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(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科,湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；3.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

胃癌組織COMP蛋白表達(dá)的臨床病理意義

田暢1，趙強(qiáng)2，周華茂3，艾小紅1*

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院放療科,湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；3.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科)

目的觀察軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)在胃癌組織中的表達(dá)意義。方法采用免疫組化觀察COMP蛋白組織芯片(包括正常胃黏膜、癌旁及胃癌組織)中的表達(dá)，并分析其表達(dá)的意義。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示COMP蛋白在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于正常胃黏膜和癌旁組織(P<0.05)；癌旁組織高于正常胃黏膜組織(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期患者組織高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。結(jié)論

胃癌； COMP蛋白； 臨床病理意義

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率均居消化道腫瘤第一位[1-2]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多步驟演進(jìn)和多基因相互共同作用的復(fù)雜過(guò)程。胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中與宿主癌基因及抑癌基因等的改變有關(guān)[2-5]。早期診斷仍是防治胃癌非常重要的舉措。課題前期通過(guò)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[6]篩選獲得胃癌相關(guān)蛋白質(zhì)軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)。觀察其在胃癌組織中的表達(dá)，將為胃癌的診斷、分子病理分型等提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1病例資料組織芯片(包括正常胃黏膜、癌旁及胃癌組織)由湘潭市第一人民醫(yī)院病理科吳勇軍主任醫(yī)師贈(zèng)送。該組織芯片包括81例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性56例，女性25例，患者年齡27～81歲，平均年齡為55.35歲；49例胃癌腫塊>3.0 cm，32例≤3.0 cm；胃高分化腺癌5例、中分化腺癌17例、低分化腺癌59例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者26例、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者55例；Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期49例。組織芯片包括5×10個(gè)點(diǎn)陣，所有組織均經(jīng)臨床病理確診，患者術(shù)前均未進(jìn)行化、放療。

1.2主要試劑抗COMP蛋白抗體(TA349820)、二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒和S-P免疫組化試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1.3免疫組化觀察蛋白質(zhì)的表達(dá)采用免疫組化(S-P法)觀察COMP蛋白在正常胃黏膜、癌旁和胃癌組織中的表達(dá)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組，操作步驟如下：將組織芯片置于58 ℃烤箱中過(guò)夜，充分脫蠟；經(jīng)過(guò)不同濃度的酒精水化；置于枸椽酸鹽緩沖液(pH 6.0)中 92～98 ℃ 5 min 進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加3%過(guò)氧化物酶處理 37 ℃ 15 min；滴加血清封閉37 ℃ 10 min，阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)；滴加稀釋一抗液，置于濕盒中4 ℃過(guò)夜；滴加稀釋的二抗，37 ℃ 15 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶，37 ℃ 15 min；滴加DAB顯色，復(fù)液、分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片，觀察蛋白質(zhì)在不同組織中的表達(dá)情況。

1.4蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果的判定將免疫組化染色組織芯片置于顯微鏡下觀察，了解不同組織中蛋白質(zhì)表達(dá)部位與染色情況，其中陽(yáng)性表達(dá)顯示為黃色、棕色或棕褐色。在芯片中每個(gè)組織塊隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍鏡視野，記數(shù)細(xì)胞總數(shù)與蛋白質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值作為細(xì)胞數(shù)，計(jì)算蛋白質(zhì)的陽(yáng)性表達(dá)率[2-5]。蛋白質(zhì)表達(dá)的判定根據(jù)顯色的強(qiáng)度與陽(yáng)性表達(dá)率綜合計(jì)分，顯色強(qiáng)度計(jì)分為：無(wú)顯色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性表達(dá)率計(jì)分為：≤10%為1分；11%～50%為2分；≥50%為3分，將顯色強(qiáng)度分值×陽(yáng)性表達(dá)率分值所得數(shù)值為蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果，其中1分為陰性“-”；2～4分為陽(yáng)性“+”，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”，另外陽(yáng)性表達(dá)率>10%者也為蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化染色觀察COMP蛋白的表達(dá)采用免疫組化染色觀察組織芯片中COMP蛋白的表達(dá)情況，并分析及臨床意義。結(jié)果顯示，COMP蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞漿(圖1)。

圖1 免疫組化染色觀察COMP蛋白質(zhì)的表達(dá)(S-P法，400×)

2.2 COMP蛋白的表達(dá)意義分析將免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示COMP蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常胃黏膜和癌旁組織；另外，癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織(表1，P<0.05)。COMP蛋白在胃癌不同分化組織間表達(dá)不同，其中高分化腺癌組織陽(yáng)性表達(dá)率低于中、低分化腺癌組織，中分化腺癌組織陽(yáng)性表達(dá)率低于低分化腺癌組織(表1，P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(表1，P<0.05)。Ⅲ-Ⅳ期患者組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期(表1，P<0.05)。

3 討 論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與宿主體內(nèi)癌基因與抑癌基因的改變等密切相關(guān)。癌基因的異常激活，如癌基因K-ras、酪氨酸激酶細(xì)胞表面受體c-erbB2和酪氨酸激酶跨膜受體c-met 等可促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，增加胃癌的轉(zhuǎn)移能力[7]。抑癌基因的失活如p53、RUNX3等基因突變也參與胃癌的發(fā)生[8]。因此深入了解相關(guān)基因及其蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)及意義，對(duì)詮釋胃癌發(fā)病的分子機(jī)制，提高胃癌的早期診斷率具有十分重要的作用。

表1COMP蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析

指 標(biāo)nCOMP蛋白表達(dá)-+～+++陽(yáng)性率(%)χ2患者性別男性56233358．93%女性25111456．00%1．73正常胃黏膜343225．88%癌旁組織2619726．92%a5．18胃癌組織高分化腺癌53240．00%a5．22中分化腺癌178952．94%ab12．18低分化腺癌59233661．01%abc27．13，8．39腫塊大小﹥3．0cm49212857．14%≤3．0cm32131959．38%0．38淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)26141246．15%有55163970．91%d4．64TNM分期Ⅰ～Ⅱ32171546．88%Ⅲ～Ⅳ49133673．47%e5．87

與正常胃黏膜組織比較，a：P<0.05；與癌旁組織比較，b：P<0.05；與高分化腺癌組織比較，c：P<0.05；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，d：P<0.05；與 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期比較，e：P<0.05

近幾年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展與革新，許多研究者采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，獲得了大量胃癌相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，試圖用于胃癌診斷、治療及臨床預(yù)后評(píng)估等。課題組前期采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選獲得了一系列胃癌相關(guān)的蛋白，為了解所獲差異表達(dá)蛋白質(zhì)在胃癌中的表達(dá)情況及意義，本文選取其中差異倍數(shù)較大的蛋白質(zhì)COMP，分析了該蛋白質(zhì)在胃癌中的表達(dá)情況及意義，以期為胃癌診斷、治療及臨床預(yù)后評(píng)估等，提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。

軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)為含有5個(gè)分子量為87 kD亞單位(755 個(gè)氨基酸組成)組成的同源五聚體糖蛋白，分子量為435 kD，屬于血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin，TSP)家族，也稱血小板反應(yīng)素5[9-11]。COMP是一種鈣結(jié)合蛋白，主要通過(guò)天冬氨酸與Ca2+連接[12]。有研究顯示，COMP蛋白可誘導(dǎo)凋亡抑制因子的表達(dá)，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-15]。本研究結(jié)果顯示，COMP蛋白在胃癌組織中表達(dá)高于正常胃黏膜和癌旁組織，同時(shí)胃低分化腺癌組織高于高、中分化胃癌組織，以及癌旁組織高于正常胃黏膜組織表達(dá)，提示該蛋白可能參與胃癌發(fā)生與發(fā)展，其作用機(jī)制可能與COMP蛋白誘導(dǎo)凋亡抑制因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞的凋亡有關(guān)，尤其是胃低分化腺癌。結(jié)果提示，COMP蛋白的表達(dá)與胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，隨著胃癌組織分化程度的降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期的增加，陽(yáng)性表達(dá)率則升高。細(xì)胞的凋亡涉及眾多細(xì)胞因子的參與，至于COMP蛋白如何在胃癌發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用，有待后續(xù)的進(jìn)一步研究。深入揭示影響COMP蛋白在胃癌組織中表達(dá)的分子機(jī)制，可為深入了解胃癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

總之，本研究證實(shí)了胃癌組織中COMP蛋白的表達(dá)高于正常胃黏膜與癌旁組織，且與胃癌組織的分化程度有關(guān)，并分析了其在胃癌組織中表達(dá)的意義。結(jié)果與課題組前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果初步分析了COMP蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況，為后續(xù)尋找胃癌診斷、治療及臨床預(yù)后評(píng)估的蛋白分子提供了有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料與依據(jù)。

[1] Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2] 張志偉，湯國(guó)輝，趙強(qiáng)，等.AKT-p27Kip1-Cyclin E在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2011,19(21):2233-2240.

[3] 趙強(qiáng)，張志偉，劉重元，等.PKCα-Annexin A2-S100A10在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志，2014,22(13):1793-1800.

[4] 周華茂，張志偉，劉重元，等.RNT4在胃癌組織中的表達(dá)及意義[J].診斷病理學(xué)雜志,2014,21(11):704-707.

[5] 李臻，張志偉，趙強(qiáng)，等.TGM2在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義[J].世界華人消化雜志,2013,21(34):3858-3862.

[6] 張志偉.胃黏膜上皮癌變相關(guān)蛋白質(zhì)分子的篩選與鑒定[D].2015，南華大學(xué)博士學(xué)位論文.

[7] Bayrak M，Olmez OF，Kurt E，et al.Prognostic significance of c-erbB2 overexpression in patients with metastatic gastric cancer[J].Clin Transl Oncol,2013,15(4):307-312.

[8] Babacan NA，Egilmez HR，Yücel B，et al.The prognostic value of UHRF-1 and p53 in gastric cancer[J].Saudi J Gastroenterol,2016,22(1):25-29.

[9] Posey KL，Hecht JT.The role of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in skeletal disease[J].Curr Drug Targets,2008,9(10):869-877.

[10] Ahrman E，Lorenzo P，Holmgren K，et al.Novel Cartilage Oligomeric Matrix Protein (COMP) Neoepitopes Identified in Synovial Fluids from Patients with Joint Diseases Using Affinity Chromatography and Mass Spectrometry[J].J Biol Chem,2014,289(30):20908-20916.

[11] Xie X，Liao L，Gao J，et al.A novel COMP mutation in a Chinese patient with pseudoachondroplasia[J].Gene,2013,522(1):102-106.

[12] Kosacka J，Nowicki M，Kl?ting N，et al.COMP-angiopoietin-1 recovers molecular biomarkers of neuropathy and improves vascularisation in sciatic nerve of ob/ob mice[J].PLoS One,2012,7(3):e32881.

[13] Dakin SG，Smith RK，Heineg?rd D，et al.Proteomic analysis of tendon extracellular matrix reveals disease stage-specific fragmentation and differential cleavage of COMP (cartilage oligomeric matrix protein) [J].J Biol Chem,2014,289(8):4919-4927.

[14] Verma P，Dalal K.Serum cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in knee osteoarthritis:a novel diagnostic and prognostic biomarker[J].J Orthop Res,2013,31(7):999-1006.

[15] Kim S，Kwon J.COMP-Ang1 inhibits apoptosis as well as improves the attenuated osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells induced by advanced glycation end products[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(10):4928-4934.

TheClinicalPathologicalSignificanceofCOMPProteinExpressioninGastricCancerTissue

TIAN Chang，ZHAO Qiang，ZHOU Huamao，et al
(DepartmentofRadiotherapy，theFirstAffiliatedHospital，UniversityofSouthChina，Hengyang，Hunan421001，China)

ObjectiveThis study aimed to observe the expression significance of Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in gastric cancer tissue.MethodsThe expression of COMP protein was observed by immunohistochemistry staining in normal gastric mucosa，cancer side tissue and gastric cancer and the expression significance of COMP protein was analyzed in gastric cancer tissue.ResultsThe immunohistostaining results showed that the expressin positive rate of COMP protein was higher in gastric cancer tissue than that in normal gastric mucosa and cancer side tissue (P<0.05)，in cancer side tissue than that in normal gastric mucosa (P<0.05)，in lymphaden metastatic gastric cancer tissue than that in no lymphaden metastatic gastric cancer tissue (P<0.05) and in Ⅲ-Ⅳperiod patient gastric cancer tissue than that in Ⅰ-Ⅱperiod (P<0.05).ConclusionAs the differentaiation level decreased，lymphaden metastasis and TNM classification of gastric cancer increased，the expression rate of COMP protein was heightened.

gastric cancer; COMP protein; clinical pathological significance

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.003

2016-05-05；

2016-07-21

衡陽(yáng)市科技局項(xiàng)目(2013KJ02).

*通訊作者，E-mail:1163504926@qq.com

COMP蛋白表達(dá)隨著胃癌組織分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期增加表達(dá)升高。

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蔣湘蓮)