丁建莉，姜 昕，關(guān)大偉，馬鳴超，趙百鎖，周寶庫，曹鳳明，李 力，李 俊

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東北黑土微生物群落對長期施肥及作物的響應(yīng)

丁建莉1,2，姜 昕1,2，關(guān)大偉1,2，馬鳴超1,2，趙百鎖2，周寶庫3，曹鳳明1,2，李 力1,2，李 俊1,2

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，北京 100081；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱 150086）

【目的】為表征長達(dá)35年輪作與施肥條件下東北黑土微生物群落特征，解析長期施肥及作物對土壤微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響，探討東北黑土微生物群落變化與施肥及不同作物間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步改良耕作制度與施肥方式提供依據(jù)?！痉椒ā恳劳泻邶埥∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院長期定位試驗站，選取玉米和大豆兩種作物季的4個不同施肥處理：不施肥處理（CK）、有機(jī)肥處理（M）、無機(jī)肥處理（NPK）和有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理（MNPK）的耕層土壤為研究對象，處理前加字母m表示玉米季樣品，加字母s表示大豆季樣品。借助Illumina Miseq高通量測序平臺和Real-time PCR技術(shù)，以16S rRNA基因為分子標(biāo)靶，研究作物與施肥方式對黑土中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響，分析群落變化與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性。【結(jié)果】玉米季土壤16S rRNA基因拷貝數(shù)（6.32×108—8.83×108/ng DNA）比大豆季的低（0.96×109—2.30×109/ng DNA）；玉米季土壤微生物多樣性（ACE指數(shù)為3 674.58—4 034.84）也低于大豆季（ACE指數(shù)為4 167.47—4 887.36)；玉米季的細(xì)菌豐度以Acidobacteria（24.47%—27.90%）最高，而大豆季豐度最高的是Proteobacteria（27.78%—34.40%），Bacteroidetes和Actinobacteria豐度在兩季作物中差異明顯。同一作物季的有機(jī)肥無機(jī)肥配施處理的16SrRNA基因拷貝數(shù)高于無機(jī)肥處理，且有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理的微生物α多樣性指數(shù)也比無機(jī)肥處理的高（sMNPK的Chao1指數(shù)比sNPK高出11.89%）；不同施肥處理之間群落組成存在差異，Alphaproteobacteria在sMNPK和sNPK處理的相對豐度分別比sCK增加3.31%、5.24%；Gammaproteobacteria在sMNPK和sNPK處理均比sCK處理增加1.72%和1.2%，二者相對豐度變化大。相關(guān)性分析顯示，16SrRNA基因拷貝數(shù)與土壤硝態(tài)氮和速效鉀正相關(guān)；微生物菌落多樣性指數(shù)與土壤全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀等化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。【結(jié)論】東北黑土不同作物季和不同施肥均會影響土壤微生物豐度、α多樣性和群落結(jié)構(gòu)。有機(jī)肥無機(jī)肥配施能夠有效改變微生物群落結(jié)構(gòu)，提高微生物的豐度和多樣性，并提高土壤pH，減緩?fù)寥浪峄?/p>

施肥；作物；微生物群落結(jié)構(gòu)；土壤化學(xué)性質(zhì)；高通量測序；黑土

0 引言

【研究意義】中國東北黑土帶是世界著名的三大黑土帶之一，土壤有機(jī)質(zhì)含量高、養(yǎng)分豐富，是重要的商品糧基地，對國家糧食供應(yīng)和安全起著舉足輕重的作用，但長期過量不合理的施肥和耕作，導(dǎo)致了黑土農(nóng)田質(zhì)量日益退化[1]。土壤微生物作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能夠?qū)﹂L期肥料累積作用產(chǎn)生敏感而快速的響應(yīng)，是評價土壤質(zhì)量、土壤肥力和作物生產(chǎn)力的重要指標(biāo)[2]。因此，開展對黑土中微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的研究，能為進(jìn)一步揭示土壤微生物與生態(tài)環(huán)境間的響應(yīng)機(jī)制，以及改進(jìn)施肥和耕作制度提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，施肥會改變土壤微生物學(xué)特性，長期施用化肥能顯著提高土壤微生物生物量，并引起群落結(jié)構(gòu)變化[3]，長期施氮肥顯著影響固氮菌、氨氧化菌等氮循環(huán)菌群[4]，磷肥的長期施用能控制一些特異性細(xì)菌及真菌的密度，但對褐灰鈣土土壤微生物群落總體的豐富度沒有明顯影響[5]。施用不同有機(jī)肥和氮肥均會引起土壤微生物組成的差異[6]，有機(jī)肥能夠顯著改變微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性[7]，提高微生物生物量和代謝活性[8]、以及土壤酶活性[9]。糞肥的長期施用會使作物根系分泌物和土壤中可溶性有機(jī)碳含量增加，提高土壤中微生物群落多樣性[10]，顯著降低土壤真菌與細(xì)菌的比率，改變細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)[11]，長期施用綠肥促進(jìn)了某些細(xì)菌的生長，從而降低了作物枯萎病的發(fā)病率[12]。土壤微生物不僅受施肥方式的影響，也受作物類型的影響[13]，蔡艷等[14]報道不施肥條件下糧豆輪作有利于提高細(xì)菌多樣性。此外，目前的高通量測序技術(shù)可對環(huán)境中所有微生物群落進(jìn)行研究，獲得數(shù)據(jù)量大，并更真實地揭示微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，極大促進(jìn)了環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物以及痕量菌的更深入研究[15-16]。Illumina Miseq高通量測序可實現(xiàn)多樣品的可變區(qū)同時測序，前人應(yīng)用此方法發(fā)現(xiàn)東北黑土長期施用氮肥導(dǎo)致土壤微生物多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)改變[17]；秦杰等[18]通過此技術(shù)初步分析了東北黑土長期施用不同無機(jī)肥條件下，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征和組成差異變化，并取得一定進(jìn)展。【本研究切入點(diǎn)】由于多年連續(xù)施用大量無機(jī)肥，尤其是氮肥，造成東北黑土土壤pH持續(xù)下降，土壤有機(jī)質(zhì)含量下降，土壤中微生物已由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變[19]。已有的報道顯示有機(jī)肥能夠改善土壤質(zhì)量、改變土壤微生物組成[20-21]，但其如何影響土壤質(zhì)量及響應(yīng)機(jī)制并不清楚。同時除常規(guī)施肥等農(nóng)業(yè)措施外，不同作物及種植制度也會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但目前這方面報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院35年定位試驗站的連續(xù)兩種作物種植季的4個不同施肥處理耕層土壤為研究對象，以16S rRNA基因為分子標(biāo)靶，借助Illumina MiSeq高通量測序平臺和定量PCR技術(shù)，探討長期施肥和作物對東北黑土微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度的影響，為農(nóng)田優(yōu)化施肥和耕作制度，提高土壤可持續(xù)生產(chǎn)力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長期定位試驗站進(jìn)行，該試驗站位于黑龍江省哈爾濱市（45°40’ N，126°35’ E），屬于松花江二級階地，地勢平坦，海拔151 m，年均氣溫3.5℃，無霜期135 d，年降水量533 mm。自1980年起，試驗按小麥-大豆-玉米順序輪作，到2014年和2015年分別為大豆茬（第35個生長季，簡稱大豆季）和玉米茬（第36個生長季，簡稱玉米季）。本試驗設(shè)計4個處理：不施肥處理（CK）；有機(jī)肥處理（M）；施氮肥、磷肥和鉀肥的無機(jī)肥處理（NPK）；有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理（MNPK），3次重復(fù)。處理名稱前加字母m表示玉米季的樣品，如，mCK表示玉米季的不施肥處理；加字母s表示大豆季的樣品，如sCK表示大豆季的不施肥處理。氮、磷、鉀肥分別為尿素、重過磷酸鈣、硫酸鉀。氮磷鉀肥大豆期施用量為75 kg N?hm-2，150 kg P2O5?hm-2，75 kg K2O?hm-2；小麥期和玉米期施用量為150 kg N?hm-2，75 kg P2O5?hm-2，75 kg K2O ?hm-2。有機(jī)肥為馬糞，施用量為18 600 kg?hm-2。

1.2 樣品采集

分別于2014年9月和2015年9月，取作物收獲季5—25 cm的耕層土壤，每個重復(fù)小區(qū)隨機(jī)取10個點(diǎn)，剔除雜質(zhì)后混勻作為該處理一個重復(fù)的土壤樣品。土壤保存于封口塑料袋中，一部分溫室風(fēng)干研磨并過0.2 mm篩，用于測定土壤理化性質(zhì)；另一部分樣品保存于-80℃冰箱，待微生物群落分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)測定 銨態(tài)氮測定采用KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法[22]。參照魯如坤[23]方法測定以下土壤化學(xué)性質(zhì)。其中，土壤pH測定采用酸度計法（土﹕水=1﹕1）；土壤有機(jī)質(zhì)測定采用濃硫酸-重鉻酸鉀消煮-硫酸亞鐵滴定法；土壤全氮的測定采用半微量凱氏定氮法；土壤有效磷的測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；土壤速效鉀的測定采用乙酸銨浸提-原子吸收火焰光度法。

1.3.2 土壤DNA的提取和16S rRNA基因的高通量測序 土壤總DNA使用美國MOBIO公司的Power Max Soil DNA Isolation Kit試劑盒，每個樣品稱取0.25 g土壤，依照試劑盒說明提取土壤總DNA。所提取的土壤總DNA 的濃度和純度用核酸定量儀（NanoDrop ND-1000）檢測。DNA送至北京奧維森基因科技有限公司，應(yīng)用Illumina MiSeq 平臺對細(xì)菌和古菌16S rRNA基因的V4（515F-806R）進(jìn)行測序[24]。測序原始序列上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫（SRP062512）。

1.3.3 16S rRNA基因豐度測定 采用SYBR Green定量PCR法測定16S rRNA基因，反應(yīng)在ABI 7500 Real-time PCR（ABI，USA）儀器上進(jìn)行。反應(yīng)體系為FastFire qPCR PreMix （TIANGEN，China）10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，1μL DNA 模板，10 n mol·L-1引物（515F-806R），補(bǔ)加ddH2O至20 μL。以含有16S rRNA基因的重組 pGEMR-T 載體為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，參照文獻(xiàn)[25]制備質(zhì)粒和進(jìn)行后續(xù)工作。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

通過Illumina MiSeq平臺進(jìn)行Paired-end測序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體[17]，再聚類為用于物種分類的OUT（Operational Taxonomic Units），OTU相似性設(shè)置為97%。對比Greengenes數(shù)據(jù)庫，得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息。利用Mothur軟件（version 1.31.2）進(jìn)行α多樣分析（包括Shannon、ACE和Chao1等3個指數(shù)）?；赪eighted Unifrace距離[26]，使用R（v3.1.1）軟件包的pheatmap進(jìn)行聚類分析[27]。采用SPSS 19.1軟件，單因素ANOVA分析和Pearson相關(guān)性分析，用Turkey 顯著差異法分析處理間的差異顯著性；同時應(yīng)用兩因素方差分析（Two-way ANOVA）說明作物效應(yīng)和施肥效應(yīng)的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同作物和施肥處理對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

兩種作物季的不同施肥處理對土壤化學(xué)性質(zhì)影響見表1，施肥和作物對土壤化學(xué)性質(zhì)影響見表2。單因素分析結(jié)果表明，與不施肥相比，單施無機(jī)肥降低了土壤pH，施有機(jī)肥提高了pH，大豆季的sNPK處理的土壤pH比sCK降低0.95，有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理（sMNPK）的pH要高出單施無機(jī)肥處理（sNPK）0.4。有機(jī)肥配施無機(jī)肥和單施無機(jī)肥處理極顯著增加土壤中全氮、硝態(tài)氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)等的含量（＜0.05），其中玉米季的mMNPK處理的有效磷含量較mCK處理提高60.81 mg·kg-1，mNPK處理也較mCK處理提高57.81mg·kg-1?？傮w上，施肥對不同處理的銨態(tài)氮含量影響不顯著，但兩個作物季間的銨態(tài)氮含量差異顯著；玉米季的銨態(tài)氮含量明顯低于大豆季的，sNPK處理的銨態(tài)氮含量為35.80 mg·kg-1，而mNPK的僅為11.26 mg·kg-1，說明作物季的變化是引起土壤化學(xué)性質(zhì)變化的重要因素之一。同時，通過施肥和作物對土壤化學(xué)性質(zhì)影響的方差分析，可知施肥和作物均顯著影響土壤化學(xué)性質(zhì)。

表1 兩種作物季不同施肥處理土壤化學(xué)性質(zhì)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)值后不同字母表示處理間差異達(dá)顯著水平(<0.05)。下同

Data are`x ±; Values followed by different letters in a row are significant among treatments at the 0.05 level. The same as below

表2 施肥和作物對土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物多樣性指數(shù)影響的方差分析

2.2 不同作物和施肥處理對黑土中16S rRNA基因豐度的影響

供試土壤中的16S rRNA基因豐度測定結(jié)果如圖1所示，玉米季土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù)為6.32× 108—8.83×108/ng DNA，大豆季拷貝數(shù)為0.96×109—2.30×109/ng DNA，表明2種作物季存在顯著差異。在玉米季中，mMNPK處理的拷貝數(shù)最高，為8.83×108/ng DNA，比mCK和mNPK處理分別提高了39.72%、36.63%；另外，mM處理也較mCK和mNPK處理分別提高23.73%、20.86%。在2種作物季中均為有機(jī)肥無機(jī)肥配施的拷貝數(shù)最高，無機(jī)肥處理和不施肥處理間沒有顯著性差異。16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析（表3），結(jié)果表明，基因拷貝數(shù)與土壤硝態(tài)氮和速效鉀極顯著正相關(guān)，而與銨態(tài)氮極顯著負(fù)相關(guān)。

小寫字母表示玉米季不同處理間差異達(dá)顯著水平；大寫字母表示大豆季不同處理間差異達(dá)顯著水平（P<0.05）

表3 16S rRNA基因拷貝數(shù)、α多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析

**，0.01水平具有顯著相關(guān)性；*，0.05水平具有顯著相關(guān)性 **, correlation is significant at the 0.01 level; *, correlation is significant at the 0.05 level

表4 兩種作物季不同施肥土壤中微生物α多樣性指數(shù)分析

2.3 不同作物和施肥處理對黑土中微生物α多樣性的影響

兩種作物季不同施肥處理的微生物 α多樣性指數(shù)均值統(tǒng)計情況見表4。無論是多樣性指數(shù)Shannon，還是豐富度指數(shù)ACE與Chao1均是大豆季高于玉米季，兩種作物季具有顯著性差異。ACE指數(shù)玉米季為3 674.58—4 034.84，而大豆季在4 167.47—4 887.36。通過分析可見作物明顯影響土壤微生物α多樣性。

大豆季4個處理α多樣性指數(shù)比較，單施有機(jī)肥處理（sM）均最高；有機(jī)肥配施無機(jī)肥（sMNPK）的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)高于無機(jī)肥處理（sNPK），更接近于不施肥處理（sCK）。可見長期施肥會引起土壤微生物α多樣性的改變。總體上，有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理α多樣性比無機(jī)肥處理高。

通過施肥和作物對土壤微生物多樣性指數(shù)影響的方差分析（表2），可知施肥和作物對多樣性指數(shù)均有顯著影響。進(jìn)一步分析α多樣性指數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性（表3），從表中數(shù)據(jù)可知α多樣性指數(shù)與土壤全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀等具有相關(guān)性。Shannon指數(shù)與全氮含量具有極顯著負(fù)相關(guān)性，與銨態(tài)氮和速效鉀含量具有極顯著正相關(guān)性。

2.4 不同作物和施肥處理對黑土中微生物組成的影響

經(jīng)高通量測序分析可知，玉米季有88.53%— 91.37%為細(xì)菌，古菌比例為7.53%—11.62%，另外的1.09%—1.17%為不可確定；大豆季有93.91%—96.71%為細(xì)菌，古菌僅占2.70%—4.10%，有0.32%—2.18%不能確定。且兩種作物季的古菌中均約99%以上為Crenarchaeota，細(xì)菌群落對不同作物季的響應(yīng)更為顯著。兩種作物季的不同施肥土壤中微生物門水平組成見圖2，玉米季細(xì)菌主要的5個菌門分別為Acidobacteria（24.47%—27.90%）、Proteobacteria（18.60%—21.43%）、Verrucomicrobia（12.23%—16.93%）、Bacteroidetes（7.16%—10.49%）和Gemmatimonadetes （4.07%—6.14%）。大豆季細(xì)菌主要的5個菌門分別為Proteobacteria（27.78%—34.40%）、Acidobacteria（16.39%—20.94%）、Gemmatimonadetes（8.85%—11.03%）、Actinobacteria（8.03%—10.34%）和Verrucomicrobia（7.80%—8.37%）。兩個作物季的Bacteroidetes和Actinobacteria 相對豐度差異明顯。

表5中列出了大豆玉米2種作物季不同施肥處理土壤中微生物綱水平的組成。從表中可知，Acidobacteria在兩種作物季中出現(xiàn)較大變化；Chloracidobacteria在玉米季相對豐度為12.01%—18.55%，而大豆季為4.25%—9.37%，玉米季的比大豆季所占的比例提高了7.76%—9.18%。另外，Chloracidobacteria在同一作物季的施肥處理相對豐度要低于不施肥處理，如mM（16.02%）、mMNPK（13.48%）和mNPK（12.01%）的相對豐度均小于mCK（18.55%）的相對豐度。通過微生物組成與土壤化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析（表6），可知Acidobacteria相對豐度與土壤pH極顯著正相關(guān)；與銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量極顯著負(fù)相關(guān)。

供試土壤中的Proteobacteria在大豆玉米兩種作物季中變化也較大（表5），其中，Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria的相對豐度在玉米季分別為5.04%—6.38%和3.74%—5.21%；而在大豆季兩者分別為9.94%—11.79%和11.05%—16.9%。Alphaproteobacteria的相對豐度在玉米季各施肥處理沒有顯著性差異，而在大豆季sMNPK（14.97%）和sNPK（16.90%）之間存在顯著差異，sCK（11.66%）和sM（11.05%）之間沒有顯著性差異。Gammaproteobacteria的相對豐度在sMNPK和sNPK處理比不施肥處理增加1.72%和1.2%。另外，Proteobacteria相對豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析（表6），Proteobacteria相對豐度與pH極顯著負(fù)相關(guān)；與硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量極顯著正相關(guān)。

圖2 兩種作物季不同施肥土樣中微生物門水平的組成（相對豐度＞1%）

表5 兩種作物季不同施肥土壤中微生物綱水平的組成（8組中至少有1組的相對豐度＞1%）

表6 微生物組成與土壤化學(xué)性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析

從表5中數(shù)據(jù)顯示，Actinobacteria門中的Actinobacteria綱在玉米季的相對豐度為0.81%—1.16%，大豆季的提高到3.61%—3.54%，相同作物季的不同施肥處理間沒有顯著性差異。Actinobacteria相對豐度與全氮顯著負(fù)相關(guān)；與銨態(tài)氮和速效鉀含量極顯著正相關(guān)。Bacteroidetes門中的Saprospirae的相對豐度，在玉米季3個施肥處理間沒有差異，但與不施肥處理存在顯著差異；而在大豆季的有機(jī)肥處理和有機(jī)無機(jī)配施處理要顯著高于不施肥與無機(jī)肥處理。Bacteroidetes相對豐度與銨態(tài)氮和速效鉀含量極顯著負(fù)相關(guān)。

2.5 不同作物季和施肥處理的聚類分析

通過聚類分析，具有相似β多樣性的供試樣品聚類在一起，本研究各處理的結(jié)果（圖3）顯示主要聚類成兩大分支，每一分支由同一作物季的各個施肥處理聚類組成。玉米季的mNPK處理的幾個平行先行相聚，再依次與mMNPK、mM和mCK聚類；大豆季則是sCK與sM先聚類，而后依次與sMNPK和sNPK聚類。

圖3 兩種作物季不同施肥處理的β多樣性分析

3 討論

3.1 不同作物和施肥處理影響黑土中16S rRNA基因豐度的變化

本研究表明，大豆季黑土中16S rRNA基因豐度明顯高于玉米季，大豆季的有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理16S rRNA基因的拷貝數(shù)比玉米季的提高了1.60倍。因此可知，種植不同作物是影響土壤16S rRNA基因豐度的一個重要因素，種植大豆提高了土壤16S rRNA基因豐度。另外，Han等[28]利用平板計數(shù)的研究也發(fā)現(xiàn)豆科植物能夠明顯增加可培養(yǎng)微生物數(shù)量。其原因可能是因為種植作物根系分泌物的不同，而引起根系周圍及其土壤中細(xì)菌等微生物種群結(jié)構(gòu)的變化，大豆是豆科作物，其根瘤內(nèi)部具有固氮能力的根瘤菌，能為土壤微生物提供更多的氮源；同時大豆根系分泌物中脂肪酸較多，能活化土壤中難溶的養(yǎng)分，提供更多營養(yǎng)物質(zhì)，更有利于土壤中微生物的生長繁殖[29]。

Zhou等[17]研究發(fā)現(xiàn)長期施用氮肥會顯著降低土壤中16S rRNA基因的拷貝數(shù)。而Wessén等[30]研究得出施用無機(jī)肥硝酸鈣和硫酸銨會提高16S rRNA基因的拷貝數(shù)。我們的研究表明，無機(jī)肥處理并沒有降低基因拷貝數(shù)，施用有機(jī)肥，尤其是有機(jī)肥配施無機(jī)肥能顯著提高基因拷貝數(shù)。且土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤化學(xué)性質(zhì)有明顯的相關(guān)性（與硝態(tài)氮、速效鉀含量顯著正相關(guān)，而與銨態(tài)氮含量負(fù)相關(guān)）。前面分析已知土壤化學(xué)性質(zhì)同時受施肥和作物的影響，進(jìn)一步表明黑土中微生物的豐度的變化是施肥和作物共同作用的結(jié)果。

3.2 不同作物和施肥處理對黑土中微生物多樣性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)在同一處理中，大豆季的土壤微生物多樣性明顯高于玉米季，如有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理的Chao1指數(shù)大豆季比玉米季提高了16.60%。此外，Wu等[16]研究長期定位試驗站的紅壤水稻土，結(jié)果表明有機(jī)肥配施無機(jī)肥處理的土壤微生物多樣性與無機(jī)肥處理之間沒有顯著性差異；而Tian等[31]發(fā)現(xiàn)大量施用有機(jī)糞肥較無機(jī)肥降低土壤微生物多樣性。我們的研究與Doan等[32]的發(fā)現(xiàn)一致，即有機(jī)肥無機(jī)肥配施的微生物多樣性高于無機(jī)肥。這可能與土壤類型和施肥的時間有關(guān)系，Tian是短期定位實驗（3年），而本研究是基于35年以上的長期定位實驗的結(jié)果。

本文的聚類分析表明，群落結(jié)構(gòu)按照作物季分成明顯的兩大簇，說明其存在較大差異，同時，同一簇的4個不同施肥處理相互比較，得知不同施肥方式也引起了群落結(jié)構(gòu)間的差異。與有機(jī)肥無機(jī)肥配施相比，施無機(jī)肥對黑土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變更大。因此，長期施肥導(dǎo)致的東北黑土中微生物群落的變化跟作物種類、氣候和降水等因素相關(guān)，但各因素作用的程度如何還不得而知。同時，根據(jù)土壤微生物多樣性指數(shù)與化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析，可知多樣性指數(shù)與土壤全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀等化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。

3.3 不同作物和施肥處理對黑土中微生物組成的影響

本研究表明在大豆和玉米季中的土壤微生物組成存在較大差異。玉米季的古菌所占比例（7.53%— 11.62%）高于大豆季（僅占2.70%—4.10%）；玉米季Acidobacteria是細(xì)菌中相對豐度最高的菌門，而大豆季相對豐度最高的菌門是Proteobacteria；玉米季的Bacteroidetes相對豐度較高而在大豆季較低，大豆季的Actinobacteria相對豐度較高而在玉米季較低。Bacteroidetes和Actinobacteria豐度在兩季作物中差異明顯，作物影響微生物組成，這個結(jié)果與以前的報道一致[13, 33]。且同一作物不同施肥處理之間也存在差異，如Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria相對豐度變化較大，施肥處理均比不施肥處理的相對豐度提高，對有機(jī)肥配施無機(jī)肥和無機(jī)肥均比較敏感。Actinobacteria的相對豐度不同施肥處理之間沒有明顯差異。Chloracidobacteria在不施肥處理具有較高相對豐度，而對有機(jī)肥配施無機(jī)肥、有機(jī)肥和無機(jī)肥均表現(xiàn)不穩(wěn)定性。以上分析得知，作物和施肥均改變了土壤微生物的群落組成，組成的改變是否會引起土壤微生物整體代謝功能的變化，還有待于更深入的研究。

根據(jù)土壤微生物組成（門水平）與化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析，可知微生物組成與土壤pH、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀等化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。土壤質(zhì)量的改變是緩慢的、長期積累的效應(yīng)，土壤微生物隨著土壤性質(zhì)的改變而改變。而本論文沒有關(guān)于施肥和作物引起微生物數(shù)量、多樣性等變化的貢獻(xiàn)量進(jìn)行量化分析，以及施肥與作物交互作用機(jī)理等的研究，這些問題還需進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

本研究表明，施肥和不同作物均對東北黑土土壤微生物豐度、α多樣性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。連續(xù)施用無機(jī)肥會導(dǎo)致土壤酸化，而有機(jī)肥無機(jī)肥配施能有效地提高土壤pH，緩解酸化。且土壤化學(xué)性質(zhì)與土壤微生物群落變化具有相關(guān)性。有機(jī)肥配施無機(jī)肥顯著增加了黑土中微生物的16S rRNA基因拷貝數(shù)，而無機(jī)肥對其影響不顯著；大豆種植季的16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于玉米種植季。有機(jī)肥配施無機(jī)肥的α多樣性指數(shù)高于無機(jī)肥；大豆種植季的α多樣性指數(shù)較玉米種植季的高。

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（責(zé)任編輯 楊鑫浩）

Responses of Micropopulation in Black Soil of Northeast China to Long-Term Fertilization and Crops

DING Jian-li1,2, JIANG Xin1,2, GUAN Da-wei1,2, MA Ming-chao1,2, ZHAO Bai-suo2, ZHOU Bao-ku3, CAO Feng-ming1,2, LI Li1,2, LI Jun1,2

(1Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Laboratory of Quality＆Safety Risk Assessment for Microbial Products, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;3Institute of Soil Fertility and Environmental Sources, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086)

【Objective】This experiment was carried out to investigate the characteristics of micropopulation in northeast China black soil under more 35 years of fertilization of two crop seasons. The effects of inorganic fertilizer and manure on the abundance and structure of micropopulation were identified. Black soil micropopulation responses to the interaction of long-term fertilization and crops would be revealed. This study will provide evidences for further enhancing fertilization and tillage method.【Method】Based on a long-term fertilization experiment carried out in Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, four different fertilization treatment samples in soybean and maize growing seasons were selected including samples without fertilizer (CK); manure (M); inorganic fertilizer (NPK); and inorganic fertilizers with manure (MNPK). Letter “m” before treatment represented maize season sample, and letter “s” represented soybean season sample. The Illumina Miseq sequencing and quantitative PCR of 16S rRNA gene were applied to analyze the effects of fertilization and cropson micropopulation in black soil. Correlation analysis was carried out between micropopulation and the soil properties.【Result】The 16S rRNA gene copy numbers in maize growing season (6.32×108-8.83×108/ng DNA) was lower than that in soybean growing season (0.96×109-2.30×109/ng DNA). Alpha diversity in maize growing season (ACE index was between 3 674.58-4 034.84) was lower than that of soybean season (ACE index was between 4 167.47-4 887.36), too. The top phylum was Acidobacteria (24.47%-27.90%) in maize growing season, but it was Proteobacteria (27.78%-34.40%) in soybean growing season. The relative abundances of Bacteroidetes and Actinobacteria were significantly different between two crop growing seasons. The 16S rRNA gene copy numbers in treatment of inorganic fertilizers with manure was greater than that of inorganic fertilizers. Alpha diversity in treatment of inorganic fertilizers with manure was higher than that of inorganic fertilizers (Chao1 index of sMNPK compared with that of sNPK was more 11.89%). The composition of micropopulation in different fertilization treatments of one crop growing season was different. The relative abundances of Alphaproteobacteria in sMNPK and sNPK compared with that of sCK were more 3.31% and 5.24%, Gammaproteobacteria in sMNPK and sNPK were higher 1.72% and 1.20% than that in sCK, and were sensitive to fertilizers. Correlation analysis showed that 16S rRNA gene copy number was positively correlated with soil NO3--N and available K, the diversity index and soil total N, NO3--N, NH4+-N, available P and available K were closely related. 【Conclusion】Results of the research demonstrated that of long-term different fertilizations and different crop growing seasons have effects on microbial richness, α diversity and community structure. Inorganic and organic fertilizers improved the soil pH, slowed down soil acidification, changed microbial structures, increased microbial richness and diversity as well as the metabolic activity of micropopulation.

fertilizer; crop; microbial community structure; soil chemical properties; high-throughput sequencing; black soil

2016-05-13；接受日期：2016-09-06

國家自然科學(xué)基金（41573066）、國家“973”計劃（2015CB150506）、國家“863”計劃（2013AA102802-04）、農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估專項任務(wù)（GJFP2016013）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-04）

丁建莉，E-mail：lndjl@126.com。通信作者姜昕，E-mail：jiangxin@caas.cn。通信作者李俊，E-mail：lijun01@caas.cn