姚紅娟, 周長(zhǎng)生, 劉秀河*, 王 君, 孫德林, 韓嬌霞

1.齊魯工業(yè)大學(xué), 濟(jì)南 250353;2.菏澤巨鑫源食品有限公司, 山東 菏澤 274415

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HPLC法測(cè)定蘆筍莖稈中蘆丁、槲皮素及白藜蘆醇含量

姚紅娟1, 周長(zhǎng)生2, 劉秀河1*, 王 君1, 孫德林2, 韓嬌霞2

1.齊魯工業(yè)大學(xué), 濟(jì)南 250353;2.菏澤巨鑫源食品有限公司, 山東 菏澤 274415

為了建立高效液相色譜法對(duì)蘆筍莖稈中蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇含量的測(cè)定方法。采用不同方法提取蘆筍莖稈中的蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇，得出甲醇法提取蘆丁、甲醇-HCl法提取槲皮素以及乙醇法提取白藜蘆醇得率最高；確定了高效液相色譜法對(duì)3種物質(zhì)的最佳色譜條件為流動(dòng)相：蘆丁為0.2 mol/L乙酸鈉-甲醇(Me-OH∶H2O=35∶65)溶液(用磷酸調(diào)pH 2.80)、槲皮素為無(wú)水甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45，V/V)，等梯度洗脫，白藜蘆醇為水和甲醇，二元線(xiàn)性梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為：254 nm、360 nm和306 nm；流速：0.8 mL/min、1.0 mL/min、0.8 mL/min。通過(guò)該方法測(cè)得蘆丁、槲皮素及白藜蘆醇的平均回收率分別為：98%、97%、98%。

蘆筍莖稈；蘆??；槲皮素；白藜蘆醇；高效液相色譜

蘆筍俗稱(chēng)石刁柏，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、氨基酸，具有防癌抗癌、降血壓血脂、排毒利尿、健腎、增強(qiáng)免疫力等功效[1～3]，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值是其他蔬菜和水果的幾倍甚至幾十倍，被世界衛(wèi)生組織定為“世界十大蔬菜之首”， 已開(kāi)發(fā)出蘆筍罐頭、蘆筍酒、蘆筍茶、蘆筍飲料、蘆筍調(diào)料、蘆筍藥品、蘆筍保健品等產(chǎn)品。但大量的蘆筍莖稈被當(dāng)作廢棄物丟掉，造成了資源的極大浪費(fèi)。有資料顯示，蘆筍莖稈中含有豐富的蘆丁、槲皮素等黃酮類(lèi)物質(zhì)、皂苷及白藜蘆醇等。其中，蘆丁是維生素P的重要組成部分，具有增強(qiáng)血管抵抗力、降低其通透性等作用[4]，同時(shí)可以祛痰、抗炎及治療糖尿病型白內(nèi)障[5]。槲皮素多以甙的形式存在，具有較好的化痰止咳功效[6]，同時(shí)，對(duì)于冠心病、高血壓有一定的治療作用[7]。此外，蘆筍莖稈中含有的白藜蘆醇，屬于植物體內(nèi)用于抵抗病原侵染的多酚物質(zhì)，具有多種生物活性[8]，除可以保護(hù)心血管系統(tǒng)、減少血小板凝集、延緩衰老外，還是預(yù)防癌癥的天然藥物[9～11]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的分析方法的研究有很多，主要有紫外分光光度法、HPLC法等[12～14]，但關(guān)于蘆筍莖稈中蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的測(cè)定方法研究鮮有報(bào)道。本文采用不同的方法提取了蘆筍莖稈中的蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇等營(yíng)養(yǎng)成分，并建立了HPLC測(cè)定方法，以期為建立更精確簡(jiǎn)便的測(cè)量方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：蘆筍莖稈來(lái)源于菏澤巨鑫源食品有限公司蘆筍基地，經(jīng)洗滌、烘干、切斷、粉碎和過(guò)篩(40目)處理，貯存于干燥器內(nèi)待用；試劑：蘆丁對(duì)照品(東京化成工業(yè)株式公社)、槲皮素對(duì)照品(SIGMA-ALDRICH)、白藜蘆醇對(duì)照品(上海同田生物對(duì)照品)、甲醇(色譜純)、乙醇、乙酸鈉、鹽酸、磷酸均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)，紫外檢測(cè)器；恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所)；pH計(jì)(上海凱達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠(chǎng))；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；分析天平(上海精密儀器儀表公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁的提取 精密稱(chēng)取1.0 g蘆筍莖稈樣品于50 mL容量瓶中，加入40 mL甲醇，在50℃的水浴鍋中提取5 h，提取過(guò)程中每隔30 min振蕩一次，然后用甲醇定容至刻度，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.2 槲皮素的提取 稱(chēng)取約0.6 g蘆筍莖稈樣品，精確稱(chēng)定，置于25 mL容量瓶中，先加4 mL 25% HCl溶液進(jìn)行溶解，再加入16 mL甲醇。最后將容量瓶放入65℃水浴鍋中，避光水解8 h。冷卻后，用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

1.3.3 白藜蘆醇的提取 精密稱(chēng)取3 g左右的蘆筍莖稈樣品，置于100 mL離心管中，加入30 mL 60%乙醇提取液，于均質(zhì)機(jī)中提取2 min，再以3 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，殘?jiān)儆?5 mL提取液提取1次，合并兩次濾液，用60%乙醇提取液定容至刻度，搖勻后，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.4 色譜條件

采用HPLC法對(duì)蘆筍莖稈中的蘆丁、槲皮素及白藜蘆醇含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，為了更準(zhǔn)確地獲得其含量，分別選用了適合自身的色譜條件。

1.4.1 蘆丁色譜條件 蘆丁色譜條件為紫外檢測(cè)器；色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：50℃；流動(dòng)相：0.2 mol/L乙酸鈉-甲醇(Me-OH∶H2O=35∶65)溶液，用磷酸調(diào)pH 2.80；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2 槲皮素色譜條件 槲皮素色譜條件為紫外檢測(cè)器；色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：30℃；流動(dòng)相：無(wú)水甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45，V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.3 白藜蘆醇 白藜蘆醇的色譜條件是Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)的色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.8 mL/min；梯度洗脫：前5 min流動(dòng)相B(甲醇)由35%變?yōu)?0%，5～11 min又變?yōu)?0%，11～15 min變?yōu)?00%，15～16 min由100%降為35%，16～30 min保持35%不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

目前關(guān)于提取蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的方法有很多，但這些方法提取時(shí)間較長(zhǎng)，效果不明顯。本文分別選取甲醇、甲醇-25%HCl及60%乙醇作為蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的提取溶劑，與80%乙醇法和熱水浸提法提取蘆丁，甲醇法和水浸提取法提取槲皮素，堿提酸沉法和冷浸提取法提取白藜蘆醇的效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明(表1)，蘆丁提取得率:甲醇法>80%乙醇提取法>熱水浸提法，槲皮素提取得率:甲醇-HCl法>甲醇法>水浸提取法，白藜蘆醇提取得率:60%乙醇法>堿提酸沉法>冷浸提取法。故本實(shí)驗(yàn)最終選用甲醇提取蘆筍莖稈中蘆丁，甲醇-25% HCl提取槲皮素，60%乙醇提取白藜蘆醇。

2.2 各對(duì)照品的HPLC圖譜分析

分別精確稱(chēng)取一定量的蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇對(duì)照品，用甲醇配成一系列的濃度梯度。按照1.4色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1～3。得到的回歸方程為：蘆丁A=31 604C-5 815.2(r=0.999 9)，槲皮素A=49 234C-1 494.6(r=0.998 6)，白藜蘆醇A=131 881C-27 249(r=0.998 4)。

表1 不同提取方法提取營(yíng)養(yǎng)成分的含量Table 1 The nutrients content of different extraction methods.

注：同一列中不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

圖1 蘆丁對(duì)照品色譜圖Fig.1 The chromatogram of rutin standard solution.

2.3 精密度試驗(yàn)

分別將濃度為8 μg/mL的蘆丁對(duì)照品、4 μg/mL的槲皮素對(duì)照品和20 μg/mL的白藜蘆醇對(duì)照品按照1.4色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄各成分的保留時(shí)間及測(cè)定量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表2。3種物質(zhì)的保留時(shí)間及含量的RSD均低于3%，表明該實(shí)驗(yàn)的精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將按1.3方法制備的3份蘆筍莖稈樣品溶液，于1.4色譜條件下每1 h進(jìn)一次樣，每份樣液共進(jìn)樣5次，通過(guò)峰面積計(jì)算其含量，結(jié)果測(cè)得蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的含量見(jiàn)表3。樣液中蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇含量的RSD均低于3%，表明樣品溶液在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 槲皮素對(duì)照品色譜圖Fig.2 The chromatogram of quercetin standard solution.

圖3 白藜蘆醇對(duì)照品色譜圖Fig.3 The chromatogram of resveratrol standard solution.

對(duì)照品名稱(chēng)保留時(shí)間(min)RSD%(n=5)平均含量(μg)RSD%(n=5)蘆丁11.569±0.0710.610.0783±0.00081.09槲皮素7.621±0.0700.920.0397±0.00030.76白藜蘆醇10.506±0.0600.570.1940±0.00472.44

表3 蘆筍莖稈中各營(yíng)養(yǎng)成分的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability testing of nutrients in asparagus stalk.

2.5 方法的回收率試驗(yàn)

選取已知蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇含量的蘆筍莖稈樣品，相應(yīng)加入各對(duì)照品0.2 mg、0.011 7 mg和0.05 mg，按1.3提取方法制備樣液，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定做5個(gè)重復(fù)，通過(guò)外標(biāo)法定量測(cè)定回收率和方法的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表4。樣品色譜圖見(jiàn)圖4～6。

結(jié)果顯示，蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇的回收率在95%～100%之間，RSD均小于2%，表明該法的回收率和精密度可滿(mǎn)足蘆筍莖稈中蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇含量的測(cè)定需求。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of the recovery experiment.

圖4 蘆筍莖稈中蘆丁色譜圖Fig.4 The chromatogram of rutin in asparagus stems.

圖5 蘆筍莖稈中槲皮素色譜圖Fig.5 The chromatogram of quercetin in asparagus stems.

圖6 蘆筍莖稈中白藜蘆醇色譜圖Fig.6 The chromatogram of resveratrol in asparagus stems.

3 討論

蘆筍作為“蔬菜之王”，其廢棄莖稈中含有的蘆丁、槲皮素以及白藜蘆醇成分，具有維護(hù)心血管健康、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)脂蛋白等功效。選擇有效的提取方法以及合適的檢測(cè)方法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定對(duì)以后蘆筍莖稈的開(kāi)發(fā)利用具有重要的意義。

由于蘆丁、槲皮素和白藜蘆醇難溶甚至不溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑，因此在選取樣品提取劑時(shí)，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和提取率問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇和乙醇作為提取溶劑，尤其在槲皮素提取時(shí)，由于純甲醇提取得到的槲皮素純度較低，多以甙的形式存在，因此需加入25%HCl進(jìn)行酸水解[15]。

此外，本研究建立了高效液相色譜法對(duì)蘆筍莖稈中的蘆丁、槲皮素以及白藜蘆醇含量進(jìn)行檢測(cè)分析，并對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。在測(cè)定蘆丁含量時(shí)，選取0.2 mol/L乙酸鈉-甲醇(Me-OH∶H2O=35∶65)溶液(用磷酸調(diào)pH 2.80)作為流動(dòng)相，較朱立華等[16]采用甲醇-磷酸(60∶40，V/V)為流動(dòng)相，峰型更理想。對(duì)槲皮素流動(dòng)相進(jìn)行選擇時(shí)，發(fā)現(xiàn)在甲醇中加入0.4%磷酸，較劉明月等[17]以純甲醇為流動(dòng)相，更利于改善其分離度。而采用甲醇-水的梯度洗脫，與吳向陽(yáng)等[9]以甲醇-水(45∶55，V/V)的等梯度洗脫相比，不僅可以提高白藜蘆醇的分離能力，還有利于改善峰型、抑制拖尾的現(xiàn)象。本方法方便、快捷，樣品回收率和精密度高，可用于蘆筍莖稈中蘆丁、槲皮素以及白藜蘆醇含量的測(cè)定。

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HPLC Determination of Rutin, Quercetin and Resveratrol Content in Asparagus Stems

YAO Hong-juan1, ZHOU Chang-sheng2, LIU Xiu-he1*, WANG Jun1, SUN De-lin2, HAN Jiao-xia2

1.QiluUniversityofTechnology,Jinan250353,China;2.HezeJuxinyuanFoodCompany,ShandongHeze274415,China

In order to establish a HPLC method to determinate its content of rutin, quercetin and resveratrol. The study used different methods to extract rutin, quercetin and resveratrol from asparagus stems, the results showed that methanol, methanol-HCl and ethanol had the best extraction rate for rutin, quercetin and resveratrol extraction. And it chose the optimum chromatographic conditions of HPLC method: The mobile phases of rutin and quercetin were 0.2 mol/L sodium acetate-methanol (Me-OH∶H2O=35∶65) solution (pH 2.80 adjusted with phosphoric acid), anhydrous methanol-0.4% phosphoric acid solution (55∶45, V/V), isocratic elution, and resveratrol mobile phase was water and methanol, binary linear gradient elution, respectively. Their detection wavelength was 254 nm, 360 nm and 306 nm, and velocity of flow was 0.8 mL/min, 1.0 mL/min and 0.8 mL/min. The average recoveries of rutin, quercetin and resveratrol were 98%, 97% and 98%.

asparagus stems; rutin; quercetin; resveratrol; HPLC

2016-01-19; 接受日期：2016-05-24

姚紅娟，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail:YQK0606@163.com。*通信作者：劉秀河，教授，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail:liuxh661188@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.06.14