徐小萬，李 穎，王恒明，李 濤，何水林，官德義

（1.廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；2. 福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

辣椒雜交種與親本苗期葉片基因差異表達(dá)分析

徐小萬1，李 穎1，王恒明1，李 濤1，何水林2，官德義2

（1.廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640；2. 福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

目前辣椒雜種優(yōu)勢(shì)的利用已取得很大成效，但是辣椒雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理仍然不明。辣椒雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理是一個(gè)重要的生物學(xué)和農(nóng)學(xué)課題。為比較分析苗期辣椒雜交種（D6×D7，D7×D6）及其親本（D6、D7）的成熟功能葉轉(zhuǎn)錄譜，把4個(gè)功能葉cDNA 文庫在 Illumina HiSeq 2000 平臺(tái)進(jìn)行 RNASeq 分析。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到0.6 億條原始的 reads，經(jīng)過篩選獲得 0.44 億條高質(zhì)量reads（100 bp）。基因存在與缺失變異統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，單親表達(dá)一致型有1068個(gè)（6.20%）和780個(gè)（4.56%）基因分別在正交（D6×D7）和反交（D7×D6）中被檢測(cè)到，在4種基因存在與缺失變異類型中所占比例比較高。對(duì)雙親表達(dá)量不同的基因作進(jìn)一步表達(dá)模式分析，結(jié)果表明，雜種（正、反交）與雙親相比，大部分基因呈均非加性表達(dá)，加性表達(dá)基因比例不足8%，在非加性表達(dá)基因中，超顯性表達(dá)的基因占大多數(shù)，正、反交分別為66.08%和62.96%，這與偏單親的顯性模型分析結(jié)論相一致。

辣椒；雜種優(yōu)勢(shì)；轉(zhuǎn)錄組；RNA-seq；

雜種優(yōu)勢(shì)是指遺傳結(jié)構(gòu)不同的兩個(gè)群體（或個(gè)體）雜交所產(chǎn)生的F1代在生產(chǎn)、生活、繁殖和適應(yīng)性等方面優(yōu)于雙親均值或超過兩個(gè)親本的現(xiàn)象［1］。雜交育種是根據(jù)品種的選育目標(biāo)選配親本，通過雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分、自交系的培育、對(duì)自交系一般配合力和特殊配合力的檢測(cè)等手段，獲得新品種的重要育種途徑之一，但執(zhí)行起來不僅費(fèi)力費(fèi)時(shí)而且育種成本也很高。如果雜種優(yōu)勢(shì)被分子工具所預(yù)測(cè)，進(jìn)而快速篩選出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合，將大大提高雜交育種的效率，這也是育種學(xué)家對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理非常感興趣的原因［2-5］。然而雜種優(yōu)勢(shì)的研究雖有百余年的歷史，但其根本機(jī)理仍然未知［6］。

辣椒是世界上最重要的蔬菜作物之一，既可鮮食，又是重要的調(diào)味料［7］。辣椒雜種優(yōu)勢(shì)分子機(jī)理的探索已有約50年的歷史，特別是近年來各種分子標(biāo)記技術(shù)在辣椒群體劃分及遺傳距離研究中取得了一定的進(jìn)展［8-16］。學(xué)者們利用上述各種分子標(biāo)記對(duì)辣椒雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)進(jìn)行了大量研究，然而其結(jié)果卻不盡相同。辣椒雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理是一個(gè)極其復(fù)雜的問題，應(yīng)該從表型、生理生化、遺傳學(xué)、基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等層面開展研究。從基因表達(dá)的角度對(duì)作物雜種優(yōu)勢(shì)展開相關(guān)探索，如模式植物水稻［17-19］、玉米［20-22］和擬南芥［23］已有成功的范例，但從基因表達(dá)層面來分析辣椒雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理仍處于空白狀態(tài)。本研究采用RNA-Seq分析辣椒雜交種F1（正反交）與雙親功能葉的基因差異表達(dá)，可為認(rèn)識(shí)辣椒雜種優(yōu)勢(shì)分子機(jī)理帶來新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)的辣椒組合（D6×D7）、反交組合（D7×D6）以及其雙親為試材。4個(gè)辣椒材料的種子播種于廣東省農(nóng)科院蔬菜所白云實(shí)驗(yàn)基地。田間種植 4周后，取第6片真葉為樣品立即浸入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序及基因表達(dá)量計(jì)算 用改良的CTAB 法分別抽提上述4個(gè)辣椒材料的總 RNA，利用Oligo （dT）富集得到 mRNA，將其分別打斷成 200 nt，隨機(jī)引物六聚體反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，經(jīng)末端修復(fù)、加 polyA 和接頭后PCR擴(kuò)增，最后進(jìn)行 Illumina 測(cè)序。本研究共進(jìn)行4個(gè)數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序。將 Clean reads 比對(duì)到參考基因（尊辣1號(hào)）［24］，最終獲得 4 個(gè)樣本的基因表達(dá)譜。使用 RPKM 法（Reads Per Kb per Million reads）［25］計(jì)算基因表達(dá)量，得到的基因表達(dá)量可直接用于比較不同樣本間的基因表達(dá)差異。

1.2.2 基因表達(dá)模式劃分 雜種和雙親相比，基因差異表達(dá)呈現(xiàn)以下5種模式：雙親共沉默型、親本特異表達(dá)型、雜種特異表達(dá)型、單親表達(dá)一致型和雙親及雜種共表達(dá)型。前4種模式屬基因表達(dá)質(zhì)的差異，即存在與缺失變異，而第5種模式則屬基因表達(dá)量的差異。

雜種與雙親相比，另一種方法可依據(jù)A值劃分為高親、中親和低親3大類7小類［26］：

式中，high parent、F1、low parent分別為表達(dá)量高的親本、雜交種和表達(dá)量低的親本的表達(dá)量。高親有2個(gè)小類 （A值＜0.0，A值為0～0.2），中親有3個(gè)小類（A值為0.2～0.4、0.4～0.6、0.6～0.8），低親有2個(gè)類別（A值為0.8～1.0、A值＞1.0）。

1.2.3 基因在雙親中表達(dá)量不同時(shí)基因表達(dá)模式劃分 對(duì)雙親表達(dá)量不同的基因作進(jìn)一步的表達(dá)模式分析，d/|a|的計(jì)算公式如下：

式中，F(xiàn)1為雜種的表達(dá)量，μ為雙親表達(dá)量的均值，P1為親本1的表達(dá)量。依據(jù)d/|a|值可劃分為負(fù)超顯性、負(fù)顯性、部分顯性（負(fù)）、加性、部分顯性（正）、正顯性和正超顯性7類表達(dá)模式，其d/|a|值分別為（-∞，-1.2）、［-1.2，-0.8）、［-0.8，-0.2）、［-0.2，0.2］、（0.2，0.8］、（0.8，1.2］、（1.2，+∞）。

1.2.4 差異基因的劃分標(biāo)準(zhǔn)及Pathway 顯著性富集分析 差異表達(dá)基因?yàn)?FDR≤0.05且倍數(shù)差異不低于 2 倍的基因。Pathway 顯著性富集分析以 KEGG pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組相比較后差異表達(dá)基因中顯著性富集的 Pathway。FDR≤0.05 的Pathway 定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway。通過 Pathway顯著性富集能推定差異表達(dá)基因可能參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 與辣椒基因組數(shù)據(jù)比對(duì)

為了分析苗期辣椒雜交種及其親本的成熟功能葉轉(zhuǎn)錄譜，我們將準(zhǔn)備好的功能葉cDNA文庫在 Illumina HiSeq 2000 平臺(tái)進(jìn)行 RNASeq 分析。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到0.6 億條原始的 reads，經(jīng)過篩選獲得 0.44 億條高質(zhì)量的reads（100 bp）用于后續(xù)分析。使用Tophat軟件將 Clean reads比對(duì)到辣椒（尊辣1號(hào)）參考基因序列［24］，比對(duì)上的比例在 83.74%～85.43%之間，唯一比對(duì)上的比例在70.32%～79.69%之間。將4個(gè)樣品 reads 比對(duì)到辣椒參考序列（Pepper.v.1.5），65.82%～67.13%的 reads 比對(duì)到外顯子區(qū)域，2.49%～2.96%的 reads 比對(duì)到內(nèi)含子區(qū)域，30.36%～31.57% 的 reads 比對(duì)到基因間區(qū)域（表1）。

表1 RNA-seq data比對(duì)統(tǒng)計(jì)

2.2 基因表達(dá)模式劃分

2.2.1 基因存在與缺失變異統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，正交組合D6×D7中共有17 217個(gè)基因表達(dá)，其中有15 128個(gè)（87.87%）在雙親和雜種中都表達(dá)；反交組合D7×D6中共有17 096個(gè)基因表達(dá)，其中有14 927（87.31%）個(gè)基因在雙親和雜種都表達(dá)。相比較而言，反交組合D7×D6中比正交組合少約120個(gè)基因；在4種存在與缺失變異類型中，單親表達(dá)一致型和雜種特異表達(dá)型屬于顯性模型。

表2 基因存在與缺失變異統(tǒng)計(jì)

2.2.2 基于表達(dá)量的高親、中親、低親分析 根據(jù)分類方法，有9078、6254個(gè)基因分別在雜種D6×D7和D7×D6以高親模式表達(dá)；有3419、3443個(gè)基因分別在雜種D6×D7 和D7×D6以中親模式表達(dá)；有4816和7616個(gè)基因分別在D6×D7和D7×D6以低親模式表達(dá)。 從圖1可知，圖兩側(cè)的表達(dá)量比較高，說明偏單親的顯性模型是主要的，暗示優(yōu)良的顯性基因在雜種的聚合對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)也是有貢獻(xiàn)的。

2.3 基因在雙親中表達(dá)量不同時(shí)基因表達(dá)模式劃分

對(duì)雙親表達(dá)量不同的基因作進(jìn)一步的表達(dá)模式分析，結(jié)果（表3）表明，雜種（正交、反交）與雙親相比，大部分基因均呈非加性表達(dá)，加性表達(dá)基因比例不足8%，在非加性表達(dá)基因中，超顯性表達(dá)的基因占大多數(shù)，正交、反交分別為66.08%和62.96%，這種分析方法恰好與圖1的分析結(jié)論相一致；而顯性表達(dá)的基因比例較低，正交、反交分別為12.50%和13.82%；部分顯性表達(dá)的基因居中。在超顯性表達(dá)的基因中，正交、反交雜種F1，正超顯性表達(dá)個(gè)數(shù)約大于負(fù)超顯性。

圖1 基于表達(dá)量的高親、中親、低親分析結(jié)果

2.4 兩兩比較差異基因表達(dá)分析及Pathway 顯著性富集分析結(jié)果

用RPKM值估計(jì)基因的表達(dá)水平，RPKM值的變化范圍是0～104。以FDR ≤ 0.05且│log2 （FC）│≥ 2 為標(biāo)準(zhǔn)，在親本D6和D7間檢測(cè)到351個(gè)差異表達(dá)基因，僅有17個(gè)基因在雜種D6×D7和 D7×D6中存在差異表達(dá)。親本與雜種間的差異表達(dá)基因數(shù)為197～342個(gè)。親本與雜種間的差異基因表達(dá)個(gè)數(shù)小于雙親間差異基因表達(dá)個(gè)數(shù)，但大于正反交雜種間差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)（表4）。雜種與母本的差異基因表達(dá)數(shù)大于雜種與父本間的差異基因表達(dá)數(shù)。

表3 基于雙親表達(dá)量不一致的雜種基因表達(dá)模式分析

利用基因功能注釋（Gene ontology，GO）將DEGs進(jìn)行功能分類。我們將正交D6×D7和反交 D7×D6兩個(gè)雜交種的 DEGs分類到 36 個(gè)功能亞范疇（圖略），在生物途徑范疇中，氧化還原過程和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因調(diào)控所占比例最大；在分子功能范疇中，連接和催化過程所占比例最大；在細(xì)胞成分范疇中，細(xì)胞和細(xì)胞部分所占比例最大。

表4 4個(gè)基因型辣椒差異表達(dá)基因兩兩比較間的差異基因表達(dá)數(shù)

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析了正交D6×D7和反交 D7 ×D6兩個(gè)雜交種的 DEGs在生物途徑范疇中重要的GO類別，這些 GO 類別為分析正交和反交可能與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)的重要生物學(xué)途徑提供了線索。幾個(gè)重要的 GO 類別，如氧化還原、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊、真菌防御反應(yīng)、過氧化氫反應(yīng)和應(yīng)對(duì)冷熱反應(yīng)等在兩個(gè)雜交種都有富集現(xiàn)象，說明正交D6×D7和反交D7×D6兩個(gè)雜交種可能需要相同的生物學(xué)過程來維持葉片功能。然而，正反交兩個(gè)雜交種也存在明顯差異的 GO 類別，例如電子傳遞、光呼吸、調(diào)控植株過敏反應(yīng)和MAPK級(jí)聯(lián)途徑類別只在正交D6× D7雜交種富集。

3 結(jié)論與討論

盡管植物雜種優(yōu)勢(shì)在育種中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，對(duì)農(nóng)業(yè)有重要作用，但是人們對(duì)作物雜種優(yōu)勢(shì)的分子機(jī)理尚不清楚。辣椒雜種優(yōu)勢(shì)分子機(jī)理的探索已有約50年歷史，但從基因表達(dá)層面來分析辣椒雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理仍處于空白狀態(tài)。本研究應(yīng)用 RNA-Seq 技術(shù)分析了正反交辣椒的轉(zhuǎn)錄譜，共檢測(cè)到 0.44 億條高質(zhì)量的、100 bp大小的 reads。研究結(jié)果表明，反交組合D7×D6中共有17 096個(gè)基因表達(dá)，較正交組合少約120個(gè)基因；有1068個(gè)（6.20%）和780個(gè)（4.56%）單親表達(dá)一致型基因分別在正交和反交中被檢測(cè)到；有331個(gè)（1.92%）和211個(gè)（1.23%）雜種特異表達(dá)型基因分別在正交和反交中表達(dá)。已有研究表明，單親表達(dá)一致型與棉花所有產(chǎn)量性狀呈正相關(guān)［28］，雜種特異表達(dá)型與小麥雜種優(yōu)勢(shì)顯著正相關(guān)［27］。在4種存在與缺失變異類型中，雜種特異表達(dá)型和單親表達(dá)一致型屬于顯性模型，相關(guān)類基因所富集的代謝通路是雜種優(yōu)勢(shì)分子機(jī)理研究的重點(diǎn)。

對(duì)玉米［21］、苜蓿［29］、日本落葉松［30］研究表明，雜種中呈非加性表達(dá)模式的基因比例比較大。進(jìn)一步分析表明，在肯定非加性表達(dá)在雜種優(yōu)勢(shì)形成中起主要作用的例子中，有研究認(rèn)為超顯性表達(dá)模式是雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的原因［6，29］。本研究在非加性表達(dá)基因中，超顯性表達(dá)的基因占大多數(shù)，正、反交分別為66.08%和62.96%，而且在超顯性表達(dá)的基因中，正、反交雜種F1，正超顯性表達(dá)的基因個(gè)數(shù)約大于負(fù)超顯性。這與在擬南芥［23］、苜蓿［29］、水稻［18，31-32］和玉米［33-35］等植物中許多基因呈現(xiàn)這種表達(dá)模式結(jié)果相一致。

本研究中4個(gè)樣品基因的表達(dá)量為一個(gè)數(shù)量性狀，雜種與雙親相比，表達(dá)模式分為3大類7個(gè)小類，其中偏單親的顯性表達(dá)模式是主要的，暗示優(yōu)良的顯性基因在雜種中的聚合對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)也有貢獻(xiàn)，相似的結(jié)論在水稻［19］雜種優(yōu)勢(shì)研究中也已發(fā)現(xiàn)。本研究中，正、反交雜種與母本的差異基因表達(dá)數(shù)（344，342）大于雜種與父本間的差異基因表達(dá)數(shù)（197，236），這與母本對(duì)玉米雜種轉(zhuǎn)錄組的影響大于父本的結(jié)論相一致［20］。在雙親與雜種間差異表達(dá)的基因個(gè)數(shù)所占比例并不是很大，即只有一小部分基因的表達(dá)變化導(dǎo)致了雜種表型的變化［36］。對(duì)于理解雜種優(yōu)勢(shì)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，需要進(jìn)一步探討差異表達(dá)基因在雜種優(yōu)勢(shì)形成中的作用［37］。本研究利用基因功能注釋GO將差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，這些 GO 類別為分析正交和反交可能與雜種優(yōu)勢(shì)有關(guān)的重要生物學(xué)途徑提供了線索。幾個(gè)重要的 GO 類別富集在正反交雜種中，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控在水稻［31］，防御與逆境反應(yīng)在超級(jí)稻［37］雜種優(yōu)勢(shì)研究中相一致。然而，在正反交兩個(gè)雜交種也存在明顯差異的 GO 類別，例如電子傳遞、光呼吸、調(diào)控植株過敏反應(yīng)和MAPK級(jí)聯(lián)途徑類別只在正交D6×D7雜交種富集，這些GO 類別將是下一步研究的重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Differentially expressed gene profile of hot pepper seedling leaves between hybrid and its parental lines

XU Xiao-wan1，LI Ying1，WANG Heng-ming1，LI Tao1，HE Shui-lin2，GUAN De-yi2
（1.Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2.College of Crop Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

In spite of the great success in utilizing heterosis in hot pepper （Capsicum annuum L.） breeding and production，the underlying molecular mechanisms are still not well-understood，which need to be resolved as they are important subjects in basic biology and agronomy. In this study，mature leaf transcriptomes from the F1 hybrids（D6×D7 and D7×D6） and their parental lines （D6，D7） were compared. cDNA libraries were prepared using the sixth true leaves on plants at seedlings followed by RNA-Seq on a Illumina HiSeq 2000 sequencer. RNA-Seq generated 0.6 billion raw reads，and 0.44 billion high-quality reads （100bp） were obtained after the filtering process. Statistical analysis of genes with presence/ deletion variations showed that there are 1068 （6.20%） and 780 （4.56%）genes in the “single parent express consistent type” in the direct （D6×D7） and reciprocal （D7×D6） F1 hybrids，respectively. A large portion of the transcriotomes in the four pepper genotypes belong to this type of genes. Gene expression profiling analysis indicates that in F1 hybrids （direct and reciprocal crosses），more genes fit into the nonadditive expression type compared to the parents. Less than 8% of the genes belong to the the additive expression type. In the non-additive expression type，a large number of the genes fit into the epistatic dominance expression pattern；it is 66.08% and 62.96% in direct and reciprocal F1 hybrids，respectively. The expression type of these genes fits into the partial single parent dominance type.

hot pepper；heterosis；transcriptome；RNA-seq

S641.303.6

A

1004-874X（2016）11-0036-07

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金（31301776）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015B0202009，2016B070701010）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201510010119）

徐小萬（1975-），男，博士，副研究員，E-mail：xxw7505@163.com

李穎（1963-），女，研究員，E-mail：ly38469@163.com

徐小萬，李穎，王恒明，等. 辣椒雜交種與親本苗期葉片基因差異表達(dá)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（11）：36-42.