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不同腐爛程度毛竹篼成分及酶活研究

2016-12-21 03:09李美群艾文勝蒲湘云劉翔博
關(guān)鍵詞:最低值過氧化物濾紙

李美群,艾文勝,孟 勇,楊 明,涂 佳,蒲湘云,劉翔博

(湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南 長沙 410004)

不同腐爛程度毛竹篼成分及酶活研究

李美群,艾文勝,孟 勇,楊 明,涂 佳,蒲湘云,劉翔博

(湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南 長沙 410004)

對(duì)不同腐爛程度毛竹篼的成分及酶活進(jìn)行分析,結(jié)果表明降解過程中各成分和酶活都呈現(xiàn)一定的規(guī)律和相關(guān)性。在降解過程中,灰分、熱水抽出物、1%NaOH 抽出物、綜纖維素、纖維素、酸不溶木質(zhì)素最高值分別為32.39%、14.03%、48.13%、58.53%、41.45%、50.67%;最低值分別為3.32%、5.44%、27.70%、27.54%、24.67%、25.15%。濾紙酶活、棉花酶活、CMC纖維素酶活最高值分別為116.79×103U/kg、155.90×103U/kg、76.66×103U/kg。漆酶酶活、錳過氧化物酶活、木質(zhì)素過氧化物酶活最高值分別為18.15×103U/kg、9.60×103U/kg、0.32×103U/kg。前、后期酶活都較低;中期物質(zhì)豐富的時(shí)候,微生物大量生長、繁殖,酶活較高。

毛竹篼;纖維素酶;漆酶;錳過氧化物酶;木質(zhì)素過氧化物酶

毛竹Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv. pubescens是我國優(yōu)良的材用竹,具有材性好、用途多和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[1]。毛竹材在建筑、家具、造紙、包裝、運(yùn)輸、食品、醫(yī)藥、保健、紡織、旅游、環(huán)保、化工、軍工等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[2-4]。全國每年竹林采伐量6×106t以上,其中毛竹三億根左右,約4.5×106t;然而毛竹林采伐后,剩下大量的毛竹篼,在自然環(huán)境中腐爛需要經(jīng)過八年甚至十年才能被微生物降解[5]。毛竹篼含有大量纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,一般微生物難以降解,其中起主要作用的是纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌。纖維素降解菌之所以能降解有機(jī)物,是其含有總纖維素酶、外切纖維素酶(Cl)以及內(nèi)切纖維素酶(Cx)。木質(zhì)素降解菌之所以能降解有機(jī)物,關(guān)鍵在于其分泌的胞外降解酶,主要有木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin Peroxidase,LiP)、漆酶(Laccase,Lac)和錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase,MnP),這三種木質(zhì)素降解酶均能單獨(dú)降解木質(zhì)素,也能兩兩聯(lián)合,或者三種酶一起作用對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行降解[6-8]。通過分析不同腐爛程度毛竹篼的成分變化以及纖維素酶活和木質(zhì)素酶活變化來了解毛竹篼降解過程中的成分變化及酶活變化情況,希望能為毛竹篼降解微生物的篩選及快速降解提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料和設(shè)備

于10月在湖南省望城區(qū)原佳村烏山毛竹林場(chǎng)選取不同腐爛程度毛竹篼,按腐爛程度的不同定為1-10級(jí)。

FA2004B電子天平,上海佑科儀器儀表有限公司;FW177中草藥粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司;DZF-6050真空干燥箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;101-E型電熱鼓風(fēng)干燥箱,北京永光明醫(yī)療儀器廠;南凌冷柜SC/SD-338,佛山市南海百凌制冷設(shè)備廠;SX2-2.5-10箱式電阻爐,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;SZC-D脂肪測(cè)定儀,上海纖檢儀器有限公司;SHA-C水浴恒溫震蕩器,金壇市榮華儀器制造有限公司;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;SPECORD 210 PLUS紫外可見分光光度計(jì),德國耶拿公司;醫(yī)用離心機(jī)TD6-WS,長沙平凡儀器儀表有限公司。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖南省長沙市望城區(qū)原佳村烏山林場(chǎng)(112°40'~ 112°47′E,27°50'~ 28°17′N),海拔68~175 m,立竹度為2 595株/hm2,屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤性氣候區(qū),年均溫17℃,年均降水量1 370 mm,日照1 610 h,無霜期274 d,1月平均最低氣溫為4.4℃,7月平均最高氣溫30℃。試驗(yàn)地土層厚>80 cm,土壤pH值4.92、有機(jī)質(zhì)含量平均值18.6 g/kg、堿解氮99 mg/kg、速效鉀50.56 mg/kg、有效磷3.72 mg/kg。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取100.0 mg分析純的無水葡萄糖(預(yù)先在105℃干燥至衡重),用少量蒸餾水溶解后,定量轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中再定容到刻度,搖勻,濃度為l mg/mL。取10支試管,分別加0 mL,0.2 mL,0.4 mL,0.6 mL,0.8 mL,l.0 mL,l.2 mL,l.4 mL,1.6 mL,1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,補(bǔ)加蒸餾水到2.0 mL,加入2.0 mLDNS試劑混合均勻,在沸水浴中加熱5 min取出后立即用水冷卻到室溫,定容到25 mL,搖勻,520 nm波長處測(cè)定OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),葡萄糖含量(mg)數(shù)為橫坐標(biāo),用軟件Origin7.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,形式為Y=ax+b。

1.3.2 纖維素、木質(zhì)素粗酶液制備

取樣品1 g,加9 mL無菌水,4℃浸提12 h,25℃,200 r/min振蕩提取1 h,3 500 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液,用于測(cè)定濾紙纖維素酶活(FPA)、外切纖維素酶活(Cl)、內(nèi)切纖維素酶活(Cx)、漆酶(Laccase)酶活、錳過氧化物酶( MnP)酶活和木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)酶活,置4℃冰箱保存待用。

1.4 測(cè)定方法

總纖維素酶活(FPA)、外切纖維素酶活(C1)、內(nèi)切纖維素酶活(CX)的測(cè)定方法[9];錳過氧化物酶活的測(cè)定:2,6-DMP法[10-12];漆酶酶活的測(cè)定:ABTS法[10-11,13];木質(zhì)素過氧化物酶活的測(cè)定:藜蘆醇法[10-11,14]。

水分的測(cè)定:GB/T 2677. 2-93《造紙?jiān)纤值臏y(cè)定》;灰分的測(cè)定:GB/T 2677. 3-93《造紙?jiān)匣曳值臏y(cè)定》;熱水抽出物的測(cè)定:GB/T 2677.4-93《造紙?jiān)纤槌鑫锖康臏y(cè)定》;1%氫氧化鈉抽出物的測(cè)定:GB/T 2677. 5-93《造紙?jiān)?%氫氧化鈉抽出物含量的測(cè)定》;綜纖維素的測(cè)定:GB/T 2677.10-1995《造紙?jiān)暇C纖維素含量的測(cè)定》;酸不溶木質(zhì)素的測(cè)定:GB/T 2677.8-94《造紙?jiān)纤岵蝗苣舅睾康臏y(cè)定》;纖維素的測(cè)定:硝酸乙醇法[15]。

1.5 酶活計(jì)算

濾紙纖維素酶活、外切纖維素酶活、內(nèi)切纖維素酶活力單位規(guī)定:1 mL反應(yīng)液1 min水解生成1 umol葡萄糖的酶量為1個(gè)國際單位。

酶活計(jì)算公式:

式中x:樣品OD值的平均值;a,b:由回歸方程求出;n:酶液稀釋倍數(shù);T:酶液反應(yīng)時(shí)間;0.5:所加酶液的量,mL。

漆酶酶活、錳過氧化物酶酶活和木質(zhì)素過氧化物酶酶活單位(U):上述條件下,每分鐘催化1 umol2,6-DMP,ABTS或VA所需的酶量。計(jì)算中的ε470=49 600(mol·L-1cm)-1,ε420=36 000(mol·L-1cm)-1,ε310=9 300 000(mol·L-1cm)-1。

酶活計(jì)算公式:

式中V1,V2分別代表反應(yīng)體系的總體積及反應(yīng)酶液的體積;ΔA為吸光度的變化值,Δt為反應(yīng)時(shí)間,ε為吸光系數(shù),10:稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腐爛程度毛竹篼理化成分

從表1可以看出,不同腐爛程度毛竹篼的化學(xué)成分是一個(gè)復(fù)雜、不斷變化的過程,成分積累之后易被微生物生長、繁殖、氧化、合成所利用,降低之后微生物分解竹篼基質(zhì)促使成分升高,直至后期剩下少量竹壁未被利用時(shí)(第10腐爛等級(jí)取樣為少量竹壁)。

表1 不同腐爛程度毛竹篼的成分分析Table 1 The analysis of the ingredient of the bamboo stump on different decomposition degree

表2 不同腐爛程度毛竹篼成分與腐爛等級(jí)的相關(guān)性?Table 2 The correlation of ingredient and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

灰分在前期略有波動(dòng),在第5腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為3.32%(本研究以干基計(jì),全文同),中期升高幅度比較大,之后又降低,后期灰分含量升高。從表2可以看出,灰分與腐爛等級(jí)存在極顯著正相關(guān),可能是因?yàn)榇蠓肿游镔|(zhì)被分解氧化以及流失到環(huán)境中后導(dǎo)致整體毛竹篼物質(zhì)減少,而鉀、鈉、鈣的無機(jī)鹽類和二氧化硅等物質(zhì)積累起來,以及毛竹篼的竹壁木質(zhì)素一般最后才分解,所以灰分所占的含量偏高。隨著毛竹篼的分解,營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、氧化等,后期灰分所占的比例越來越高,在第10腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為32.39%。在毛竹篼降解中,熱水抽出物有3個(gè)升高和下降的過程,可見溶于水的物質(zhì)是不斷被分解和利用的。熱水抽出物在第9腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為14.03%,在第10腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為5.44%,后期熱水抽出物達(dá)到最低是毛竹篼被微生物分解、利用的差不多,基本只剩下少量竹壁沒被完全利用。1%NaOH抽出物的含量在一定程度上說明原料受光熱氧化或微生物等作用而變質(zhì)或腐朽的程度。隨著毛竹篼不斷的降解,1%NaOH 抽出物的量基本上先逐漸升高然后下降,然后升高又下降,在第6腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為48.13%,在第1腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為27.70%。可見微生物在毛竹篼降解過程中,前期消耗的速度小于降解的速度,導(dǎo)致低分子量物質(zhì)積累;中間有一個(gè)時(shí)期消耗的速度大于降解的速度,之后消耗速度降慢,低分子量物質(zhì)積累;后期消耗的速度又大于降解的速度,低分子量物質(zhì)減少。

從表1可以看出,綜纖維素、纖維素、酸不溶木質(zhì)素含量都處于不斷降低和升高的變化過程中。綜纖維素在第1腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為58.53%,在第8腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為27.54%。從表2可以看出,綜纖維素與腐爛等級(jí)存在顯著負(fù)相關(guān),即隨著腐爛等級(jí)的增加綜纖維素含量降低,這說明在腐爛過程中綜纖維素含量在所占的物質(zhì)中總體比例減少,這是微生物分解和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。綜纖維素與灰分、1%NaOH抽出物接近顯著負(fù)相關(guān),即綜纖維素含量減少,灰分、1%NaOH抽出物含量增加,這說明大分子量的物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì),符合物質(zhì)增減平衡。

從表1可以看出,纖維素含量在第2腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為41.45%,在第7腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為24.67%。從表2可以看出,纖維素與綜纖維素接近顯著正相關(guān),這說明在腐爛過程中綜纖維素與纖維素含量總體變化趨勢(shì)基本一致。從表1可以看出,酸不溶木質(zhì)素在第5腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為50.67%,在第9腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為25.15%。從表2可以看出,酸不溶木質(zhì)素與腐爛等級(jí)接近顯著負(fù)相關(guān),酸不溶木質(zhì)素與灰分存在極顯著負(fù)相關(guān)。在毛竹篼降解過程中酸不溶木質(zhì)素隨著腐爛等級(jí)的增加基本呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì),酸不溶木質(zhì)素含量的減少能極顯著的導(dǎo)致灰分含量的增加。木質(zhì)素使木質(zhì)部維持極高的硬度以承拓整株植物的重量,因此,毛竹篼在后期變的疏松易爛可能與較低的木質(zhì)素含量和高灰分含量有關(guān)。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 The standard curve of glucose

2.3 不同腐爛程度毛竹篼的纖維素酶活

表3 不同腐爛程度毛竹篼的纖維素酶活Table 3 The cellulose enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree

從表3和圖2我們可以看出,在整個(gè)毛竹篼腐爛過程中,三種酶活在前期和后期比較低,中期比較高;棉花酶活高于濾紙酶活高于CMC纖維素酶活,酶活在降解過程中開始是輕微的降低或升高,之后達(dá)到最高值,然后開始降低,之后有輕微的降低或升高,在第10腐爛等級(jí)時(shí)都達(dá)到最低值。從表4可以看出,棉花酶活與濾紙酶活存在極顯著正相關(guān);CMC酶活與濾紙酶活存在極顯著正相關(guān),CMC酶活與棉花酶活接近顯著正相關(guān)。從表3可以看出,棉花酶活在第3腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為155.90×103U/kg,濾紙酶活在第5腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為116.79×103U/kg,CMC纖維素酶活在第5級(jí)腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為76.66×103U/kg。棉花酶活、濾紙酶活、CMC纖維素酶活在第10腐爛等級(jí)時(shí)的最低值分別為:46.14×103U/kg、49.81×103U/kg、20.42×103U/kg。李超[8]采用竹腐材料為樣品分離到的YJ-3菌固態(tài)發(fā)酵時(shí)CMC酶活、濾紙酶活、棉花酶活性分別能達(dá)到15.52 U/g,9.13 U/g,3.67 U/g,而F13幾乎沒有檢測(cè)到纖維素酶活性。郝月等[16]從各種土壤及飼料中分離到12株能分解纖維素的菌株,測(cè)定的CMC酶活基本都大于FPA酶活大于天然纖維素酶活。馬懷良等[17]從長期堆放稻草的土壤中分離出纖維素分解能力較強(qiáng)的霉菌菌株NM5,其C1酶活力、羧甲基纖維素酶活力、濾紙酶活力分別為 0.017 0、0.717 4、1.343 5 IU·mL-1。棉花酶活、CMC酶活與濾紙酶活在毛竹篼中都存在且酶活較高,而且極顯著正相關(guān),可見三種酶活的規(guī)律性較強(qiáng)。多樣的纖維素酶有利于毛竹篼纖維素的降解,有規(guī)律的纖維素酶活變化可為毛竹篼的降解提供參考。

圖2 不同腐爛程度毛竹篼的纖維素酶活變化曲線Fig. 2 The cellulose enzyme activity curve on different degree of rotting bamboo stump

2.4 不同腐爛程度毛竹篼的木質(zhì)素酶活

從表5和圖3我們可以看出,三種酶活在前期和后期比較低,中期比較高;漆酶酶活基本高于錳過氧化物酶活高于木質(zhì)素過氧化物酶活,在第7和第9腐爛等級(jí)時(shí)錳過氧化物酶活高于漆酶酶活,酶活在毛竹篼腐爛過程中總是處于一個(gè)降低之后升高或升高之后降低的不斷變化過程中。

表4 不同腐爛程度毛竹篼纖維素酶活與腐爛等級(jí)的相關(guān)性Table 4 The correlation of cellulose enzyme activity and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

漆酶酶活在第4腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為18.15×103U/kg,在第7腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為0.63×103U/kg;錳過氧化物酶活在第7腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為9.60×103U/kg,在第6腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為0.66×103U/kg;木質(zhì)素過氧化物酶活在第9級(jí)腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最高值為0.32×103U/kg,在第10腐爛等級(jí)時(shí)達(dá)到最低值為0.0026×103U/kg。從表6我們可以看出,三種酶活不存在顯著相關(guān)性。

表5 不同腐爛程度毛竹篼的木質(zhì)素酶活Table 5 The lignin enzymes activity of the bamboo stump on different decomposition degree

圖3 不同腐爛程度毛竹篼的木質(zhì)素酶活變化曲線Fig. 3 The lignin enzymes activity curve of the bamboo stump on different decomposition degree

表6 不同腐爛程度毛竹篼木質(zhì)素酶活與腐爛等級(jí)的相關(guān)性Table 6 The correlation of lignin enzymes activity and decomposition levels of the bamboo stump on different decomposition degree

很多菌株基本不產(chǎn)木質(zhì)素酶,有些只產(chǎn)一種或兩種,產(chǎn)三種木質(zhì)素酶的很少。尹立偉等[18]在測(cè)定灰樹花(珍稀食藥用菌和白腐菌)木質(zhì)素降解酶時(shí)添加底物木屑和2,6-DMP后,MnP最大酶活為8.06U/L,漆酶最大酶活為9. 85U/L,但不產(chǎn)生LiP。在毛竹篼降解過程中,三種酶活都能檢測(cè)到,說明自然降解過程中有多種微生物參與,漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶能共同作用降解毛竹篼。

3 結(jié)論與討論

(1)在不同腐爛程度的毛竹篼中,灰分與腐爛等級(jí)存在極顯著正相關(guān),綜纖維素與腐爛等級(jí)存在顯著負(fù)相關(guān),綜纖維素與灰分、1%NaOH抽出物接近顯著負(fù)相關(guān),酸不溶木質(zhì)素與腐爛等級(jí)接近顯著負(fù)相關(guān),酸不溶木質(zhì)素與灰分存在極顯著負(fù)相關(guān)。棉花酶活與濾紙酶活存在極顯著正相關(guān);CMC酶活與濾紙酶活存在極顯著正相關(guān),CMC酶活與棉花酶活接近顯著正相關(guān)。漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶三種木質(zhì)素酶活都能檢測(cè)到。降解過程中成分含量變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律和相關(guān)性,并含有多樣、豐富的纖維素酶和木質(zhì)素酶,酶活也呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性和相關(guān)性。

(2)纖維素酶和木質(zhì)素酶在前期時(shí),微生物數(shù)量不高,毛竹壁的緊密結(jié)構(gòu)又較難侵入,所以酶活都比較低;在中期物質(zhì)豐富的時(shí)候,微生物大量繁殖、生長,酶活偏高;后期隨著物質(zhì)的不斷降解,可利用的物質(zhì)不多,微生物受到抑制甚至死亡,導(dǎo)致酶活處于較低水平。

(3)毛竹篼自然降解過程中含有豐富的酶類物質(zhì),這是多種微生物分泌的結(jié)果。因此,將自然腐爛毛竹篼中的降解菌富集培養(yǎng)后再用于新砍伐后毛竹篼的降解;或者從自然毛竹篼中提取高效降解微生物,通過富集培養(yǎng)用于新砍伐后毛竹篼的降解,具有一定的研究價(jià)值和實(shí)際意義。

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Research on ingredient and enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree

LI Mei-qun, AI Wen-sheng, MENG Yong, YANG Ming, TU Jia, PU Xiang-yun, LIU Xiang-bo
(Hunan Forestry Academy, Changsha 410004, Hunan, China)

The analysis of composition and enzyme activity of the bamboo stump on different decomposition degree, results showed that each ingredient and enzyme activity present certain regularity and correlation in the degradation process. During the process of degradation,ash,hot water extract, 1%NaOH extract, cellulose,cellulose, acid-insoluble lignin high values was 32.39%, 14.03%,48.13%, 41.45%, 50.67%; minimum values was 3.32%, 5.44%, 27.7%, 24.67%, 25.15%. Filter paper enzyme activity and CMC enzyme activity and cotton cellulose enzyme supreme values was 116.79×103U/kg, 155.90×103U/kg, 76.66×103U/kg. Laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase enzyme activity maximum values was 18.15×103U/kg, 9.60×103U/kg, 0.32×103U/kg. Earlier and later stage enzyme activity was low, when medium-term ingredient rich, microbial growth, reproduction, enzyme activity was high.

bamboo stump; cellulase; laccase; manganese peroxidase; lignin peroxidase

S795.7

A

1673-923X(2016)04-0035-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.04.007

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-01-04

湖南省林業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新基金(2013LQJ09);高品質(zhì)毛竹筍高效培育技術(shù)示范推廣([2013]XT05)

李美群,碩士研究生,助理研究員

艾文勝,研究員;E-mail:aiwensheng@163.com

李美群,艾文勝,孟 勇,等. 不同腐爛程度毛竹篼成分及酶活研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2016, 36(4): 35-40.

[本文編校:吳 彬]

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