外源性導(dǎo)入HO-1基因載體， 缺血再灌注后24 h動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高， 組織病理改變減輕， 梗死面積減少[14]。

本研究結(jié)果顯示， 與Sham組相比， MCAO大鼠IR后24 h缺血半暗帶區(qū)的HO-1 mRNA應(yīng)激性增加， 在IR后7 d下降到手術(shù)前水平；側(cè)腦室注射HPX能夠顯著上調(diào)大鼠IR后24 h缺血半暗帶區(qū)的HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平， 該作用能持續(xù)到IR后7 d；給予HPX時(shí)同時(shí)給予HO-1抑制劑ZnppⅨ， 阻止了神經(jīng)行為學(xué)改善， 表明HPX通過(guò)上調(diào)HO-1表達(dá)改善腦缺血再灌注后行為學(xué)表現(xiàn)。

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[收稿日期：2016-10-09]