張夢玲，張晉，熊善柏，趙思明，劉茹，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢430070）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶及其在魚糜制品加工中的應(yīng)用

張夢玲1，2，張晉1，2，熊善柏1，2，趙思明1，2，劉茹1，2，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070；2.國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢430070）

通過比較分析魚內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Fish endogenous transglutaminase，F(xiàn)TGase）和微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Microbial transglutaminase，MTGase）的性質(zhì)和作用機(jī)理的異同。在此基礎(chǔ)上探討影響轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）作用的因素（熱處理方式、酶活促進(jìn)劑、酶活抑制劑）及在魚糜制品加工中的應(yīng)用（改善凝膠特性、提高營養(yǎng)價值、提高持水性），并對TGase在今后的研究方向進(jìn)行了展望，以期為TGase在魚糜制品加工中的開發(fā)利用提供參考。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；魚糜；凝膠；影響因素；應(yīng)用

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）可催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的共價交聯(lián)[1]，提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[2]及膠凝性質(zhì)[3]。早在20世紀(jì)50年代，就有學(xué)者從動物組織中提取分離出TGase，1989年日本味之素公司將動物性來源的TGase投放市場，1992年Ando發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬中的其他一些菌株也能產(chǎn)生TGase，并對發(fā)酵過程進(jìn)行了優(yōu)化，使得該酶的產(chǎn)量有了大幅度提高，從而為食品工業(yè)利用此酶創(chuàng)造了條件。

魚糜凝膠性能是衡量其品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，為改善其凝膠性能，常添加磷酸鹽、非肌肉蛋白、淀粉、親水膠體等。然而磷酸鹽過量攝入會降低鈣的吸收，導(dǎo)致人體骨骼組織中鈣的流失[4]。非肌肉蛋白中，谷朊粉會使凝膠變得硬而脆，降低凝膠彈性[5]；大豆分離蛋白易導(dǎo)致魚糜制品白度下降而偏黃[6]。添加淀粉的魚糜制品在常溫下較黏，冷藏后變得又硬又脆，缺乏柔韌感[7]；黃原膠雖能提高魚糜嫩度和白度，但不能改善凝膠特性；結(jié)冷膠易與高價金屬離子結(jié)合，導(dǎo)致魚糜顏色偏暗[8]；當(dāng)pH值小于7.0，魔芋膠需要與碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀等聯(lián)合使用，否則不能發(fā)生脫乙?；磻?yīng)，不利于凝膠的形成[9]。而TGase能改善上述添加物在魚糜制品加工中的局限，以其獨(dú)特的優(yōu)勢在魚糜制品中應(yīng)用的越來越廣泛。

1 魚糜制品加工中常見TGase的種類和性質(zhì)

魚內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Fish endogenous transglutaminase，F(xiàn)TGase）和微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（MTGase）是魚糜制品加工中常見的兩種TGase，其來源不同，性質(zhì)存在很大的差異。FTGase普遍存在于魚的肝臟、肌肉、魚卵等中（見表1）。其分子量一般在66 kDa～95 kDa，活性中心均包含一個Cys-His-Asp或者Cys-His-Asn的三分子序列[10]。在酰胺轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程中，F(xiàn)TGase活性中心的半胱氨酸的硫醇與谷氨酸殘基形成硫代硫酯中間體，然后酰胺基團(tuán)轉(zhuǎn)移到賴氨酸殘基上[11]。具有催化活性的半胱氨酸位于兩個色氨酸橋接形成的疏水性通道中，谷氨酸從疏水性通道的一端接近活性半胱氨酸，賴氨酸從另一端靠近催化活性半胱氨酸并形成穩(wěn)定的反應(yīng)四面體，保持在疏水性通道中形成異肽交聯(lián)鍵[12]。隨著ε-（γ-Gln）-Lys異肽交聯(lián)鍵的形成，疏水性通道打開形成一個連續(xù)性的凹槽以釋放形成的產(chǎn)物[13]。FTGase在未被激活狀態(tài)下，“色氨酸橋”阻止反應(yīng)底物進(jìn)入疏水性通道，當(dāng)與Ca2+綁定后，發(fā)生形變，結(jié)構(gòu)顯著擴(kuò)展[14-15]，打開控制底物與活性中心接觸的兩個疏水性色氨酸殘基，其活力才能被激活[16]，故FTGase需要Ca2+激活。另外，F(xiàn)TGase含量少，提純工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，因此很少提純后用于工業(yè)生產(chǎn)，主要通過調(diào)節(jié)工藝條件激活FTGase來提高魚糜的凝膠性能[17]。

MTGase為球狀單體蛋白，分子量為23kDa～45kDa，多數(shù)為40 kDa左右，約為FTGase的一半。其二級結(jié)構(gòu)含22%α-螺旋和33.1%β-折疊，存在兩個糖基化位點(diǎn)（-Thr-Xxx-Asn-），具有高度的親水性，在蛋白質(zhì)分子的邊緣有一個很深的裂縫，酶活中心的Cys殘基位于裂縫的底部。這種位置安排即使沒有Ca2+條件下，MTGase也可充分接觸溶劑，催化底物快速反應(yīng)[28-29]。TGase作用的良好底物如肌漿蛋白易被Ca2+沉淀，MTGase不需要Ca2+激活的特性使其在食品加工中具有更顯著的優(yōu)勢[30]。并且MTGase屬于胞外酶，易于分離純化，還具有較高的熱穩(wěn)定性和抗凍能力，40℃處理10min后活性無顯著性變化，即使在50℃處理10min后仍有74%的殘余酶活性[29]；在-20℃下保存數(shù)月酶活僅損失10%，并且經(jīng)過純化處理后穩(wěn)定性更強(qiáng)，其適宜的pH值為6.0～7.0[30]。與FTGase相比，MTGase底物特異性低，對Ca2+無依賴性，催化活力、親水性和熱穩(wěn)定性都較強(qiáng)，pH范圍廣[29]，且其來源廣、生產(chǎn)成本低[31]，這些性質(zhì)決定了MTGase在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，目前MTGase主要來源于輪枝鏈霉菌[28]。

表1 不同魚種來源的的轉(zhuǎn)谷氨酸酰胺酶的性能Table1 TGase properties from different fish species

2 TGase作用機(jī)理

TGase是一種轉(zhuǎn)酰胺酶，在催化反應(yīng)中肽鏈上谷氨酰殘基的γ-酰氨基是酰基供體，而?；荏w可以為賴氨酸的ε-氨基、伯胺和水3類（見表2），據(jù)此可將反應(yīng)歸為3類：（1）蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜镏写嬖贚ys殘基時，TGase催化Gln殘基的γ-羧酰胺基與Lys殘基的ε-氨基反應(yīng)，生成ε-（γ-Gln）-Lys異型肽鍵，使蛋白質(zhì)發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)反應(yīng)，改善魚糜制品的凝膠強(qiáng)度和持水性[2]。（2）?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜镏胁淮嬖贚ys殘基，但存在伯氨基時，TGase催化Gln殘基的γ-羧酰胺基轉(zhuǎn)移到伯氨基的R基團(tuán)上，發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)[32]。利用該反應(yīng)可以使蛋白質(zhì)連接一些限制性氨基酸，從而提高食物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。（3）脫酰基反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜镏屑葲]有Lys殘基，也沒有伯氨基時，TGase催化Gln殘基的γ-羧酰胺基與水反應(yīng)，脫去酰胺基生成谷氨酸殘基。該反應(yīng)可以改變蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、溶解度等[29-30]，并且因?yàn)樯晒劝彼釟埢?，還可起到改善魚糜制品風(fēng)味的作用[33-34]。雖然3種催化反應(yīng)同時進(jìn)行，但以蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于?；D(zhuǎn)移和脫酰基反應(yīng)速率[2]，故TGase催化反應(yīng)以蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)為主，這一性質(zhì)有利于魚糜形成熱穩(wěn)定性不可逆凝膠。

表2 TGase催化反應(yīng)及其對魚糜制品功能特性的影響Table2 Reactions catalysed by TGaseand itsm echanism sof action inm odifying the functionalpropertiesof surim iproductions

3 影響TGase作用效果因素

3.1 熱處理方式

TGase的作用效果不僅與作用溫度有關(guān)，還受底物蛋白分子的展開程度的影響。一般而言，TGase在37℃～40℃下活力高，短時間（1 h）凝膠化處理就可獲得高程度的異肽交聯(lián)[34]。與此同時，肌球蛋白對溫度比較敏感，低溫下肌球蛋白分子構(gòu)象也會發(fā)生變化。因此適當(dāng)延長中低溫凝膠化時間（0 h～8 h），肌球蛋白分子逐漸伸展，TGase與底物蛋白的作用位點(diǎn)增加，可提高TGase共價交聯(lián)的程度[35]。

3.2 TGase活性促進(jìn)劑

Ca2+對FTGase具有很好的激活作用，而對MTGase影響較小。在魚糜制品加工中常添加的鈣鹽有乳酸鈣、檸檬酸鈣、硫酸鈣、酪蛋白酸鈣、CaCl2等[36]。對于阿拉斯加鱈魚來說，添加0.05%醋酸鈣或CaCl2即可獲得最佳的凝膠性能，而對于溶解度較差的乳酸鈣則需0.1%的添加量，說明鈣鹽溶解性越好對魚糜凝膠的增強(qiáng)效果越顯著[36]。隨后不少學(xué)者選用溶解度較好的CaCl2，研究離子態(tài)鈣對魚糜及魚蛋白凝膠性能的影響，發(fā)現(xiàn)10mmol/kg～20mmol/kg的CaCl2可激活FTGase，催化MHC之間的共價交聯(lián)，但當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到50mmol/kg時會增大其空間位阻，導(dǎo)致MHC交聯(lián)受阻，抑制凝膠形成[37]。鈣鹽對魚糜凝膠性能的增強(qiáng)作用也會因魚種而異，對于阿拉斯加鱈魚來說，添加0.1%乳酸鈣其凝膠特性最佳，而對于太平洋鱈魚而言，則需添加0.2%乳酸鈣[38]。綜上分析可知，目前對于鈣鹽及其復(fù)合物對FTGase的影響主要是從離子態(tài)鈣的影響角度來分析的。魚骨等新型天然鈣源的開發(fā)，對副產(chǎn)物的高效利用和減少環(huán)境的污染具有重要意義。魚骨鈣大多以羥基磷灰石存在且與膠原蛋白有機(jī)結(jié)合，溶出量甚微。目前主要以酸水解法[39]、酶水解法[40]、高壓處理[41]促進(jìn)魚骨中鈣的溶出。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)對魚骨進(jìn)行微?；幚硪彩谴龠M(jìn)鈣釋放的手段之一[42]。當(dāng)魚骨粒徑為微米級時，不僅不能改善魚糜的凝膠性能，反而阻礙魚肉蛋白網(wǎng)絡(luò)的形成[43]。當(dāng)魚骨粒徑將至納米尺寸時，魚骨鈣可激活FTGase，進(jìn)而改善魚糜的凝膠性能[44]。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，與CaCl2相比，納米魚骨中僅有少部分鈣是以離子態(tài)的形式存在，對FTGase的激活效果相對較弱，但其對魚糜凝膠性能的提高效果卻優(yōu)于CaCl2[45]，推測存在如下兩個方面的原因：（1）微?；~骨的小尺寸效應(yīng)，特別是當(dāng)魚骨粒度降至納米級別時，由于尺寸區(qū)域而展現(xiàn)出不同于宏觀材料的理化性質(zhì)；（2）魚骨鈣賦存形態(tài)的轉(zhuǎn)化，在加熱過程中，微粒化魚骨可能存在著鈣的游離態(tài)與結(jié)合態(tài)之間的轉(zhuǎn)化平衡。

此外，二硫蘇糖醇（DTT）、半胱氨酸、亞硫酸鹽，可以改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，使其更利于TGase催化交聯(lián)[46]，β-巰基乙醇也可以增加TGase酶活，然而，β-巰基乙醇有劇毒，僅用于機(jī)理研究。

3.3 TGase活性抑制劑

金屬離子中Zn2+、Cu2+、Pb2+對TGase有很強(qiáng)的抑制作用，而Ni2+、Co2+、Fe2+可中度抑制TGase活性[29]，這些金屬離子因不同程度地束縛了半胱氨酸的硫醇基團(tuán)而降低TGase的活性[47]。N-甲基順丁烯亞胺（NEM）、NH4Cl（AC）、乙二胺四乙酸（EDTA）對TGase活性也具有抑制作用，NEM阻斷TGase活性中心Cys殘基上的活性巰基，AC能通過提高NH4+濃度直接抑制TGase催化的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)。EDTA通過兩種機(jī)制抑制TGase活性：（1）作為巰基烷化劑，能與TGase活性位置的巰基反應(yīng)使之烷化，進(jìn)而降低酶活，（2）通過螯合Ca2+降低FTGase活性，該機(jī)制對MTGase無影響[46]。劉海梅等[48]研究認(rèn)為以上3種抑制劑對鰱魚糜凝膠形成的抑制效果依次是AC﹥NEM﹥EDTA，說明阻斷?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的進(jìn)行比降低TGase活性更能有效抑制肌球蛋白重鏈（MHC）的交聯(lián)反應(yīng)。對于海水魚而言，抑制效果順序相反，依次是EDTA﹥NEM﹥AC[49]，說明抑制劑對于不同來源的魚種抑制效果存在差異，從側(cè)面證明了TGase是魚糜凝膠化過程中起作用的關(guān)鍵酶。

4 TGase在魚糜制品加工中的應(yīng)用

4.1 改善魚糜制品的凝膠特性

大部分魚種體內(nèi)FTGase含量不高，且具有水溶性，水中漂洗可部分去除，在最終的魚糜制品中僅有44%FTGase保存下來[33]，在加工中，可通過激活或抑制FTGase來調(diào)節(jié)魚糜的凝膠性能。魚糜凝膠通常采用的兩段式加熱，其凝膠化過程主要就是為了使FTGase充分交聯(lián)而提高魚糜的凝膠性能[44]。而檸檬酸、EDTA、多聚磷酸鹽等的添加會螯合鈣離子而抑制凝膠的形成，降低魚糜的凝膠性能[50]。為進(jìn)一步提高魚糜的凝膠性能，可適量添加MTGase，例如，添加MTGase后再凝膠化，可顯著提高魚糜的破斷強(qiáng)度、凹陷深度、凝膠強(qiáng)度和彈性[51]。MTGase還可用于碎魚肉的重組織化，催化肌球蛋白重鏈交聯(lián)反應(yīng)，增加魚糜的凝膠強(qiáng)度[52]。MTGase添加量過大時，魚肉分子表面的作用位點(diǎn)與MTGase接觸機(jī)會多，會很快被交聯(lián)形成致密的牢固的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而阻礙了MTGase進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部，導(dǎo)致魚糜凝膠強(qiáng)度的下降[47，53]。所以，在使用MTGase時，必須注意適量添加。

與此同時，酪蛋白、明膠等含有大量Lys殘基和Gln殘基的蛋白質(zhì)可為魚肌球蛋白與TGase的共價交聯(lián)提供Lys-和Gln-基團(tuán)。因此，魚糜制品生產(chǎn)加工中，常加入酪蛋白、明膠等添加劑與魚糜復(fù)合使用，促進(jìn)TGase交聯(lián)程度。Na+、K+、Mg2+、Mn2+和Ba2+等離子適量使用可顯著提高魚糜的凝膠性能，其中，0.3mol/L～0.5 mol/L的NaCl促進(jìn)肌原纖維蛋白溶出，提高與TGase作用的底物濃度，同樣可促進(jìn)交聯(lián)[54]。

4.2 提高魚糜制品的營養(yǎng)價值

TGase通過催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)反應(yīng)將限制性氨基酸（如谷氨酸，賴氨酸）連接到魚糜蛋白質(zhì)上，防止美拉德反應(yīng)對氨基酸的破壞[47]；同時，ε-（γ-Gln）-Lys異型肽鍵可被腎臟、小腸刷狀緣細(xì)胞及血液中的γ-谷氨環(huán)化轉(zhuǎn)移酶分解為賴氨酸和谷氨酸[29，55]，可在體內(nèi)正常代謝，從而提高魚糜及其制品的營養(yǎng)價值。與此同時，酪蛋白與魚糜的復(fù)配使用不僅可以促進(jìn)TGase的交聯(lián)程度、提高魚糜的凝膠強(qiáng)度（見4.1），也可提高魚糜制品的營養(yǎng)價值。

4.3 增強(qiáng)魚糜制品的持水能力

持水性是評價魚糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)[56]，當(dāng)MTGase添加量為0～450U/kg時，魚糜凝膠持水性隨MTGase添加量的增加而上升，添加300U/kgMTGase可使其持水性從88%提高到92%[57]，這是因?yàn)镸TGase可使蛋白質(zhì)分子間形成異型肽鍵及致密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而束縛包埋水分子，提高魚糜凝膠的持水性[2]。繼續(xù)增加TGase的添加量并不會提高魚糜凝膠的持水性，過量反而造成持水性下降，這是因?yàn)椋?）底物濃度一定后，酶促反應(yīng)達(dá)到一定程度后趨于平緩[57]，（2）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)與水之間的相互作用減弱[58]。

5 展望

隨著對TGase性能研究的深入，TGase在魚糜制品中的應(yīng)用仍在不斷擴(kuò)大，今后對于TGase的研究在如下幾個方面尚需進(jìn)一步加強(qiáng)：（1）開發(fā)以魚骨為代表的天然低價優(yōu)質(zhì)鈣源，探討其與化學(xué)合成鈣對FTGase激活效果及其對凝膠品質(zhì)影響的異同，為副產(chǎn)物的高效利用提供思路。且化學(xué)合成鈣大多數(shù)具有苦味，大量添加會產(chǎn)生不愉快的口感，天然鈣源能否突破這一局限也是未來研究的方向。（2）FTGase易溶于水，漂洗過程中存在大量損失，因此如何減少漂洗過程中FTGase的損失，并提高FTGase的作用效果將具有重要意義。（3）風(fēng)味釋放是近年來食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，研究TGase如何誘導(dǎo)蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，以及凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)與魚糜風(fēng)味釋放的聯(lián)系，將具有廣闊的前景。

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Transglutam inase and Its App lication in Processing of Surim i Product

ZHANGMeng-ling1，2，ZHANG Jin1，2，XIONGShan-bai1，2，ZHAOSi-ming1，2，LIURu1，2，*
（1.Collegeof Food Scienceand Technology，Huazhong AgriculturalUniversity，Wuhan 430070，Hubei，China；2.NationalResearch and DevelopmentBranch Center forConventional Freshwater Fish Processing，Wuhan 430070，Hubei，China）

Thispapersummarized the propertiesand actionmechanism of fish endogenousandmicrobial transglutaminase，then italso discussed its influencing factors（heating，activorsand inhibitorsof transglutaminase）and applications（modificationsofgelproperties，nutritionalvalue and waterholding capacity）.Finally，its future development tendencieswere proposed，so as to provide reference on application of transglutaminase in surimiproductprocessing.

transglutaminase（TGase）；surimi；gel；influencing factors；application

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.046

2016-03-14

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471686）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-46-23）

張夢玲（1991—），女（漢），碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通信作者：劉茹，副教授，博士，研究方向：水產(chǎn)品加工及貯藏工程。