郭蓮娣，王 丹，李佳川，王 鑫，王小軍

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549對(duì)紫杉醇耐藥機(jī)理研究

郭蓮娣1，王 丹1，李佳川1，王 鑫2，王小軍2

(1.西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

目的利用非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥株A549/taxol，研究其對(duì)紫杉醇耐藥性的分子機(jī)理.方法通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間低濃度的紫杉醇處理A549細(xì)胞的方法獲得其耐藥細(xì)胞株A549/taxol，提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀(guān)察其凋亡基因的表達(dá)情況，并通過(guò)不同siRNA處理細(xì)胞進(jìn)行基因沉默，研究其在不同遺傳背景下對(duì)紫杉醇的耐受情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥株A549/taxol的基因表達(dá)紊亂，表現(xiàn)為ING5的高表達(dá)抑制了凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平，而B(niǎo)cl-2是紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所必需的.結(jié)論以上結(jié)果初探了A549對(duì)紫杉醇耐藥性的機(jī)制，為探尋紫杉醇化療新策略提供了新的思路.

非小細(xì)胞肺癌；紫杉醇；Bcl-2；ING5

紫杉醇是一類(lèi)二萜類(lèi)生物堿，是目前最有效的植物抗癌藥之一，最早是由Wani等在1971年從主要分布在美國(guó)北部的短葉紅豆杉的樹(shù)皮中分離出來(lái)并命名的[1].紫杉醇(taxol)是一種廣譜的抗癌化療藥物，對(duì)某些晚期的惡性腫瘤如肺鱗癌、肺腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等有較好的療效，因此廣泛地用于抗腫瘤的臨床治療[2].紫杉醇結(jié)合在微管蛋白的N端，抑制其解聚，從而破壞微管和微管蛋白二聚體之間的動(dòng)力學(xué)平衡，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制有絲分裂最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3].由于獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制，紫杉醇成為近年最常用的化療藥物之一，但仍然有許多惡性腫瘤對(duì)其存在耐藥性.該耐藥性的機(jī)制尚不明確，但主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面.一是微管蛋白的突變，Monzo M等從43例接收紫杉醇化療的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的組織中提取DNA，發(fā)現(xiàn)其中33%的患者中β-微絲蛋白基因存在突變，且其化療有效率為0[4].另一個(gè)方面是其他基因特別是凋亡通路基因表達(dá)的改變，紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡依賴(lài)于Raf-1/Bcl-2、P28、caspases-3等重要凋亡基因，如果這些基因或通路缺陷，將大大降低紫杉醇的化療效果[5，6].由此可見(jiàn)，尋找新的化療策略是紫杉醇臨床治療中一個(gè)亟待解決的問(wèn)題.

ING5(Inhibitor of growth protein 5)是ING家族中一個(gè)重要的抑癌基因，在DNA損傷修復(fù)，染色質(zhì)重塑和細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程中起重要作用[7].ING5的NCR結(jié)構(gòu)域能與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，同時(shí)，它能與P53和EP300結(jié)合參與細(xì)胞凋亡通路[8-10].本研究通過(guò)深入探討非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549對(duì)紫杉醇的耐藥分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ING5導(dǎo)致的Bcl-2表達(dá)降低是造成A549對(duì)紫杉醇耐藥的關(guān)鍵因素，同時(shí)沉默ING5聯(lián)用紫杉醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的化療增敏，為探尋紫杉醇化療新策略奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院基因組穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；轉(zhuǎn)染試劑Turbo infection購(gòu)自Thermo；紫杉醇購(gòu)自sigma；RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)-mega；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Promega；siRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建

在正常傳代的A549細(xì)胞株中始終加入低濃度的紫杉醇(0.1μM)篩選細(xì)胞，一個(gè)月后將單個(gè)細(xì)胞鋪在96孔板中，加入較高濃度的紫杉醇(5μM)篩選.將能形成克隆的細(xì)胞用不含紫杉醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)后鑒定其對(duì)不同濃度紫杉醇的敏感性，篩選出具有紫杉醇耐藥性的細(xì)胞克隆.

1.2.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個(gè)細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并梯度稀釋至每個(gè)10cm培養(yǎng)皿中接種100，200，500個(gè)單個(gè)細(xì)胞，加入10 ml培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周左右.當(dāng)在顯微鏡下能觀(guān)察到明顯的細(xì)胞克隆形成時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用PBS小心地洗兩次，加入醋酸/甲醇(1:3)固定5 min.棄掉固定液，在吉姆薩染色液染色20 min后洗掉染液，吹干后與菌落計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，計(jì)算出存活率.

1.2.3 基因的表達(dá)

用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心并用PBS洗兩次，利用Omega RNA提取試劑盒抽提細(xì)胞總RNA.測(cè)定濃度后取1μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，一步法37℃孵育1h獲得cDNA，采用Promega qPCR試劑盒及Bio-Rad CFX96熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR分析.

2 結(jié)果

2.1 Bcl2及ING5在A549紫杉醇耐藥細(xì)胞中表達(dá)異常

通過(guò)長(zhǎng)期低濃度的紫杉醇處理獲得了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549耐紫杉醇細(xì)胞系A(chǔ)549/taxol，其對(duì)紫杉醇的敏感度大幅度降低，存活率升高(圖1，a).為了探尋A549/taxol細(xì)胞系對(duì)紫杉醇耐藥的分子機(jī)理，我們篩選了大量細(xì)胞周期及凋亡通路蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)抑癌基因ING5的表達(dá)異常升高，而凋亡通路信號(hào)蛋白Bcl-2的表達(dá)大幅度降低，其他的基因幾乎不受影響(圖1，b)，提示A549/taxol的耐藥性可能是Bcl-2及ING5異常表達(dá)引起的.

2.2 平衡Bcl-2及ING5的表達(dá)水平能逆轉(zhuǎn)A549/ taxol對(duì)紫杉醇的耐藥

為了證實(shí)Bcl-2及ING5對(duì)A549/taxol耐藥性的影響，利用基因沉默ING5及過(guò)表達(dá)Bcl-2的方法重新平衡A549/taxol細(xì)胞中基因表達(dá)的水平，發(fā)現(xiàn)能逆轉(zhuǎn)其對(duì)紫杉醇的抗性，表明其耐藥性來(lái)自于Bcl-2及ING5基因表達(dá)的紊亂(圖2，a).有意思的是，在A549細(xì)胞中沉默ING5后Bcl-2的表達(dá)水平明顯增高，反之過(guò)表達(dá)ING5導(dǎo)致Bcl-2的表達(dá)大幅度降低，證明Bcl-2的基因表達(dá)受到ING5的負(fù)相關(guān)調(diào)控(圖2，b).

圖1 A549/taxol耐藥細(xì)胞系中基因表達(dá)Fig.1 Analysis of the gene expression of cell line A549/taxol

圖2 ING5的表達(dá)水平對(duì)A549/taxol細(xì)胞的耐藥性及Bcl-2表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different expression level of ING5 on taxol resistance and expression of Bcl-2 in A549/taxol cell.

2.3 Bcl-2是A549/taxol細(xì)胞系耐藥的效應(yīng)蛋白

在A549/taxol細(xì)胞系中沉默Bcl-2并不能改變其對(duì)紫杉醇的敏感性，表明Bcl-2是紫杉醇誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡所必需的.重要的是，同時(shí)沉默ING5及 Bcl-2并不能逆轉(zhuǎn)A549/taxol細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥性，表明其耐藥的效應(yīng)蛋白是Bcl-2.由于ING5的高表達(dá)導(dǎo)致Bcl-2的水平降低，從而抑制了由Bcl-2介導(dǎo)凋亡通路，產(chǎn)生對(duì)紫杉醇的耐受(圖3).

圖3 不同的ING5及Bcl-2表達(dá)水平對(duì)A549/taxol細(xì)胞耐藥性的影響(?P＜0.05；??P＜0.01)Fig.3 Effect of different expression level of ING5 and Bcl-2 on taxol resistance of A549/taxol cell(?P＜0.05；??P＜0.01)

3 討論

惡性腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性一致是腫瘤臨床治療的難點(diǎn)，紫杉醇作為最常用的廣譜化療藥物，主要通過(guò)破壞微管的動(dòng)力學(xué)平衡后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的激活而抑制腫瘤.這個(gè)過(guò)程依賴(lài)于Bcl-2蛋白的磷酸化[11-12]，在Bcl-2缺陷的細(xì)胞系中，紫杉醇往往不能誘導(dǎo)其凋亡，表現(xiàn)為對(duì)紫杉醇的耐藥性.Bcl-2需要與BAX結(jié)合形成異源二聚體從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[13-15]，然而在紫杉醇耐藥細(xì)胞株A549/taxol中并未發(fā)現(xiàn)BAX的表達(dá)異常，這與Bcl-2是其耐藥性的效應(yīng)蛋白是一致的.ING5在耐藥細(xì)胞株中高度表達(dá)抑制了Bcl-2的基因表達(dá)，這是A549/taxol產(chǎn)生耐藥性的重要原因，然而ING5負(fù)相關(guān)調(diào)控Bcl-2基因表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究.

我國(guó)是腫瘤大國(guó)，紫杉醇在腫瘤治療的化療過(guò)程中被廣泛使用，但紫杉醇耐藥性一直是困擾臨床治療多年的一個(gè)重要問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)其耐藥機(jī)理，開(kāi)發(fā)新的化療策略是其化療過(guò)程中一個(gè)急需解決的關(guān)鍵技術(shù).本文通過(guò)構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株A549/ taxol，發(fā)現(xiàn)其相關(guān)凋亡基因ING5及Bcl-2的表達(dá)異常，證實(shí)了其耐藥性的分子機(jī)理是由于ING5負(fù)調(diào)控Bcl-2導(dǎo)致的相關(guān)細(xì)胞凋亡通路缺陷造成的，為探尋紫杉醇化療新策略奠定了重要的理論基礎(chǔ)，提供了新的思路.

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(責(zé)任編輯:李建忠，付強(qiáng)，張陽(yáng)，羅敏；英文編輯:周序林，鄭玉才)

GUO Lian-di1，WANG Dan1，LI Jia-chuan1，WANG Xin2，WANG Xiao-jun2
(1.School of Pharmacy，Southwest University of Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.；2.West China Second University Hospital of Sichuan University，Chengdu 610041，P.R.C.)

Objective To study the mechanism of taxol resistance of A549，the taxol resistant cell line A549/taxol was used.Methods The taxol resistant cell line A549/taxol was constructed by low concentration and long time treatment of taxol.The apoptosis gene expressions were detected by qPCR of cDNA reverse transcripted from the total cell RNA，to study the tolerance ability anti-taxol of A549 in different genetic backgrounds through gene silence by siRNA.Results It was found that the taxol resistant cell line A549/taxol was successfully constructed and the gene expression was disordered.High expressed ING5suppressed the mRNA level of Bcl-2，which is necessary of cell apoptosis.Conclusion A novel mechanism of taxol resistance of A549 was found，which provides a new way to explore the strategy of chemotherapy using taxol.

nonsmall-cell lung cancer；taxol；Bcl-2；ING5

R285

A

2095-4271(2016)05-0511-05

10.11920/xnmdzk.2016.05.008

Taxol resistance mechanism of NSCLC cell line A549

2016-07-22

郭蓮娣(1974—)，女，漢族，河南信陽(yáng)人，講師，博士，研究方向:中藥抗DNA損傷作用的研究.E-mail:1031572133＠qq.com

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30970950)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目(2015NZYQN63)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610656073)