張 楠 林 文 戴 琳 蔣璧蔚 程 月 王志祥

(中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程教研室，南京 210009)

超臨界萃取制備亞麻籽油并用尿素包合提純?chǔ)?亞麻酸的工藝研究

張 楠 林 文 戴 琳 蔣璧蔚 程 月 王志祥

(中國(guó)藥科大學(xué)制藥工程教研室，南京 210009)

聯(lián)合超臨界CO2萃取(SFE- CO2)與尿素包合法提純亞麻籽中的α-亞麻酸。首先采用響應(yīng)曲面法中的中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)對(duì)SFE- CO2萃取亞麻籽中α-亞麻酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，然后通過(guò)單因素試驗(yàn)確定尿素包合法的優(yōu)選工藝。結(jié)果表明，SFE- CO2萃取的最佳工藝條件為萃取壓力30 MPa、萃取溫度35 ℃、萃取時(shí)間80 min，在此條件下α-亞麻酸得率可達(dá)13.26%。尿素包合法的優(yōu)選工藝條件為結(jié)晶溫度0 ℃、結(jié)晶時(shí)間3 h、脂肪酸∶尿素∶乙醇=1∶3∶12(m∶m∶V)，經(jīng)1次包合后產(chǎn)品純度可達(dá)78.03%，得率為30.53%。

α-亞麻酸 超臨界CO2萃取 響應(yīng)曲面法 尿素包合 亞麻籽

α-亞麻酸為ω-3系多不飽和脂肪酸，在體內(nèi)可代謝為DHA和EPA[1]。作為一種人體必需的脂肪酸，α-亞麻酸具有抗氧化、抗炎、預(yù)防心腦血管疾病、治療糖尿病、保護(hù)視力及提高記憶力等多種生理作用[2-7]，廣泛用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。目前α-亞麻酸尚不能人工合成，主要依靠從自然資源中分離獲得。

α-亞麻酸主要存在于核桃、亞麻籽、紫蘇籽等植物資源中，從中提純?chǔ)?亞麻酸的方法主要有尿素包合法、低溫結(jié)晶法、分子蒸餾法和超臨界CO2萃取法(SFE-CO2)等。尿素包合法主要依據(jù)長(zhǎng)鏈脂肪酸的不飽和度進(jìn)行分離，分離效果好，設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。低溫結(jié)晶法利用原料組分的溶解度差異進(jìn)行分離，此法低溫操作，可有效保護(hù)物質(zhì)的穩(wěn)定，但有機(jī)溶劑用量大，存在溶劑殘留等安全隱患。分子蒸餾技術(shù)具有條件溫和、無(wú)需溶劑等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備要求較高，不適合工業(yè)生產(chǎn)。SFE-CO2法的得油率(35.3%)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的壓榨法(25.5%)，尤其對(duì)多不飽和脂肪酸的選擇性較高[8-9]，且油脂品質(zhì)好，無(wú)溶劑殘留，但此法僅適用于亞麻酸的初步提取，產(chǎn)品純度不高。上述幾種提純方法各有優(yōu)勢(shì)，本研究利用各方法的優(yōu)點(diǎn)，擬將SFE-CO2和尿素包合2種技術(shù)結(jié)合起來(lái)，用于亞麻籽中α-亞麻酸的提純。

SFE- CO2可分離碳鏈長(zhǎng)度差異較大的脂肪酸，卻無(wú)法分離碳數(shù)相近的脂肪酸，而尿素包合法可將碳數(shù)相近、飽和度不同的游離脂肪酸分開?；趦烧咄耆煌姆蛛x機(jī)理，本研究將2種方法聯(lián)用以分離不同類型的雜質(zhì)，首先采用SFE-CO2技術(shù)在不添加有機(jī)溶劑的條件下萃取亞麻籽，得到多不飽和脂肪酸含量較高、油品較好的亞麻籽油，然后用尿素包合技術(shù)將亞麻籽油中的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸結(jié)晶分離，進(jìn)一步提高產(chǎn)品中α-亞麻酸的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽：深圳市瑞利來(lái)實(shí)業(yè)有限公司。

分析純石油醚(沸程60～90 ℃)、苯、甲醇、氫氧化鉀、氯化鈉：南京化學(xué)試劑有限公司；CO2氣體(純度≥99.9%)：南京天澤氣體有限公司；硬脂酸甲酯、棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、α-亞麻酸甲酯：阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7071 SFE-CO2裝置：美國(guó)AppLied Separation公司；GC-2010島津氣相色譜儀：日本島津制作所；GZX-9070 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BT25S分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JY1002電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)部分

1.3.1 試驗(yàn)流程

亞麻籽→粉碎→SFE-CO2→制備游離脂肪酸→尿素包合

將亞麻籽粉碎后用SFE- CO2得亞麻籽油，亞麻籽油中的脂肪酸均以甘油酯的形式存在，分子體積較大，無(wú)法進(jìn)入尿素晶體。因此，在尿素包合之前需將脂肪酸甘油酯制成游離脂肪酸，再進(jìn)行包合、分離、提純。

1.3.2 試驗(yàn)方法

粉碎：取適量亞麻籽放入粉碎機(jī)中粉碎至無(wú)完整亞麻籽顆粒，過(guò)篩取40～60目粉末備用。

SFE- CO2：準(zhǔn)確稱取6g亞麻籽粉末裝入萃取柱，待萃取溫度達(dá)到設(shè)定值后，打開CO2進(jìn)口閥，逐漸升壓至設(shè)定的萃取壓力，穩(wěn)定后，打開出口閥，調(diào)節(jié)CO2流量至指定值，收集產(chǎn)品并開始計(jì)時(shí)。在單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間為自變量，以α-亞麻酸得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)(CCD)試驗(yàn)方案，并用軟件Design Expert 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析優(yōu)化，得出SFE- CO2亞麻籽中α-亞麻酸的最佳工藝參數(shù)。

混合游離脂肪酸的制備：天然α-亞麻酸均以甘油酯的形式存在，可利用皂化反應(yīng)，將甘油酯在堿性條件下水解成甘油和α-亞麻酸鹽，再加入適量酸便可將α-亞麻酸游離出來(lái)。具體操作為稱取一定量超臨界萃取所得的亞麻籽油，溶于1 mol/L氫氧化鈉-乙醇溶液，于70 ℃攪拌回流1 h得皂化物，減壓濃縮回收乙醇。加入適量的水使皂溶解，用10% HCl溶液調(diào)pH至2～3，加石油醚萃取3次，去水層，將有機(jī)層水洗至中性，加無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收溶劑，得混合游離脂肪酸。

尿素包合：在混合游離脂肪酸中按一定比例加入尿素和乙醇，在70 ℃水浴中攪拌回流直至澄清，室溫冷卻后放入低溫環(huán)境，冷凍結(jié)晶一段時(shí)間，抽濾，濾液真空濃縮回收乙醇，濃縮物加入適量蒸餾水轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用10% HCl溶液調(diào)pH至2～3，加入適量的石油醚萃取3次，合并有機(jī)相，用蒸餾水反復(fù)沖洗，無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，即得產(chǎn)物[10]。

對(duì)比試驗(yàn)(有機(jī)溶劑提取)：稱取15 g亞麻籽粉末放入250 mL圓底燒瓶中，加入70 mL石油醚，80 ℃水浴中回流攪拌6 h，抽濾，除溶劑，稱重，即得有機(jī)溶劑提取的亞麻籽油。重復(fù)3次。

1.3.3 分析方法

油脂中甘油酯的衍生化：精密稱取SFE- CO2得到的亞麻籽油80 mg左右，記錄質(zhì)量，放入20 mL具塞試管中，加入2 mL苯和石油醚(1:1)混合溶劑，震搖使油全部溶解，然后加入2 mL 0.4 mol/mL的氫氧化鉀-甲醇溶液，室溫反應(yīng)30 min[11]。加入10 mL飽和氯化鈉溶液，劇烈震搖，靜置分層后，取上清液適當(dāng)稀釋，用GC測(cè)定樣品中α-亞麻酸含量。

游離脂肪酸的衍生化：根據(jù)孫蘭萍等[12]的描述方法進(jìn)行改進(jìn)。取尿素包合后的混合游離脂肪酸80 mg左右，放入20 mL具塞試管中，加入2 mL 0.4 mol/mL的氫氧化鉀-甲醇溶液，室溫反應(yīng)30 min，再加入2 mL石油醚萃取，其他操作與上述油脂甲酯化操作同。

氣相色譜條件：色譜柱：Rtx-Wax 毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；檢測(cè)器：氫火焰檢測(cè)器(FID)；載氣：氮?dú)猓粴錃饬魉伲?0 mL/min；空氣流速：400 mL/min；汽化室溫度：240 ℃；柱溫：起始溫度190 ℃，保持14.5 min，然后以5 ℃/min升溫到210 ℃，保持3 min；檢測(cè)器溫度：250 ℃；分流比：20∶1；進(jìn)樣量：1 μL。采用面積歸一化法對(duì)α-亞麻酸進(jìn)行定量。α-亞麻酸得率的計(jì)算公式如下：

α-亞麻酸得率=

式中：產(chǎn)品質(zhì)量為經(jīng)SFE-CO2得到的亞麻籽油的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

在SFE-CO2的單因素預(yù)試驗(yàn)部分首先進(jìn)行了夾帶劑的選擇，發(fā)現(xiàn)分別以乙醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮為夾帶劑的萃取結(jié)果與不使用夾帶劑無(wú)顯著差異，因此在不使用夾帶劑的情況下考察了裝樣量、萃取溫度、萃取壓力及萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響，結(jié)果表明萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間對(duì)α-亞麻酸得率的影響較大，因此在進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)時(shí)，以α-亞麻酸得率為考察指標(biāo)，僅考慮萃取溫度、壓力及時(shí)間對(duì)其的影響。

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇CO2流量為1.5 L/min，以萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間為考察因素，以α-亞麻酸得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素的水平編碼見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 中心復(fù)合設(shè)計(jì)因素水平表

注：()內(nèi)為實(shí)際操作值。

表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

經(jīng)SFE-CO2得到的亞麻籽油中，α-亞麻酸含量基本穩(wěn)定，α-亞麻酸得率的變化主要是受產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

利用Design Expert軟件，對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得α-亞麻酸得率對(duì)編碼自變量萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間的回歸方程為：

R=9.34-0.65A+1.59B+1.81C-0.43AB-0.50AC+1.05BC-0.41A2-1.19B2-0.68C2

回歸模型的方差分析見表3，模型的P<0.000 1，表明該二次多元回歸模型極其顯著；失擬項(xiàng)P=0.093 4>0.05不顯著，說(shuō)明該模型未考慮到的因素對(duì)模型的影響不顯著，可以用此模型對(duì)亞麻籽中α-亞麻酸的萃取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

通過(guò)Design Expert軟件求解回歸方程，得出最佳萃取工藝條件為萃取溫度35 ℃，壓力30 MPa，時(shí)間80 min ，α-亞麻酸得率的預(yù)測(cè)值為13.08%。在預(yù)測(cè)的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，α-亞麻酸的平均得率為13.26%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.37%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的萃取工藝穩(wěn)定可行。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：***為差異極顯著(P<0.000 1)；**為差異高度顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

將SFE- CO2法萃取亞麻籽的最優(yōu)條件下得到的亞麻籽油進(jìn)行成分分析，并與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，結(jié)果見表4。與溶劑提取法相比，超臨界萃取法的α-亞麻酸得率較低，但其產(chǎn)品中的α-亞麻酸含量較高(55.11% vs 50.35%)，說(shuō)明SFE-CO2法的對(duì)α-亞麻酸的選擇性更高，這與Rabie等[8]和Pradhan等[9]的報(bào)道一致。同時(shí)，SFE-CO2法用時(shí)更短、不需夾帶劑、無(wú)溶劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)，是一種優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑萃取法的綠色環(huán)保的萃取技術(shù)。

表4 超臨界萃取與有機(jī)溶劑法對(duì)比

2.2 尿素包合試驗(yàn)

取SFE-CO2法所得的亞麻籽油制備成游離脂肪酸，然后進(jìn)行尿素包合試驗(yàn)，以進(jìn)一步提高α-亞麻酸的的純度。

2.2.1 游離脂肪酸尿素比(m/m)對(duì)尿素包合的影響

在尿素與無(wú)水乙醇比為1∶4(m/V)，結(jié)晶溫度0 ℃，包合18 h的條件下考察脂肪酸和尿素的比值對(duì)包合效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著尿素用量的增加，α-亞麻酸含量先升高后降低，游離脂肪酸尿素比在1∶3～4時(shí)，產(chǎn)物中α-亞麻酸含量較穩(wěn)定。這是因?yàn)楫?dāng)尿素加入比例小時(shí)，其在乙醇溶液中形成的包合物框架較少，隨著尿素比例增加，溶解在乙醇溶液中的尿素框架增多，更多的飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸被包合，形成穩(wěn)定的包合物析出，從而提高了α-亞麻酸的含量。繼續(xù)增加尿素用量，會(huì)使尿素在溶劑中溶解不充分，包合效果下降。α-亞麻酸得率隨著尿素用量的增加而降低，主要是尿素結(jié)晶析出時(shí)，α-亞麻酸在其表面黏附造成損失，尿素用量越大，損失越多。因此綜合考慮純度與得率的問題，脂肪酸尿素比控制在1∶2～3左右為宜。

圖1 脂肪酸與尿素比對(duì)α-亞麻酸純度和得率的影響

2.2.2 尿素乙醇比(m/V)對(duì)尿素包合的影響

在脂肪酸與尿素比為1∶3(m/m)，結(jié)晶溫度0 ℃,包合18 h的條件下考察尿素和乙醇的比值對(duì)包合效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 尿素與乙醇比對(duì)α-亞麻酸純度和得率的影響

由圖2可知，隨著乙醇量的增加，α-亞麻酸純度先增高，在m(尿素)∶V(乙醇)=1∶4時(shí)達(dá)到最高后下降，而收率逐漸增加。這是因?yàn)?，?dāng)乙醇用量較少時(shí)，尿素?zé)o法充分溶解、溶液較稠，分子運(yùn)動(dòng)阻力增大，包合反應(yīng)不充分，使α-亞麻酸純度較低，且α-亞麻酸在尿素晶體表面黏附造成導(dǎo)致收率較低。隨著乙醇增加，純度有所提高，但達(dá)到6倍量后，純度明顯降低是因?yàn)椋蛩卦谝掖既芤褐羞_(dá)不到飽和，部分飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸仍留在溶劑中，使得純度降低，但收率提高。因此綜合考慮純度與得率，尿素：乙醇的值控制在1∶(4～5)較為適合。

2.2.3 包合溫度對(duì)尿素包合的影響

在脂肪酸∶尿素∶乙醇=1∶3∶12(m∶m∶V)，包合18 h的條件下考察包合溫度對(duì)包合效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 包合溫度對(duì)α-亞麻酸純度和收率的影響

如圖3可知，α-亞麻酸純度隨溫度降低而升高，0 ℃以下基本保持穩(wěn)定，收率隨溫度的升高而升高。這是因?yàn)?，包合為放熱過(guò)程，溫度降低，有利于尿素絡(luò)合物形成，分離效果明顯，α-亞麻酸純度較高，當(dāng)溫度在0 ℃以上，尿素晶體形成較慢，且不穩(wěn)定，使部分飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸無(wú)法被包合，包合結(jié)晶減少，使得純度下降，收率提高。綜合考慮純度與收率，包合溫度控制在-10～10 ℃較為適合。

2.2.4 包合時(shí)間對(duì)尿素包合的影響

在脂肪酸∶尿素∶乙醇=1∶3∶12(m∶m∶V)，結(jié)晶溫度0 ℃條件下考察包合時(shí)間對(duì)包合效果的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，0～1 h內(nèi)，α-亞麻酸含量顯著提高；1～7 h內(nèi)，α-亞麻酸含量基本趨于穩(wěn)定；包合18 h，α-亞麻酸含量?jī)H有小幅提高。這一現(xiàn)象說(shuō)明，1～7 h內(nèi)包合反應(yīng)已比較充分，物系基本處于平衡狀態(tài)，與大部分文獻(xiàn)報(bào)道選擇包合時(shí)間在12～18 h相比[13]，大大縮短了包合結(jié)晶時(shí)間，而純化效果與18 h的結(jié)果對(duì)比，并無(wú)明顯偏低，因此綜合考慮純度、得率和生產(chǎn)效率，選擇包合時(shí)間為1～3 h。

圖4 包合時(shí)間對(duì)α-亞麻酸純度和得率的影響

2.2.5 包合次數(shù)對(duì)尿素包合的影響

在脂肪酸∶尿素∶無(wú)水乙醇=1∶3∶12(m∶m∶V)，結(jié)晶溫度0 ℃包合3 h的條件下考察包合次數(shù)對(duì)包合效果的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，經(jīng)尿素2次包合純化后，α-亞麻酸含量稍有提高，但得率大大下降。這是因?yàn)閬喡樽延椭泻衼営退?，它?個(gè)不飽和雙鍵使分子具有一定的空間構(gòu)型，不易被尿素包合。綜合考慮純度和得率，選擇1次包合較合理。

圖5 包合次數(shù)對(duì)α-亞麻酸純度和得率的影響

3 結(jié)論

3.1 SFE- CO2步驟最佳萃取條件為萃取壓力30 MPa、溫度35 ℃、時(shí)間80 min，此條件下α-亞麻酸得率可達(dá)13.26%，與響應(yīng)曲面模型預(yù)測(cè)值相一致。

3.2 與溶劑提取法相比，SFE-CO2法所得的亞麻籽油中α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高(55.11% vs 50.35%)，說(shuō)明SFE-CO2法的對(duì)α-亞麻酸的選擇性高。

3.3 尿素包合步驟的較佳工藝條件為結(jié)晶溫度0 ℃、結(jié)晶時(shí)間3 h、脂肪酸∶尿素∶乙醇=1∶3∶12(m∶m∶V)，經(jīng)1次包合，純度可達(dá)78.03%，得率為30.53%。相比于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)晶時(shí)間為12～18 h，大大縮短了結(jié)晶時(shí)間，而純化效果無(wú)顯著差異[13]。

3.4 將2種提取分離技術(shù)聯(lián)合使用，從亞麻籽中提取α-亞麻酸的工藝研究鮮有報(bào)道，研究結(jié)果可為提純?chǔ)?亞麻酸的工藝改進(jìn)提供了一定的參考。

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Research on Supercritical Extraction Combined with Urea Adduction Fractionation Purify α-Linolenic Acid from Flaxseed

Zhang Nan Lin Wen Dai Lin Jiang Biwei Cheng Yue Wang Zhixiang

(China Pharmaceutical University, Pharmaceutical Engineering Teaching and Research Section, Nanjing 210009)

A-linolenic acid was extracted and purified from flaxseed by combining supercritical CO2extraction and urea adduction fractionation. First, central composite design (CCD) of response surface methodology (RSM) was applied to optimize process conditions of supercritical CO2extraction of α-linolenic from flaxseed, and then the single-factor experiments were applied to determine the process conditions of urea adduction fractionation. The results showed that the optimal supercritical CO2extraction conditions were pressure 30 MPa, temperature 35 ℃, time 80 min. Under which, α-linolenic acid yield reached to 13.26%. The optimal urea adduction fractionation conditions were temperature 0 ℃, time 3 h, fatty acid∶urea∶alcohol=1∶3∶12 (m∶m∶V), the content and yield of α-linolenic acid was up to 78.03% and 30.53% respectively by once clathration.

α-linolenic acid, supercritical CO2extraction, response surface methodology, urea adduction fractionation, flaxseed

TQ463

A

1003-0174(2016)02-0038-06

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(JKQZ2013003)

2014-07-03

張楠，女，1989年出生，碩士，制藥分離工程

戴琳，男，1981年出生，碩士，講師，高等制藥分離工程