周明旺，李盛華，陳 嫻，王 金，陳 威

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

膝骨性關(guān)節(jié)炎患者低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5基因與中醫(yī)體質(zhì)相關(guān)性研究*

周明旺，李盛華，陳 嫻，王 金，陳 威

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的:研究膝骨性關(guān)節(jié)炎(K O A)患者低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性與中醫(yī)體質(zhì)的相關(guān)性。方法:對(duì)K O A患者進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)問(wèn)卷調(diào)查，對(duì)平和質(zhì)、陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)3種高發(fā)體質(zhì)的K O A患者進(jìn)行LRP5基因多態(tài)性檢測(cè)，同時(shí)隨機(jī)選取54例健康非血緣關(guān)系志愿者作為對(duì)照組。結(jié)果:本次研究共檢測(cè)出LRP5基因rs3736228位點(diǎn)三種基因型，分別為CC、TT、CT。病例組與對(duì)照組比較，各基因型及等位基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。平和質(zhì)病例組、陽(yáng)虛質(zhì)病例組、陰虛質(zhì)病例組分別與對(duì)照組比較，各基因型與等位基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論:LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性可能與K O A無(wú)相關(guān)性。

骨性關(guān)節(jié)炎，膝；中醫(yī)體質(zhì)；LRP5；基因多態(tài)性

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5)屬于低密度脂蛋白受體家族，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中極其重要的信號(hào)蛋白［1］。相關(guān)研究顯示，LRP5通過(guò)影響軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原、MMP-3、MMP-13的水平，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［2-3］。近年來(lái)，中醫(yī)體質(zhì)學(xué)揭示疾病病因病機(jī)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)逐漸受到重視，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示中醫(yī)體質(zhì)與膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)的發(fā)病關(guān)系密切。本研究通過(guò)探討KOA患者LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性與其中醫(yī)體質(zhì)的關(guān)系，嘗試闡明KOA患者高發(fā)體質(zhì)發(fā)病的內(nèi)在生物學(xué)基礎(chǔ)，為辨識(shí)體質(zhì)防治KOA提供科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下:

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月至2015年6月在甘肅省中醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科、骨傷病科門診和住院部的KOA患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，將調(diào)查病例所得數(shù)據(jù)資料錄入Excel表格建立數(shù)據(jù)庫(kù)。從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出陽(yáng)虛質(zhì)KOA患者37例、陰虛質(zhì)KOA患者20例、平和質(zhì)KOA患者39例為病例組。隨機(jī)選取健康非血緣關(guān)系志愿者54例作為對(duì)照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入:1)受試者簽訂知情同意書；2)研究方法經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論并獲得批準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除:1)診斷為創(chuàng)傷性KOA的患者；2)妊娠或哺乳期婦女，過(guò)敏體質(zhì)者或不能接受本調(diào)查者；3)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎及患有嚴(yán)重膝關(guān)節(jié)疾病者；4)合并有嚴(yán)重的內(nèi)臟病變者或其他嚴(yán)重代謝異常疾病及骨腫瘤患者；5)精神病患者、智力障礙者；6)正在參加其他臨床試驗(yàn)的患者。

1.4 方法

1.4.1 血液D N A提取 使用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的中量全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)自全血中提取DNA，提取過(guò)程中可見白色的DNA絮狀物，加入DNA溶解液水化后存放在2～8℃冰箱保存，長(zhǎng)時(shí)間存放，可放置在-20℃冰箱。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 選擇LRP5基因的SNP位點(diǎn)為rs3736228，從文獻(xiàn)［4］中得到該位點(diǎn)的上下游引物堿基序列，將該序列進(jìn)行驗(yàn)證后委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。擴(kuò)增引物序列:上游:5′-GCT GGG CTG TTG ATG TTT AGA-3′；下游:5′-AGA GGC AAG GTT TTC CCA TAA-3′。PCR反應(yīng)體積共25μL，其中2×EsTaqMasterMix12.5μL，上游引物(ρ=10 μM)1μL，下游引物(ρ=10 μM) 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。將上述體系加入0.5 mL EP管后瞬時(shí)離心，防止液體附壁，再放入PCR儀擴(kuò)增得到產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2分鐘；循環(huán)參數(shù):94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；最后延伸:72℃，2分鐘，保存溫度4℃。

1.4.3 凝膠電泳 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL及DNA Marker 6 μL進(jìn)行凝膠電泳，電泳電壓120 V，電泳20分鐘，待條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm時(shí)，停止電泳。將電泳后的膠板放入凝膠成像儀中進(jìn)行觀察和拍照。

1.4.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序分析 凝膠電泳后運(yùn)用凝膠成像儀觀察產(chǎn)物，挑選出成像明顯的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序工作委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)χ2檢驗(yàn)分析病例組與對(duì)照組及病例組間各基因型與等位基因分布差異，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。若χ2檢驗(yàn)分析有意義則進(jìn)一步進(jìn)行l(wèi)ogitic分析，尋找有顯著差異的基因型和等位基因，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠液電泳后，在相應(yīng)位置有清晰的DNA條帶，長(zhǎng)度與DNA Marker指示位置一致，表明為L(zhǎng)RP5基因位點(diǎn)相應(yīng)序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠結(jié)果

2.2 基因測(cè)序結(jié)果

2.2.1 LRP5基因rs3736228位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)chromas、BioEdit軟件分析后，LRP5基因位點(diǎn)共檢測(cè)出CC、TT、CT 3種基因型，見圖2。

圖2 LRP5基因rs3736228位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

2.2.2 K O A患者中醫(yī)體質(zhì)與LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系 LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性病例組與對(duì)照組比較，總體上各基因型等位基因分布無(wú)明顯差異(χ2=0.56，P＞0.05；χ2=0.067，P＞0.05)。見表1。

表1 LRP5基因rs3736228位點(diǎn)病例組與對(duì)照組基因型、等位基因分布

LRP5基因rs3736228位點(diǎn)，陽(yáng)虛質(zhì)病例組與對(duì)照組比較，總體上各基因型無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.209，P＞0.05)，等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.129，P＞0.05)；陰虛質(zhì)病例組與對(duì)照組比較，總體上各基因型及等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.355，P＞0.05；χ2=0.169，P＞0.05)；平和質(zhì)病例組與對(duì)照組比較，總體上各基因型及等位基因分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.288，P＞0.05；χ2=0.511，P＞0.05)。見表2。

表2 陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、平和質(zhì)病例組與對(duì)照組LRP5基因rs3736228位點(diǎn)基因型、等位基因分布

3 討論

本研究通過(guò)基因測(cè)序分析LRP5基因rs3736228位點(diǎn)與KOA高發(fā)體質(zhì)陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、平和質(zhì)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示KOA患者中LRP5基因rs3736228位點(diǎn)共檢測(cè)出3種基因型，分別為CC型、TT型、CT型。3種基因型及等位基因分布頻率在病例組與對(duì)照組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步將陽(yáng)虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、平和質(zhì)病例組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，各基因型及等位基因分布也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性可能與KOA的發(fā)病無(wú)關(guān)。

LRP5蛋白是一種跨膜受體蛋白，其基因位于染色體11q-13上，由1615個(gè)氨基酸組成，包含23個(gè)外顯子。該基因rs3736228多態(tài)性位點(diǎn)位于編碼LDL受體結(jié)構(gòu)域的18號(hào)外顯子［3］。以往研究顯示，該位點(diǎn)的突變與骨質(zhì)疏松、骨折、糖尿病等有關(guān)，但與KOA相關(guān)性的研究較少。國(guó)外學(xué)者［4］曾對(duì)鹿特丹及英國(guó)青福德OA患者該位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與髖、膝、手指間關(guān)節(jié)的OA影像學(xué)K/L分級(jí)及患者血清CTX-Ⅱ水平無(wú)相關(guān)性。本次研究結(jié)果也顯示LRP5基因rs3736228位點(diǎn)多態(tài)性與KOA無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。由于納入標(biāo)準(zhǔn)不同以及研究對(duì)象的異質(zhì)性，雖然兩次研究均為陰性結(jié)果，尚不能認(rèn)為該位點(diǎn)與KOA無(wú)關(guān)。此外，多個(gè)文獻(xiàn)支持LRP5蛋白通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在KOA發(fā)病、發(fā)展過(guò)程中的重要作用［5］，我們不能排除由該基因突變導(dǎo)致KOA可能不止rs3736228一個(gè)位點(diǎn)，盡管該位點(diǎn)的突變被認(rèn)為是調(diào)控Wnt信號(hào)通路重要原因。

本研究的不足之處在于:首先研究的病例數(shù)較少；其次病例組患者存在多種混雜因素，如KOA病情嚴(yán)重程度、性別、年齡、伴發(fā)其他一些疾??；再次選擇單個(gè)基因的單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行研究。以上這些情況都可能對(duì)最后的結(jié)果造成偏倚，因此上述結(jié)果尚需要在多地區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、大樣本、多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性的研究予以驗(yàn)證，從而闡明LRP5基因多態(tài)性影響KOA的機(jī)制，為KOA的辨識(shí)體質(zhì)防治提供更科學(xué)的診療指標(biāo)，為臨床個(gè)體化藥物治療和預(yù)防KOA提供幫助。

［1］ 喬斌，李盛華，周明旺，等.W nt/β-cat eni n信號(hào)通路與軟骨代謝相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2014，22(10)：75-77.

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［3］ 尤海菲.LRP5基因多態(tài)性、環(huán)境因素及其交互作用與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究［D］.鄭州：鄭州大學(xué)，2014：38-48.

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Relevant Study on Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein 5 Gene and TCM Constitutions of the Patients with Knee Osteoarthritis

ZHOU Mingwang,LI Shenghua,CHEN Xian,WANG Jin,CHEN Wei
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective：To study the relationship between low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5)Gene：site polymorphism of rs3736228 and TCM constitution of the patients with knee osteoarthritis(KOA). Methods：Questionnaire survey of TCM constitution was conducted in patients with KOA,LRP5 gene polymorphism was detected in KOA patients of specific,Yang-deficiency and Yin-deficiency constitutions,and 54 healthy non-genetic connection volunteers were selected randomly as the control group.Results：Three genetic types of rs3736228 site of LRP5 gene were detected in this study,and they were CC,TT and CT.patients group compared withthecontrolgroup,therewerenostatisticaldifferencesinthecomparisonofallkindsgenotypesandalleles(P＞0.05). Specific cases group,Yang-deficiency cases group and Yin-deficiency cases group compared with the control group separately,there were no statistical differences in all kinds of genotypes and alleles(P＞0.05).Conclusion：There might be no correlation between rs3736228 site morphism of LRP5 gene and KOA.

osteoarthritis,knee;TCM constitution;LRP5;gene polymorphism

R684.3

A

1004-6852(2016)10-0005-03

2016-05-27

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)1208RJZA 041)。

周明旺(1977—)，男，博士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥防治骨與關(guān)節(jié)疾病。