汗液中美托洛爾及其代謝物的提取與檢測

生物樣本由于能夠提供樣本供體的生物特征和生物信息，是公安、司法鑒定的重要證據(jù)之一。汗液是人體的重要排泄產(chǎn)物之一。正常情況下，汗液殘留物中99%為水分，此外還有少量的鹽分、尿素、乳酸和脂肪酸等[1]。服藥后，藥物經(jīng)吸收、分布、代謝等體內(nèi)過程，原型藥物及其代謝物會從汗腺分泌，通過汗液排出體外，從而引起汗液成分的微小變化。因此，通過檢測汗液中的遺留藥物成分，能夠間接獲得排汗人的服藥信息，從而協(xié)助縮小犯罪嫌疑人范圍，為偵查提供線索。

目前，關于現(xiàn)場遺留汗液的成分研究主要集中在毒品及爆炸物成分檢測。檢測方法包括紅外光譜法（FTIR）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用法（LCMS）、熒光光譜法（AFS），及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）[2-6]。其中，MALDITOF MS可同時實現(xiàn)汗?jié)撝讣y的顯現(xiàn)和指紋汗液中毒品來源的分析。本研究探索的汗液中藥物的提取與檢測方法對于偵查方向的指導作用有二：通過對汗液中原型藥物或其代謝物進行檢測，推測排汗人的服藥行為，縮小偵查范圍；另外，當現(xiàn)場的汗?jié)撝讣y遭到破壞，其形態(tài)學特征不足以提供偵查線索時，通過汗液中的藥物成分檢測能夠繼續(xù)為偵查提供方向。

本研究選擇降壓藥物美托洛爾為模型藥物，建立了汗液中美托洛爾（Metoprolol，MET）及其代謝物α-羥基美托洛爾（α-hydroxyl-metoprolol，α-MET）的提取及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）檢測方法，并考察了此提取檢測方法對于含藥汗液的辨識效果。

1 材料與方法

圖1 美托洛爾（A），α-羥基美托洛爾（B）和普萘洛爾（C，內(nèi)標）的MS/MS全掃描圖

1.1 儀器與試劑

液相色譜-電離噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀：由Thermo Finnigan液相色譜儀（San Jose，CA，USA）和Thermo Fisher LXQ離子阱質(zhì)譜儀 （San Jose，CA，USA）組成；KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A微型渦旋混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；HC-3018R型高速冷凍離心機 （河南兄弟儀器公司）；BYN200-2型電動氮氣吹干儀（上海秉越電子儀器有限公司）；酒石酸美托洛爾標準品（99%，中國食品藥品檢定研究院）；α-羥基美托洛爾標準品（99%，TRC，加拿大）；鹽酸普萘洛爾標準品（99%，中國食品藥品檢定研究院）；倍他樂克?（酒石酸美托洛爾片，25mg）；甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為分析純，試驗用水為純凈水。一次性聚乙烯（PE）塑料手套、載玻片、金屬格尺、塑料板、復印紙、紙巾、樺木棒、棉布背心。

1.2 方法

1.2.1 美托洛爾的LC-MS檢測條件

色譜條件：Thermo Gold ODS C18色譜柱 （150mm× 2.1mm，5μm）；柱溫35℃；流動相為乙腈-甲醇-0.1%甲酸水溶液（20∶20∶60，v/v/v）；流速為0.2mL/min；進樣量10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子檢測，SRM模式，掃描范圍為70～280 Da；毛細管溫度為350℃。在上述的質(zhì)譜條件下，美托洛爾、α-羥基美托洛爾和普萘洛爾主要生成[M+H]+準分子離子峰，分別為m/z 268、m/z 284和m/z 260。選擇性對[M+H]+進行MS2產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析（圖1），美托洛爾的主要碎片離子為m/z 191和m/z 116，α-羥基美托洛爾的主要碎片離子為m/z 116，普萘洛爾的主要碎片離子為m/z 183和m/z 116。根據(jù)碎片離子的豐度，美托洛爾、α-羥基美托洛爾、普萘洛爾的定量離子m/z分別為：268→191，284→116，260→183。

1.2.2 相關溶液的配置

精密稱取酒石酸美托洛爾12.8 mg，用甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為50 μg/mL-1的美托洛爾儲備液。移取美托洛爾儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.40、1.00 μg/mL-1的美托洛爾標準溶液；精密稱取α-羥基美托洛爾5.0 mg，用甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為50 μg/mL-1的α-羥基美托洛爾儲備液，移取α-羥基美托洛爾儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.40、1.00 μg/mL-1的α-羥基美托洛爾標準溶液；精密稱取鹽酸普萘洛爾11.4mg，用甲醇溶解，配置成普萘洛爾質(zhì)量濃度為100μg/mL-1的儲備液，用甲醇將儲備液定量稀釋至0.05μg/mL-1作為普萘洛爾工作液。

1.2.3 標準曲線與檢出限

分別移取相同濃度的美托洛爾及α-羥基美托洛爾標準溶液各0.25mL，按照1∶1的比例混合加入至1 mL離心管內(nèi)，另加入0.5 mL的普萘洛爾工作液，渦旋混合。取200μL混合液滴加在濕棉簽上，依次得到載藥量為2.5、5、10、20、50 ng的含藥濕棉簽。按照2.5項方法處理，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用儀分析，測得藥物MET的峰面積（Amet），代謝物α-MET的峰面積（Aα-met）和內(nèi)標物普萘洛爾的峰面積（Apro）。分別以Amet/Apro和Aα-met/Apro的值（Y）為縱坐標，各自藥物溶液濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 采樣方法選擇

分別考察采用干燥濾紙、濕潤濾紙、干燥棉簽和濕潤棉簽等不同方法，對塑料表面粘附汗液中藥物及其代謝物的提取效率。濕潤濾紙和濕潤棉簽分別為用提取劑甲醇潤濕的濾紙和棉簽。在空白PE塑料手套內(nèi)表面上分別滴加1.0 mL美托洛爾標準溶液（50 ng/mL-1）與α-羥基美托洛爾（50 ng/mL-1）的1∶1等體積混合溶液，及1.0mL普萘洛爾工作液。自然干燥后，分別用上述不同方法對PE塑料表面的藥物進行采樣，按照2.5的優(yōu)化方法進行后續(xù)處理，以MET和α-MET檢出量比較幾種采樣方法的提取效率。

1.2.5 提取劑

分別考察以水、甲醇、乙醇為提取劑，對塑料表面粘附汗液中藥物及其代謝物的提取效率。在空白PE塑料手套內(nèi)表面上分別滴加1.0 mL美托洛爾標準溶液（50 ng/mL-1）與α-羥基美托洛爾標準溶液（50 ng/mL-1）的1∶1等體積混合溶液，及1.0 mL普萘洛爾工作液。自然干燥后，采用濕潤棉簽法，分別用棉簽通過1 mL的上述三種溶劑將塑料表面的藥物轉(zhuǎn)移至離心管中，按照2.5的優(yōu)化方法進行后續(xù)處理，以MET和α-MET檢出量比較幾種提取劑的提取效率。

1.2.6 提取條件優(yōu)化

采用五因素三水平的正交試驗設計，分別以MET和α-MET的檢出量為指標，對汗液中MET其代謝物α-MET的提取工藝進行優(yōu)化。提取溫度的3個水平分別為15、25、35℃；提取時間的3個水平分別為2、5、10min；超聲功率的3個水平分別為1000、1600、2000W。離心速度的3個水平分別為2000、5000、10000rpm，離心時間的3個水平分別為1、3、5min。

1.2.7 提取客體的影響

根據(jù)提取客體的滲透性和表面的光滑程度，分別選擇玻璃、光滑金屬、光滑塑料、粗糙塑料、光滑紙張、粗糙紙張、木頭、棉布背心等幾種客體，對不同客體上的汗液藥物提取效率進行考察。采用前述的濕潤棉簽轉(zhuǎn)移法提取非滲透客體表面的藥物。對于滲透性客體采取直接超聲提取。具體方法為將滲透客體的汗液部分取下后，直接放入定量甲醇溶液中超聲，超聲的參數(shù)及后續(xù)操作同濕潤棉簽轉(zhuǎn)移法。以MET的檢出量對不同的提取客體進行比較，結(jié)果見圖2。

圖2 不同客體的MET檢出量

1.2.8 顯現(xiàn)粉末的影響

當汗液或汗?jié)n沒有位于衣領、手套等常規(guī)位置，而是粘附到作案工具、墻體或者滴落到地面上，汗液的顯現(xiàn)可以幫助偵查人員快速鎖定汗液的位置。我們選擇最為常見的粉末顯現(xiàn)法，考察顯現(xiàn)粉末對于汗液中藥物檢測結(jié)果的影響。選擇三種市售粉末（金粉，鋁粉，和磁性粉末）進行玻璃表面的指紋顯現(xiàn)。服用倍他樂克?的受試者于服藥后的相同時間分別用左右手的相同位置在玻璃板上以相同的方式平行留下兩枚汗?jié)撝讣y。以左手為對照，在右手遺留汗?jié)撝讣y上分別用三種不同的粉末進行顯現(xiàn)，用前述2.5的方法進行提取處理，并用LC-MS于同一天內(nèi)進行檢測，每個樣品檢測三次。以MET的檢出量對施加不同顯現(xiàn)粉末后的提取效果進行比較，結(jié)果見圖3。

圖3 顯現(xiàn)粉末對于提取的影響

1.2.9 含藥汗液的區(qū)分檢測

4名受試者按順序編號，1號、2號為對照組，3號、4號為測試組，于3號、4號受試者單劑量口服25 mg倍他樂克?后開始計時。所有受試者分別用一次性PE塑料手套在各時間點采集汗液。根據(jù)美托洛爾緩釋片的體內(nèi)代謝特點和其血液樣品的采集時間，確定其汗液收集時間間隔為初期1 h，中后期為2 h，手套佩戴時間為1 h。采集的時間點為1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20 h。按照2.5的優(yōu)化方法以棉簽轉(zhuǎn)移法處理手套內(nèi)部汗液。實驗期間受試者可以自由活動，并正常進食飲水。實驗室溫度為30℃。LC-MS測得各點采集汗液中的MET及α-MET含量，結(jié)果見圖4。

圖4 受試者汗液中MET隨時間變化曲線

2 結(jié)果和討論

2.1 標準曲線與檢出限

經(jīng)最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程分別為，美托洛爾：y=0.0902x-0.0566（R2=0.9997）；α-羥基美托洛爾：y=0.0629x+0.0541（R2=0.9982）。結(jié)果表明，美托洛爾在5.0～500ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，α-羥基美托洛爾在濃度為25～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。當信噪比（S/N）為10時，MET的定量限為10ng/mL，α-MET的定量限為5.0ng/mL。當S/N為3時，MET的檢出限為2.0 ng/mL，α-MET的檢出限為1.0ng/mL。

2.2 采樣方法選擇

無論對于MET還是α-MET，濕潤采樣物的提取效率均明顯高于干燥采樣物的提取效率。在幾種不同的采樣方法中，提取效率最高為濕潤棉簽，其次為濕潤濾紙，干燥棉簽和干燥濾紙的提取效率均較低。結(jié)果表明，物體的表面濕潤有助于汗液中藥物客體間的轉(zhuǎn)移。試驗最終采用濕潤棉簽作為采樣材料對PE塑料手套內(nèi)表面的藥物進行提取。

2.3 提取劑

提取劑考察結(jié)果為，以甲醇為提取劑的MET和α-MET的檢出量最高，乙醇次之，用水轉(zhuǎn)移的檢出量最低。這可能是由于美托洛爾和其代謝產(chǎn)物在不同溶劑中的溶解度差異導致。試驗最終采用甲醇作為提取劑PE塑料手套內(nèi)表面的藥物進行提取。

2.4 提取條件優(yōu)化

提取條件優(yōu)化結(jié)果表明，溫度對藥物的提取率的影響最大，溫度越高，藥物的提取效率越高；過長的超聲時間會降低藥物的提取效率；超聲功率和離心時間對藥物的提取率影響不大。試驗最終選擇提取溫度為35℃，提取時間為3 min，超聲功率為2 000W，離心速度為5000rpm，離心時間為5min。

優(yōu)化后的提取條件為：采用甲醇濕潤的棉簽進行轉(zhuǎn)移，并采用超聲法對棉簽上的汗液中的藥物進行提取。將提取有藥物的棉簽完全浸入一定量的甲醇中，用超聲波進行提取，提取溫度為35℃，超聲時間為3min，超聲功率為2000W。超聲后將溶解有樣品的甲醇溶液高速離心，離心速度為5 000 rpm，離心時間為5 min，結(jié)束后將上清液過0.22 μm微孔濾膜（此步驟為粉末顯現(xiàn)汗液特有），轉(zhuǎn)移至另一離心管中，室溫下氮氣吹干富集，并用0.1mL甲醇復溶。

2.5 客體考察

由圖2可知，無論是滲透客體還是非滲透客體，光滑客體的藥物提取效率均顯著高于粗糙客體的藥物提取效率。非滲透客體的光滑表面能夠使棉簽與客體的有效接觸面積達到最大。對于粗糙的非滲透性客體，如硬塑料，汗液中的藥物可能會富集在塑料表面的粗糙紋理的死角中，從而降低藥物的提取效率；采用直接超聲提取法的不同光滑程度的滲透性客體，其藥物提取效率受超聲的有效撞擊和藥物分子的擴散阻力雙重影響。紙巾由于其內(nèi)部的纖維素成線狀，結(jié)構疏松錯亂，藥物更易進入而難于釋放。復印紙的纖維素成較致密板狀排列，藥物難于快速進入紙張深層，因此提取效率較高。

對于相同光滑程度的客體來說，客體的滲透程度對于藥物的提取效率影響不大。實驗原先采用棉簽轉(zhuǎn)移法提取滲透客體表面的汗液藥物，但提取率極低（圖表中未顯示）。改為直接超聲法后顯著提高了滲透性客體的提取效率。說明不同客體需要采用不同的提取方法，而超聲提取法是提取滲透性客體表面藥物的有效方法。

2.6 顯現(xiàn)粉末對于提取的影響

由圖3可知，金粉，鋁粉，和磁性粉末組的MET檢出量分別為各自對照組的43.97%、47.27%、53.33%。各組顯現(xiàn)粉末均不同程度地降低了MET的檢出量，這是由于微米化的顯現(xiàn)顆粒會對藥物顆粒產(chǎn)生吸附，被吸附藥物顆粒隨顯現(xiàn)顆粒的離心去除而部分損失。值得注意的是，磁性粉末的藥物檢出量高于金粉和銀粉的檢出量，這可能是由于磁性粉末的質(zhì)量較小，因此在離心分離過程中藥物損失少。

2.7 含藥汗液的區(qū)分檢測

由圖4可知，3號、4號受試者的汗液樣品中均檢出MET，而1號、2號受試者的汗液樣品中均未檢出MET，這與受試者實驗前的服藥情況吻合，說明此方法能夠有效地識別遺留汗液中的藥物。從3號、4號受試者的汗藥時曲線可以看出，滿足最低檢出限（2 ng/mL）和最低定量限（10 ng/mL）的時間范圍分別約為1～19 h和3～15 h。倍他樂克?需一日服藥兩次（12 h口服一次），服12 h后汗液中的MET濃度約為17 ng/mL，由于其穩(wěn)態(tài)血藥濃度范圍與此相近，且大于其最低定量限，因此本方法對于美托洛爾的單次服藥患者的汗液具有靈敏的識別能力。汗液中還可同時檢出MET的代謝物α-MET，這是作為藥物是通過汗液分泌排泄，而非外源性接觸或其他污染干擾所致的有力證據(jù)。

3 結(jié)論

綜上所述，本文建立了汗液中美托洛爾及其代謝物α-羥基美托洛爾的提取及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法。結(jié)果表明，采用甲醇濕潤棉簽提取效果最好；光滑客體的提取效率顯著高于粗糙客體；顯現(xiàn)粉末會不同程度地干擾藥物的檢出。單次口服25mg美托洛爾后3~15h仍可檢出原藥及代謝物。本方法適用于汗液中美托洛爾和α-羥基美托洛爾的提取與檢測，可依據(jù)汗液中美托洛爾和α-羥基美托洛爾的檢測對排汗人進行識別。

[1]Saima Jadoon，Sabiha Karim，Muhammad Rouf Akram，et al. Recent Developments in Sweat Analysis and Its Application[J].International Journal of Analytical Chemistry，2015，2015：1-7.

[2]Paul Benfield，Stephen P，Clissold-Rex N.Metoprolol.An Updated Review of Its Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Properties，and Therapeutic Efficacy，in Hypertension，Ischaemic Heart Disease and Related Cardiovascular disorders[J].Drug Evaluation，1986，31：376-429.

[3]Aqil M，Ali A，Ahad A，et al.A validated HPLC Method for Estimation of Metoprolol in Human Plasma[J].Acta Chromatogr，2007，19：130-140.

[4]Zhang Y，Wu H-L，Xia A-L，et al.Fluorescence Determination of Metoprolol in Human Plasma by Trilinear Decomposition-Based Calibration Techniques[J].Anal Bioanal Chem，2006，386：1741-1748.

[5]Yilmaz B，Arslan S，Akba V.Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for Determination of Metoprolol in the Patients with Hypertension[J].Talanta，2009，80（1）：346-351.

[6]Kimberly Kaplan-Sandquist，Marc A.Lebeau，Mark L.Miller. Chemical Analysis of Pharmaceuticals and Explosives in Fingermarks Using Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ time-of-Flight Mass Spectrometry[J].Forensic Science International，2014，235：68-77.

（本文編輯：施 妍）

張文驥1，陳 卓1，張 婷2，許英健2，林子清1
（1.中國刑事警察學院 法醫(yī)學系，遼寧 沈陽110035；2.中國刑事警察學院 法化學系，遼 寧 沈陽110035）

目的 建立汗液中美托洛爾和α-羥基美托洛爾的提取與檢測方法。方法 汗液樣品提取處理后采用Finnigan液相色譜儀串聯(lián)LXQ離子阱質(zhì)譜儀檢測，流動相為乙腈-甲醇-0.1%甲酸水溶液（20∶20∶60，v/v/v）；質(zhì)譜采用SRM模式，正離子模式監(jiān)測。以美托洛爾含量為指標，考察采樣方法，提取溶劑種類，提取客體種類及顯現(xiàn)粉末種類對于汗液中藥物提取效率的影響。結(jié)果 采用甲醇濕潤棉簽采樣。光滑客體的提取效率顯著高于粗糙客體。顯現(xiàn)粉末不同程度地干擾了藥物的檢出。單次口服25mg美托洛爾后3~15h仍可檢出原藥及代謝物。結(jié)論 本方法適用于汗液中美托洛爾和α-羥基美托洛爾的提取與檢測，可依據(jù)汗液中美托洛爾和α-羥基美托洛爾的檢測對排汗人進行識別。

汗液；液質(zhì)聯(lián)用；美托洛爾；α-羥基美托洛爾

Detection of Metoprolol and α-hydro-metoprolol in Human Sweat

ZHANG Wen-ji1，CHEN Zhuo1，ZHANG Ting2，XU Ying-jian2，LIN Zi-qing1
（1.Department of Forensic Medicine，National Police University，Shenyang 110035，China; 2.Department of Forensic Chemistry，National Police University，Shenyang 110035，China）

Objective To establish a method for the extraction and detection of metoprolol and α-hydro-metoprolol in human sweat.Method The sweat sample was prepared and analyzed by LC-MS with the mobile phase of acetonitrile-methanol-0.1%formic acid aqueous solution （20∶20∶60，v/v/v）.The sample was operated at SRM mode （ESI+）.The extraction method，extracting agent，developing powder，and substrate were assessed based on the amount of metoprolol detected. Result The metoprolol was extracted using methanol moistened swabs.The extraction efficiency on smooth substrates was significantly higher than that on rough substrates.The developing powder reduced the extraction of metoprolol.The timewindow of this method after a single oral administration is 3-15 hours.Conclusion The established method can be applied in the detection of metoprolol and its metabolite α-hydro-metoprolol in human sweat，and the analyzing results of sweat samples could be used to differentiate the objects.

sweat;LC-MS;metoprolol;α-hydro-metoprolol

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2016.06.006

1671-2072-（2016）06-0028-05

2016-07-11

國家中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項基金

張文驥（1986—），男，講師，博士，主要從事毒物及藥物代謝及相關檢測研究。E-mail：syphuzwj@163.com。

林子清（1961—），男，教授，主要從事法醫(yī)物證學和法醫(yī)人類學的研究。E-mail：ziqing2002@sohu.com。