鞏 婷，李妍怡，楊瑞龍

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

大劑量岷當(dāng)歸配伍川芎對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用*

鞏 婷，李妍怡，楊瑞龍

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的:通過觀察大劑量岷當(dāng)歸配伍川芎對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能評分、腦梗死體積及腦組織中ICA M-l、CO X-2基因表達(dá)的影響，研究不同劑量岷當(dāng)歸配伍川芎對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機制。方法:將60只雄性W i st ar大鼠60只，隨機分為6組，即假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、岷當(dāng)歸高劑量+川芎組、岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、岷當(dāng)歸低劑量+川芎組，每組各10只。模型采用大腦中動脈缺血模型。在造模前12小時、30分鐘各給藥1次，缺血后12、24、36、48小時各給藥1次。缺血再灌注48小時將大鼠處死，留取標(biāo)本。對各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評估，采用TTC染色法檢測各組大鼠腦梗死體積，免疫組化及RT-PCR檢測ICA M-l、CO X-2m RN A的相對表達(dá)。結(jié)果:神經(jīng)功能評分、梗死面積比率岷當(dāng)歸+川芎治療組與尼莫地平組均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ICA M、CO X-2m RN A表達(dá)模型組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，各治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸高劑量+川芎組與岷當(dāng)歸中劑量+川芎組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論:高、中劑量組岷當(dāng)歸與川芎配伍可以抑制腦缺血再灌注損傷過程的炎癥反應(yīng)，改善神經(jīng)缺損癥狀，在一定程度上縮小缺血再灌注損傷后大鼠腦組織梗死體積，降低炎癥因子在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)，從而減輕腦細(xì)胞的損傷。

岷當(dāng)歸；川芎；腦缺血再灌注損傷；ICA M-l；CO X-2

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是指腦缺血致腦細(xì)胞損傷，恢復(fù)血液再灌注后，其缺血性損傷反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。目前研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷機制復(fù)雜，參與因素很多，可能與興奮性氨基酸、鈣超載、自由基、一氧化氮等有關(guān)。其中，炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中的作用越來越受到重視［1］。大量證據(jù)表明，缺血和再灌注早期產(chǎn)生的黏附因子和細(xì)胞因子構(gòu)成了缺血性損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)［2］。ICAM-1是細(xì)胞黏附分子中免疫球蛋白家族成員，與炎癥過程密切相關(guān)。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素類和血栓素物質(zhì)的主要酶之一，在炎癥過程中發(fā)揮重要的作用［3］。本研究通過觀察不同劑量岷當(dāng)歸配伍川芎對大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用，從抑制炎癥因子的角度探討了該作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SPF級Wistar大鼠60只(體質(zhì)量250～320 g，鼠齡3～4月)，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提供，動物合格證號:SCXK (甘)201100001。按體質(zhì)量隨機分為6組，每組10只，分別是假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、岷當(dāng)歸高劑量+川芎組、岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、岷當(dāng)歸低劑量+川芎組。

1.2 儀器與試劑 岷當(dāng)歸、川芎、3%戊巴比妥鈉(購自甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心藥理毒理實驗室)，尼莫地平(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H44025019)，TTC由上海中秦化學(xué)試劑有限公司提供；ICAM-l、β-actin引物基因(南京金斯瑞生物科技有限公司合成，-20℃保存，使用時用去RNA酶的滅菌雙蒸水配制成所需濃度)，總RNA抽提試劑盒(大連寶生物有限公司生產(chǎn))，RT-PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生物有限公司生產(chǎn))，XST-Ⅱ溫控式大鼠解剖臺(南京泉水教學(xué)儀器廠提供)，PLCO型臺式高速離心機(德國Heraeus公司提供)，熒光定量PCR7300system儀(Applied Biosysterms公司提供)。

1.3 模型制備 通過改良Longa的方法采用線栓法阻塞大鼠單側(cè)大腦中動脈制備缺血再灌注損傷模型。術(shù)前12小時禁食，術(shù)前1小時禁水。大鼠稱重后予10%水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，沿頸部正中切開，暴露CCA、ECA、頸內(nèi)動脈ICA，永久結(jié)扎CCA近心端、ECA根部，微動脈夾暫時夾閉CCA遠(yuǎn)心端，在此處剪一斜口，經(jīng)此口插入頂端光滑成球面的尼龍線，經(jīng)CCA分叉處通過ICA入顱至ACA起始部，閉塞MCA起始部，造成了MCA供血區(qū)的梗死。尼龍線插入深度為18～20 mm，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端后逐層縫合，尼龍線末端暴露在體外。栓塞2小時后，拔出尼龍線，實施再灌注。假手術(shù)組只分離、暴露血管，不阻塞血管。

1.4 給藥方法 每組動物于造模前12小時、30分鐘，缺血后12、24、36、48小時各給藥1次，共6次。假手術(shù)組與模型組給予生理鹽水20mL/(kg·d)；岷當(dāng)歸水煎液高、中、低劑量為2、1、0.5 g/kg，川芎常用量均為0.167 g/kg，對照組尼莫地平20 mL/kg(濃度1 g/L)，按照人與大鼠體表面積公式換算為動物用藥劑量；缺血再灌注48小時將大鼠處死，留取標(biāo)本。

1.5 神經(jīng)功能評分 根據(jù)Longa的5級標(biāo)準(zhǔn)評分法，第1次動物蘇醒后開始評分，直至動物死亡或被處死。0分:正常，未見任何神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。1分:垂直提起時前爪不能伸直。2分:行走時身體向右傾，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)。3分:行走時身體向右側(cè)跌倒。4分:不能自發(fā)行走或有意識障礙。根據(jù)首次評分，沒有神經(jīng)功能缺損、有呼吸困難、提前死亡及處死時發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物均棄之不用，對于剔除的動物在后續(xù)的實驗中補充。

1.6 計算腦組織梗死灶 于缺血再灌注實驗斷頭取出鼠腦，置冰箱(-20℃)內(nèi)30分鐘后，取冠狀面均勻切成2 mm厚腦片5～6片，每隔2 mm切一片(第一刀在腦前極與視交叉連線中點處；第二刀在視交叉部位)。將第3切片迅速置于2%TTC溶液(37℃)中染色。正常腦組織染成紅色，缺血區(qū)呈灰白色，界線清晰。計算梗死組織占第3切片濕重的百分率。

1.7 RT-PCR檢測m RN A表達(dá)水平 參照試劑盒說明，按步驟進(jìn)行操作，各基因相應(yīng)特異性引物如下:

ICAM-1上游引物:5′-CAG GTA TCC ATC CAT CCC-3′

ICAM-1下游引物:5′-CTG TTC AGA AGC ACC ACC-3′

COX-2上游引物:5′-GAG AGA AAG AAA TGG CTG CAG AG-3′

COX-2下游引物:5′-TTA CAG CTC AGT TGA ACG CCT T-3′

β-actin基因上游引物:5′-AGC CTT CCT TCC TGG GTATG-3′

β-actin基因下游引物:5′-ATC GTA CTC CTG CTT GCT GA-3′

1.8 數(shù)據(jù)處理 反應(yīng)結(jié)束后，由PCR-7300儀分析界面分析COX-2、ICAM-1和β-actin基因的擴增曲線，得到各實驗孔Ct值，分別計算同一cDNA樣本4個復(fù)孔的Ct均值，以同一樣本的β-actin Ct值作為內(nèi)參，按照公式2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料均以(s)表示，多組間比較采用單因素方差分析法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損及梗死；神經(jīng)功能缺損評分、梗死面積比率治療組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、模型組與尼莫地平組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸低劑量+川芎組與岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、岷當(dāng)歸高劑量+川芎組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸中劑量+川芎組與岷當(dāng)歸高劑量+川芎組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。神經(jīng)功能缺損評分，岷當(dāng)歸高劑量+川芎組與尼莫地平組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。梗死面積比率比較，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評分表(s)

表1 缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評分表(s)

注:●表示與模型組比較，P＜0.05；※表示與尼莫地平組比較，P＜0.05；▲表示與岷當(dāng)歸低劑量+川芎組比較，P＜0.05；◆表示與岷當(dāng)歸中劑量+川芎組比較，P＜0.05；★表示與尼莫地平組比較，P＜0.05；☆表示與尼莫地平組比較，P＞0.05。

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2.2 ICA M-l、CO X-2 m R N A的表達(dá)測定結(jié)果 ICAM-l和COX-2mRNA相對表達(dá)量假手術(shù)組、各治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；各治療組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸低劑量+川芎組、岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、岷當(dāng)歸高劑量+川芎組與尼莫地平組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；岷當(dāng)歸低劑量+川芎組與岷當(dāng)歸中劑量+川芎組、岷當(dāng)歸高劑量+川芎組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。岷當(dāng)歸中劑量+川芎組與岷當(dāng)歸高劑量+川芎組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 ICA M-l、CO X-2m RN A的相對定量表達(dá)測定結(jié)果(s)

表2 ICA M-l、CO X-2m RN A的相對定量表達(dá)測定結(jié)果(s)

注:●表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；※表示與尼莫地平組比較，P＜0.05；▲表示與岷當(dāng)歸低劑量+川芎組比較，P＜0.05；☆表示與岷當(dāng)歸中劑量+川芎組比較，P＞0.05。

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3 討論

正常情況下，ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其他細(xì)胞為低水平表達(dá)，但當(dāng)組織損傷、缺血、炎癥時，ICAM-1呈現(xiàn)高表達(dá)，引起一系列病理反應(yīng)［4］，在中性粒細(xì)胞黏附遷徙的過程中ICAM-1起關(guān)鍵的橋梁作用［5］。COX-2在大多數(shù)正常組織中檢測不到，可以被生長因子、細(xì)胞因子或其他的炎癥介質(zhì)所誘導(dǎo)。在涉及動脈粥樣硬化研究中，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、氧化型低密度脂蛋白、自由基、內(nèi)毒素、缺氧、血流動力學(xué)應(yīng)激等均可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，在炎癥過程中發(fā)揮重要的作用［3］。

當(dāng)歸配川芎，即佛手散，出自《普濟(jì)本事方》，川芎為血中之氣藥，能上行頭目，下行血海，與當(dāng)歸配伍可補血活血，使補血而不滯血，行血而不傷血，多用于營血瘀滯證?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸含有多種有效成分，當(dāng)歸多糖，多種氨基酸具有廣泛的藥理作用。醇提當(dāng)歸油既可抑制炎癥早期的水腫與滲出，又可抑制炎癥晚期的組織增生與肉芽組織形成。

本研究結(jié)果表明各中藥治療組大鼠神經(jīng)缺損的癥狀、梗死體積均有不同程度的好轉(zhuǎn)及縮小，以高、中劑量組最為顯著，說明岷當(dāng)歸高、中劑量組可改善腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損癥狀、縮小梗死灶的體積，有效減輕腦缺血再灌注損失，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。而岷當(dāng)歸配伍川芎的這種神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過降低COX-2mRNA、ICAM-1mRNA的表達(dá)水平、抑制腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)而起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

［1］ 程道賓.腦缺血預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機制［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2007．

［2］ 高穎，周莉.中風(fēng)病中醫(yī)藥防治研究的回顧與現(xiàn)狀分析［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2009，2（1）:15-18.

［3］ 張小菊，王荔，高建英，等.高脂血癥對腦缺血再灌注大鼠腦組織中M M P-9和CO X-2表達(dá)的影響［J］.中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2011，19（3）:270-275.

［4］ 孫媛嬌，王桂敏.腦出血后血腫周圍炎癥與自由基損傷機制［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（1）:40-42.

［5］ 潘斌，劉素蓉，成濤，等.健腦益智口服液在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機制［J］.中國臨床康復(fù)，2004，8（7）:1306-1307.

The Protective Effects of Combination of MinDangGui and ChuanXiong in Large Doses on the Nerve Dysfunction Induced by Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

GONG Ting,LI Yanyi,YANG Ruilong
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To study the protective effects and mechanisms of MinDangGui(Angelica sinensis) combined with ChuanXiong (Ligusticum wallichii)in different doses on the rats with cerebral ischemia reperfusion injury(CIRI)by observing the effects of MinDangGui and ChuanXiong in large doses on neural function scores, cerebral infarction size and ICAM-l and COX-2 gene expressions of the rat model.Methods：Sixty male Wistar rats were divided into six groups,the sham operation group,the model group,the nimodipine group,the high,moderate and low dosages groups of MinDangGui and ChuanXiong,ten rats each group.The model was prepared by middle cerebral artery occlusion.The rats were given drugs once separately about 12 hours and 30 minutes before modeling, in 12,24,36 and 48 hours after ischemia.They were sacrificed in 48 hours after ischemia reperfusion and the samples were kept.Behavioral assessment was performed for each group,cerebral infarction size of the rats in different groups was detected by TTC staining method,and meanwhile relative expressions of ICAM-1 and COX-2mRNA were measured by immunohistochemical method and RT-PCR.Results：The treatment group of MinDangGui and ChuanXiong was lower than the model group in neural function scores,cerebral infarction size rate, there were statistical differences(P＜0.05).When the model group was compared with the sham operation group in ICAM and COX-2mRNA expressions,there were statistical differences(P＜0.05),when all the treatment groups were compared with the model group,there were statistical differences(P＜0.05);when the high dosage group of MinDangGui and ChuanXiong was compared with the middle dosage group of MinDangGui and ChuanXiong,there was no statistical differences(P＞0.05).Conclusion：The high,middle dosages of MinDangGui and ChuanXiong can inhibit inflammatory reaction in the course of cerebral ischemia-reperfusion injury,improve neural defective symptoms,and reduce cerebral infarction size of the rats after ischemia-reperfusion injury to a certain degree,as well as lower inflammatory factor expression in cerebral ischemia-reperfusion injury,therefore it can alleviate the injury of cerebral cells.

MinDangGui;ChuanXiong;cerebral ischemia-reperfusion injury;ICAM-l;COX-2

R285.5

A

1004-6852(2016)10-0020-03

2016-04-25

2010年甘肅省自然科學(xué)基金項目(編號1010RJZA 215)。

鞏婷(1979—)，女，博士學(xué)位，主治醫(yī)師。研究方向:腦病的中醫(yī)診治。