行 璇，劉雄倫，3*，陳海龍 ，楊豐宇，李永聰，廖 花，游 亮，劉金靈，3，戴良英，王國梁，3

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128； 2 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128；3 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128； 4 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128)

?

分子標(biāo)記輔助選擇Pi9基因改良R288的稻瘟病抗性

行 璇1，2，劉雄倫1，2，3*，陳海龍1，2，楊豐宇1，2，李永聰1，2，廖 花1，2，游 亮1，2，劉金靈1，2，3，戴良英2，3，4，王國梁1，2，3

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128； 2 作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128；3 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128； 4 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128)

根據(jù)已克隆的廣譜持久抗瘟基因Pi9的DNA序列設(shè)計(jì)功能標(biāo)記Clon2-1，通過分子標(biāo)記輔助選擇開展回交育種實(shí)踐，定向改良水稻恢復(fù)系R288的稻瘟病抗性。獲得如下結(jié)果：Clon2-1為共顯性標(biāo)記，在Pi9基因供體親本75-1-127和受體親本R288之間多態(tài)性明顯且穩(wěn)定；Clon2-1標(biāo)記基因型對稻瘟病抗性表型的選擇效率達(dá)100%。通過分子標(biāo)記輔助選擇和連續(xù)回交自交，獲得了含Pi9基因的BC6F3群體，在此基礎(chǔ)上篩選鑒定出1個(gè)高抗稻瘟病水稻新品系‘R288-Pi9’，用其與培矮64S配組獲得的雜交組合同樣表現(xiàn)出高水平稻瘟病抗性。

水稻；稻瘟病抗性；Pi9基因；分子標(biāo)記輔助選擇育種

水稻(OryzasativaL.)是全球的重要糧食作物[1]。稻瘟病(rice blast disease)是水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，它地理分布范圍廣，并且可以發(fā)生在水稻生長的各個(gè)時(shí)期，是水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素[2]。長期實(shí)踐表明，解決稻瘟病危害最有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的策略是發(fā)掘、鑒定和利用廣譜持久抗性基因，選育和推廣抗病品種[3，4]。然而，水稻稻瘟病抗性是典型的質(zhì)量數(shù)量性狀，容易受環(huán)境影響，常規(guī)抗病育種中對表型選擇不準(zhǔn)確，育種效率低。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular Marker-assisted Selection，MAS)育種，即利用與基因連鎖(或基因內(nèi))標(biāo)記，在育種過程中對目標(biāo)單株進(jìn)行標(biāo)記基因型鑒定和選擇，尤其是共顯性分子標(biāo)記還能有效鑒定純合基因型，可以大大提高育種效率、縮短育種周期，常用于連續(xù)回交育種定向改良受體目標(biāo)性狀，是現(xiàn)代分子育種的重要手段[5，6]。Pi9是一個(gè)已克隆的廣譜持久抗稻瘟病基因，位于水稻第6號染色體短臂靠近著絲粒位置的Pi2/9位點(diǎn)[7，8]。本研究以秈稻品系75-1-127作為Pi9基因供體親本，水稻恢復(fù)系R288作為受體親本及輪回親本，利用Pi9分子生物學(xué)信息開發(fā)基因內(nèi)特異DNA標(biāo)記開展MAS育種實(shí)踐，以期改良R288及其雜交種的稻瘟病抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

Pi9基因供體親本75-1-127；Pi9基因受體親本及輪回親本R288；稻瘟病感病對照水稻品系CO39；蜀恢527/75-1-127的BC6F1群體(用于分子標(biāo)記選擇效率分析)、R288/75-1-127的BC6F3群體、改良純系R288-Pi9及其所配雜交種培矮64S/R288-Pi9；17份來自不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株(表1)。

1.2 方法

1.2.1 分子標(biāo)記的開發(fā)

Pi9屬于NBS-LRR 類基因，含有2個(gè)內(nèi)元，長度分別為5362 bp和128 bp；cDNA 全長4009 bp，包括3099 bp的編碼區(qū)和910-bp 3′ UTR。本研究根據(jù)Pi9基因序列設(shè)計(jì)和篩選了一個(gè)基于PCR技術(shù)的共顯性特異功能標(biāo)記Clon2-1，分析Clon2-1在75-1-127和R288之間的多態(tài)性及其基因型輔助選擇效率，并用于MAS育種。

1.2.2 室內(nèi)接種及田間病圃表型鑒定

為分析供試水稻材料的稻瘟病抗性及抗菌譜，進(jìn)行室內(nèi)接種。將75-1-127、R288和感病對照CO39分別播種于添加了花卉營養(yǎng)土的塑料育苗盤中，在26～28℃，12 h光照的人工氣候室中培養(yǎng)。4葉期，用0.02%的吐溫水溶液配制濃度約1×105/mL的單個(gè)小種(菌株)稻瘟菌分生孢子懸浮液，室內(nèi)噴霧活體接種。接種后在溫度為26℃的條件下先暗培養(yǎng)24 h，再進(jìn)行5～6 d的正常光照且高濕度培養(yǎng)。感病對照CO39出現(xiàn)明顯病斑后，參照Bonman[9]的0～5級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查抗病反應(yīng)表型(0～2級為抗病類型，3～5級為感病類型)。

抗性頻率計(jì)算：

抗性頻率=成功接種后表現(xiàn)不致病小種(菌株)數(shù)÷接種小種(菌株)總數(shù)×100%

2015～2016年連續(xù)兩年，于5～6月份在瀏陽大圍山天然病圃完成各供試材料的田間苗瘟抗性鑒定。2015年重點(diǎn)分析鑒定R288/75-1-127的BC6F3群體抗性及其分離情況，篩選抗病純系；2016年重點(diǎn)鑒定雜交種培矮64S/R288-Pi9的稻瘟病田間抗性。5月中旬播種，6月中旬調(diào)查抗性表型，抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.2.3 模板DNA提取及標(biāo)記基因型鑒定

對75-1-127、R288及回交或自交群體隨機(jī)單株，各取約0.2 g 新鮮嫩葉置于2.0 mL離心管中液氮研磨，CTAB法[10]提取總DNA。

利用Clon2-1標(biāo)記引物對各DNA樣品做PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：DNA模板1.0 μL，5 U/μL 大連寶生物r-Taq 0.1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL primer pairs 1.0 μL，10 Buffer 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 30 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。

1.2.4 分子標(biāo)記Clon2-1的選擇效率分析

為分析分子標(biāo)記Clon2-1的輔助選擇效率，2015年用蜀恢527×75-1-127 的BC6F1群體，在病圃誘導(dǎo)發(fā)病后隨機(jī)調(diào)查各單株抗性并編號，隨后用Clon2-1分析各單株標(biāo)記基因型，結(jié)合各單株基因型與抗性表型對應(yīng)結(jié)果，分析Clon2-1的選擇效率。

1.2.5 改良抗病純系的鑒定與篩選

利用分子標(biāo)記Clon2-1，于2009～2014年經(jīng)長沙—三亞兩地開展MAS育種實(shí)踐，于2014年獲得R288/75-1-127的BC6F2群體，并進(jìn)一步單株套袋自交獲得14個(gè)BC6F3株系。2015年夏季在瀏陽大圍山病圃做抗性表型鑒定后，結(jié)合單株基因型確認(rèn)，獲得抗病純系，并根據(jù)田間主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，篩選優(yōu)良抗病純系。

1.2.6 改良抗病純系主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

2015年通過田間記載和取樣分析，比較獲選優(yōu)良抗病純系與受體親本R288的主要農(nóng)藝性狀。兩個(gè)群體各隨機(jī)選取15株定點(diǎn)調(diào)查分析，農(nóng)藝性狀包括全生育期、株高、劍葉長寬比、穗長、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、千粒重。記載考種標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)[11]，相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel和DPS軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試親本水稻的稻瘟病抗性表現(xiàn)及抗菌譜

利用17份來自國內(nèi)外不同稻區(qū)的稻瘟菌菌株分別對Pi9基因供體親本75-1-127、受體親本R288及感病對照CO39進(jìn)行室內(nèi)接種，結(jié)果表明各供試水稻材料的抗性表現(xiàn)和抗菌譜差異非常顯著(表1)。75-1-127對其中15份菌株表現(xiàn)高水平抗性，但對來自韓國的ROR1和來自日本的KOH兩份菌株表現(xiàn)感病，抗性頻率為88.2%。受體親本R288只對其中6份菌株表現(xiàn)抗病，抗性頻率為35.3%，表明其稻瘟病抗性亟待改良。但有意思的是R288對KOH表現(xiàn)抗病，暗示R288中可能存在別的稻瘟病抗性基因。感病對照CO39對所有供試菌株均表現(xiàn)感病。田間病圃稻瘟病抗性鑒定結(jié)果顯示，75-1-127表現(xiàn)高水平持久抗性，而R288和CO39高度感病。

表1 供試水稻親本材料的稻瘟病菌抗譜Table 1 Resistance spectrum of two rice parents to seventeen M.oryzae isolates

(續(xù)表1)

2.2 分子標(biāo)記Clon2-1的多態(tài)性及選擇效率

用Clon2-1標(biāo)記引物分別對供體和受體親本的基因組DNA模板做PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析標(biāo)記基因型，結(jié)果在75-1-127基因組中擴(kuò)增出一條約500 bp的穩(wěn)定清晰條帶，而在R288基因組中獲得一條約850 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。表明Clon2-1是一個(gè)在雙親間多態(tài)性明顯且穩(wěn)定的共顯性DNA標(biāo)記，可用它開展分子標(biāo)記輔助選擇育種改良受體親本的稻瘟病抗性。

圖1 分子標(biāo)記Clon2-1在雙親間的多態(tài)性表現(xiàn)Fig.1 Polymorphism produced by marker Clon2-1 between two parents

為檢驗(yàn)Clon2-1的輔助選擇效率，將蜀恢527/75-1-127 BC6F1群體的隨機(jī)取樣單株分別做病圃表型鑒定和標(biāo)記基因型分析。結(jié)果表明Clon2-1在BC6F1的全部5個(gè)抗病單株中均擴(kuò)增出兩條分別來自兩個(gè)親本的特異條帶，顯示為雜合基因型；全部7個(gè)感病單株中均只擴(kuò)增出一條來自受體的特異條帶，顯示為純合基因型(圖2)。表明本試驗(yàn)中Clon2-1的標(biāo)記基因型對抗病性表型選擇效率達(dá)100%。

圖2 分子標(biāo)記Clon2-1對抗性表型的選擇效率分析Fig.2 Selection efficiency analysis of molecular marker Clon2-1 for phenotype

2.3 改良抗病純系的鑒定與篩選

利用Clon2-1開展連續(xù)多年的MAS育種實(shí)踐，于2014年得到R288/75-1-127的BC6F2群體，在此基礎(chǔ)上獲得14個(gè)BC6F3株系。2015年對14個(gè)BC6F3株系進(jìn)一步做單株基因型分析和病圃表型鑒定，獲得3個(gè)遺傳穩(wěn)定的抗病純系，并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀調(diào)查篩選出1個(gè)優(yōu)良抗病純系R288-Pi9(圖3，圖4)。

圖3 改良抗病純系R288-Pi9的鑒定Fig.3 Identification of the improved blast resistant homozygous line R288-Pi9

2.4 改良抗病純系R288-Pi9的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

田間觀察記載及取樣初步分析結(jié)果表明，改良抗病純系R288-Pi9與受體R288之間，主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)均無顯著性差異(表2)，表明經(jīng)過連續(xù)多代回交與自交，兩者遺傳背景已經(jīng)非常相似，除Pi9基因差異外，兩者已是近等基因系，達(dá)到了定向改良R288稻瘟病抗性的目標(biāo)。

表2 改良抗病純系R288-Pi9與受體親本R288主要農(nóng)藝性狀比較Table 2 Main agronomic traits analysis of R288-Pi9 and its receptor

2.5 雜交種的抗病性表現(xiàn)

2016年6月瀏陽大圍山病圃抗性鑒定結(jié)果表明，用改良抗病純系配制的雜交組合“培矮64S/R288-Pi9”表現(xiàn)出與Pi9基因供體親本一樣的高水平抗性；而用受體親本R288配制的雜交種“培矮64S/R288”表現(xiàn)為高度感病(圖4)，說明Pi9基因的顯性抗性性狀能穩(wěn)定遺傳，通過MAS育種不但可以改良受體親本的稻瘟病抗性，而且可以改良雜交種的抗性，在水稻稻瘟病抗性雜種優(yōu)勢利用中具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖4 改良抗病純系R288-Pi9及其雜交種的田間病圃抗性表現(xiàn)Fig.4 Blast resistance performance of R288-Pi9 and its hybrid in nursery

3 討論

水稻稻瘟病抗性是典型的質(zhì)量數(shù)量性狀，容易受環(huán)境影響，常規(guī)育種中的表型選擇往往不準(zhǔn)確，育種效率低。MAS育種是通過標(biāo)記基因型分析和選擇代替表型選擇，選擇準(zhǔn)確性和育種效率大大提高。本課題組自2009年以來，利用已克隆的廣譜持久抗瘟基因Pi9和已精細(xì)定位的廣譜持久抗瘟基因Pigm的分子生物學(xué)信息，開發(fā)出了多個(gè)高效分子標(biāo)記，用它們開展MAS育種實(shí)踐，定向改良一批感病水稻品種(特別是雜交稻親本)的稻瘟病抗性，效果很好[12～15]。本研究中，Clon2-1標(biāo)記基因型對抗病性表型的選擇效率達(dá)100%，用該標(biāo)記在各回交及自交世代中連續(xù)輔助選擇，育成了一個(gè)抗病新品系‘R288-Pi9’，為進(jìn)一步培育抗病水稻新品種(組合)奠定了基礎(chǔ)。

由于稻瘟菌小種的多樣性及快速變異性，一定程度上限制了稻瘟病抗性基因和抗性水稻品種的推廣應(yīng)用，而聚合育種是解決這個(gè)問題的有效策略。應(yīng)在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上，開展以分子標(biāo)記輔助選擇為基礎(chǔ)的多基因聚合育種，以培育具有廣譜持久稻瘟病抗性的水稻新品種(組合)。

[1] Delseny M，Salses J，Cooke R，et al.Rice genomics：Present and future[J].Plant Physiology & Biochemistry，2001，39(1)：323-334.

[2] Ou SH.Rice Diseases[M].Kew，England：Common Wealth Mycological Institute，1985.109-201.

[3] Zeigler RS，Tohme J，Nelson J，et al.Linking blast population analysis to resistance breeding：A proposed strategy for durable resistance[A].In：Zeigler RS，Leong SA，Teng PS.Rice Blast Disease[C].Wallingford，UK：CAB International and IRRI，1994.16-26.

[4] Fomba SN，Taylor DR.Rice blast in West Africa：its nature and control[A].In：Zeigler RS，Leong SA，Teng PS.Rice Blast Disease[C].Wallingford，UK：CAB International and IRRI，1994.343-355.

[5] 危文亮，趙應(yīng)忠.分子標(biāo)記在作物育種中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2000(2)：12-16.

[6] 馮建成.分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在水稻育種上的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22(2)：43-47.

[7] Liu G，Zeng L，Wang G.Two broad-spectum blast resistance gene，Pi9(t) andpi2(t)，are physically linked on rice chromosome 6[J].Molecular Genetics and Genomics，2002，267(4)：472-480.

[8] Qu SH，Liu GF，Zhou B，et al.The broad-spectrum blast resistance genePi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice[J].Genetics，2006，172(3)：1901-1914.

[9] Bonman JM，Vergel D，Dios TI，et al.Physiologic specialization of Pyricularia oryzae in the philippines[J].Plant Dis，1986，70：767-769.

[10]宋 敏，張?jiān)茖O.4種提取水稻基因組DNA方法的比較[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，23(1)：74-76.

[11]應(yīng)存山.中國稻種資源[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1993.530-531.

[12]文 婷，梁 毅，江 南，等.利用Pi9基因序列標(biāo)記輔助選擇改良秈稻稻瘟病抗性[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，38(3)：262-266.

[13]楊婷婷，梁 毅，行 璇，等.水稻Pi9基因序列標(biāo)記的開發(fā)及其抗瘟育種應(yīng)用[J].作物研究，2014，28(3)：231-235.

[14]梁 毅，楊婷婷，文 婷，等.水稻廣譜抗瘟基因Pigm緊密連鎖分子標(biāo)記開發(fā)及其育種應(yīng)用[J].雜交水稻，2013，28(4)：63-68.

[15]譚令辭，行 璇，楊婷婷，等.分子標(biāo)記輔助選擇Pi9基因培育抗稻瘟病水稻新品系[J].作物研究，2015，29(4)：348-351.

Improving Blast Resistance of Rice Restorer R288 by Molecular Marker-Assisted Selection ofPi9 Gene

XING Xuan1，2，LIU Xionglun1，2，3*，CHEN Hailong1，2，YANG Fengyu1，2，LI Yongcong1，2，LIAO Hua1，2，YOU Liang1，2，LIU Jinling1，2，3，DAI Liangying2，3，4，WANG Guoliang1，2，3

(1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；3 Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops，Changsha，Hunan 410128，China；4 College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

To improve blast resistance of rice restorer line R288，an inner-gene functional marker Clon2-1 was designed based on DNA sequence of the cloned broad-spectrum blast resistance genePi9，and molecular marker-assisted breeding was implemented.The main results were as the follows：Clon2-1 is a co-dominant marker and showed obviously and stable polymorphism betweenPi9 gene donor parent 75-1-127 and the receptor R288，and selection efficiency of Clon2-1 marker genotype for rice blast resistance phenotype reached 100%.The BC6F3population harboringPi9 with R288 background was developed through consecutive backcross and self-pollination，and thereupon a resistant homozygous line R288-Pi9 was bred.The hybrid produced by R288-Pi9 and the photo-thermal sensitive genic male sterile line Peiai 64S，also showed high-level blast resistance.

rice；blast resistance；Pi9 gene；molecular marker-assisted selection breeding

2016-06-12

行 璇(1990-)，女，碩士研究生，Email：1003624951@qq.com。*通信作者，Email：xionglun@hunau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(3l171526)；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2015ZX08001-002)；湖南省重大專項(xiàng)(2015NK1001)；教育部高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1239)。

S511.035.3

A

1001-5280(2016)05-0487-05

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.02