郭建華 ， 包美娟 ， 王 娟 ， 李前勇 ， 曹 政

(1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

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幾種消毒劑對牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果試驗

郭建華1， 包美娟1， 王 娟1， 李前勇1， 曹 政2

(1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

為了研究復合酚、氫氧化鈉、聚維酮碘等消毒劑在不同濃度、不同作用時間對牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果；本研究以濃度為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%的消毒劑分別對牛型結(jié)核桿菌進行處理，作用時間分別為10、20、30、60 min、1、2、6、12 h；結(jié)果顯示，濃度在0.2%及以上的復合酚在12 h內(nèi)可殺滅牛型結(jié)核分枝桿菌，1%以上聚維酮碘處理6 h以上可殺滅牛型結(jié)核分枝桿菌，而所有試驗濃度的氫氧化鈉對牛型結(jié)核分枝桿菌沒有殺滅作用；本研究結(jié)果表明，復合酚和聚維酮碘可用于環(huán)境的牛型結(jié)核分枝桿菌的凈化。

消毒劑 ； 牛型結(jié)核分枝桿菌 ； 殺菌

結(jié)核病是由分支桿菌屬結(jié)核桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病。在家畜中，牛最易感染牛型結(jié)核分枝桿菌而發(fā)生結(jié)核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛，不但造成經(jīng)濟損失，而且危害人畜健康。結(jié)核病是全球重要的公共衛(wèi)生問題，在一些發(fā)達國家如德國、澳大利亞等國的人結(jié)核病患者中，約0.2%～0.3%是由牛型結(jié)核分枝桿菌引起的，而在埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞等不發(fā)達國家中，這個比例高達 17.0%～26.1%[1-2]，由此可見，控制牛結(jié)核病不僅對于動物疫病防治，還是對人健康，都具有重大的公共衛(wèi)生學意義。

由于動物用藥的各種限制，合理、科學的消毒在動物疫病防控中顯得非常重要性。消毒可有效地殺滅養(yǎng)殖場、交通工具等環(huán)境中病原微生物，清除傳染源，達到預防疾病，保證畜禽健康生長的目的，同時也可以保護人的健康。畜禽業(yè)目前應(yīng)用較多的是各種化學消毒劑，主要分為鹵素類(氯制劑、碘制劑、溴制劑)、醛類、酚類、醇類、氧化劑類、表面活性劑類、酸堿類等。已有研究者在消毒劑對結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果方面做了研究[3-8]，但對牛型結(jié)核分枝桿菌的消毒效果，未見報道。

本試驗以牛型結(jié)核分支桿菌為研究對象，研究不同濃度的聚維酮碘、復合酚以及氫氧化鈉溶液，在不同的作用時間對牛型結(jié)核桿菌的殺滅作用，旨在研究這幾種消毒劑的殺菌效果濃度和作用時間，為牧場、動物醫(yī)院等環(huán)境的凈化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 試驗菌株牛型結(jié)核分枝桿菌由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基的制備參照中國防癆協(xié)會制定的“結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程”[9]。稱取磷酸二氫鉀 14 g，枸櫞酸鎂 0.6 g，硫酸鎂0.24 g，谷氨酸鈉7.2 g，以及量取丙三醇12 mL，溶解于大約600 mL水中，加馬鈴薯淀粉30g，混勻，沸水浴煮1 h成糊狀，待冷卻后加入2%無菌的孔雀綠水溶液20 mL中，用消毒紗布過濾的新鮮雞卵液定容至1 000 mL，混勻后分裝于無菌試管內(nèi)擺成斜面，90 ℃蒸汽加熱90 min滅菌。冷卻后隨機取數(shù)支于37 ℃培養(yǎng)箱中進行無菌試驗24 h，確定無菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 麥氏標準管的配制 本試驗所需為0.1和 0.5麥氏單位。取0.1 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.9 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.1麥氏單位。取0.5 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.5 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.5麥氏單位。

2.2 消毒液的配制 將氫氧化鈉、聚維酮碘、復合酚等依據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司2002年編制的《消毒技術(shù)規(guī)范》按照其主要的消毒成分進行不同濃度稀釋[10]，分別用無菌生理鹽水配制成20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%消毒液。

2.3 菌株的活化、增殖、抗酸染色 取凍干菌種管，在無菌操作下打開，用無菌吸管加入0.3 mL～0.5 mL稀釋液(滅菌的含0.5% Tween-80 的生理鹽水)于安瓿瓶內(nèi)，使凍干菌種溶解呈懸浮液，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散?；靹蚝螅瑢⑸僭S菌種懸浮液接入改良羅氏斜面培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)。接種后第3、7、14、21、30天分別觀察菌落生長及污染情況。用接種環(huán)取第1代培養(yǎng)物，接種于斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)直至長出典型培養(yǎng)物。挑取第2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)15 d以上，即為第3代培養(yǎng)物。

將培養(yǎng)物均勻涂抹于載玻片上，用齊-尼二氏染色法染色，在光學顯微鏡下觀察，如可見紅色、抗酸性、短桿狀、微彎、團狀聚集菌體，偶見分枝即為牛型結(jié)核分枝桿菌。

2.4 菌懸液的制備與接種 取菌種第3代～5代的改良羅氏培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物(72 h內(nèi))，用5.0 mL吸管吸取3.0 mL～5.0 mL稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0 mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，用混合器混合5min，以使細菌懸浮均勻，用稀釋液將菌懸液稀釋至0.5麥氏單位備用。

用2.2.2配制好的9個不同濃度的消毒液分別將0.5麥氏單位的結(jié)核分枝桿菌稀釋為0.1麥氏單位，稀釋的同時開始計時，分別在稀釋5、10、15、20、25、30、45、60、120 min、6、12、18、24 h各時刻加入生理鹽水，以3 000 r/min離心20 min，收集沉淀，棄上清，反復洗滌2次后，用生理鹽水配制成0.1麥氏單位菌液，取50 μL菌液接種在準備好的培養(yǎng)基上，試驗設(shè)重復3個。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d后，分別觀察結(jié)核分枝桿菌的生長情況。

2.5 結(jié)果判定 14 d后開始觀察，若培養(yǎng)基有黃色菌落的生長，說明該消毒劑對結(jié)核桿菌沒有殺滅作用，記為“+”；若沒有長，說明該消毒劑對結(jié)核桿菌有殺滅作用，記為“-”。

3 結(jié)果

3.1 復合酚的殺菌試驗結(jié)果 各濃度復合酚不同時間處理殺滅牛型結(jié)核桿菌試驗結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，0.1%及以下濃度的復合酚溶液對結(jié)核桿菌沒有殺滅效果。而0.2%濃度及以上的復合酚溶液在與結(jié)核桿菌作用12 h后能將其殺滅；0.5%濃度的復合酚溶液在與結(jié)核桿菌作用60 min后能殺滅結(jié)核桿菌；濃度在1%及以上的復合酚溶液與結(jié)核桿菌作用10 min后就會有殺菌效果。而0.5%以下的濃度的復合酚處理30 min以內(nèi)的菌株中，可以看見呈顆粒狀或菜花狀的黃色菌落。

3.2 聚維酮碘的殺菌試驗結(jié)果 聚維酮碘的殺菌試驗結(jié)果見表2。表2顯示結(jié)果為：10 min至12 h，5%及以上濃度都沒有長出結(jié)核桿菌，2%濃度的則是在殺菌試驗處理2 h及其以上不長出結(jié)核桿菌，2 h以內(nèi)均長出結(jié)核桿菌；1%濃度在殺菌試驗進行6 h后不長出結(jié)核桿菌；0.5%以下濃度在殺菌試驗進行的每個時間段后均長出結(jié)核桿菌。

表1 復合酚對牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果

+：有菌落生長；-：沒有菌落的生長，下表同

表2 聚維酮碘對牛型結(jié)核分枝桿菌的殺菌效果

3.3 氫氧化鈉的試驗結(jié)果 接種14 d后開始觀察試驗結(jié)果并記錄結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各濃度氫氧化鈉處理結(jié)核桿菌沒有殺滅效果。

4 討論

結(jié)核桿菌細胞壁的脂類多為磷脂、蠟質(zhì)和脂肪酸，它們與細胞壁的蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合，使細胞壁的密度增大，增強細胞壁的保護效果，防止多種殺菌藥液滲入，導致結(jié)核桿菌對化學消毒劑的抵抗力較其他細菌強，從而消毒難度更大[3]。

本試驗中表明，復合酚對牛型結(jié)核分支桿菌的殺滅效果較好，只是濃度較低且作用時間較短的條件下復合酚溶液對結(jié)核桿菌沒有殺滅作用。正常情況下濃度在0.2%及以上的復合酚在12 h內(nèi)能將結(jié)核桿菌殺滅，而濃度為1%及以上的復合酚在10 min后就可殺滅結(jié)核桿菌。

聚維酮碘是碘和1-乙烯基-2-吡咯烷酮結(jié)合形成的絡(luò)合物，是中效消毒劑，通過接觸細菌細胞，釋放游離碘直接鹵化鹵體蛋白質(zhì)，產(chǎn)生沉淀，破壞細胞膜，從而達到殺滅細菌的作用。在本試驗中，2%聚維酮碘處理2 h以上才能徹底殺死牛型結(jié)核分枝桿菌，而要在較短時間殺滅菌株，需要5%以上的濃度。

本試驗的氫氧化鈉各濃度中，均未能殺死試驗菌株，說明牛型結(jié)核分枝桿菌的耐堿性極強。在“結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程”中，規(guī)定在分離牛型結(jié)核分枝桿菌的試驗中，常用2%氫氧化鈉處理樣品來除去雜菌[9]，我們發(fā)現(xiàn)20%氫氧化鈉處理12 h仍然不能有效殺死牛型結(jié)核分枝桿菌。

從本試驗的結(jié)果來看，消毒劑的作用效果不但取決于消毒劑的濃度，也跟作用時間有關(guān)，我們在實踐中不但要保證消毒劑的濃度，也要確保消毒時間充足。這點對于養(yǎng)殖場人員進出的消毒間尤為重要。

當然消毒劑具有一定的腐蝕性，特別是高濃度的消毒液，對人的皮膚、黏膜、口腔、眼等有損害[3]，對人表面消毒時，要在消毒劑濃度和作用時間之間做出選擇，盡量選擇低濃度并且作用時間短的、對人損傷小的消毒劑。

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Study on the Germicidal Efficacy of Several Disinfectant onMycobacteriumBovis

GUO Jian-hua1， BAO Mei-juan1， WANG Juan1， LI Qian-yong1， CAO Zheng2

(1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China)

In this study,we investigated the germicidal efficacy of compound phenol，sodium hydroxide and povidone-iodine onMycobacteriumbovisunder various concentration and incubation time.The isolates cultures were incubated with different concentration of the disinfectant(with the concentrations 20%，10%，5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1% and 0.01% respectively).The incubation time were 10，20，30，60 min，1，2，6 h and 12 h respectively.The results showed that 0.2% Compound phenolic and above sterilized theMycobacteriumboviswith 12h incubation.1% povidone-iodine and above sterilized theMycobacteriumboviswith incubation time at least 6 h.However even 20% sodium hydroxide had no role in killingMycobacteriumboviswith 12 h.The results showed that compound phenolic and povidone-iodine could be used as disinfectant to purify the environment forMycobacteriumbovis.

Disinfectant ；Mycobacteriumbovis； Germicidal efficacy

CAO Zheng

2015-07-14

西南大學科研基金資助(08BSr04)

郭建華(1977-)，男，副教授，博士，從事微生物資源開發(fā)與分子生物學研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com

R 187.1

A

0529-6005(2016)10-0074-03