趙 旺，吳開暢，王江勇，凌 慧，楊 蕊，岑小勇，葉 樂(lè)

( 1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018；2. 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3. 三亞意源養(yǎng)殖有限公司，海南 三亞 572000； 4. 萬(wàn)寧市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，海南 萬(wàn)寧 571500 )

方斑東風(fēng)螺“翻背癥”的病原及初步治療研究

趙 旺1,2，吳開暢1,2，王江勇1,2，凌 慧1,2，楊 蕊3，岑小勇4，葉 樂(lè)1,2

( 1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018；2. 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3. 三亞意源養(yǎng)殖有限公司，海南 三亞 572000； 4. 萬(wàn)寧市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，海南 萬(wàn)寧 571500 )

對(duì)海南發(fā)生“翻背癥”的方斑東風(fēng)螺進(jìn)行了病原分離、鑒定，藥敏分析及藥物治療試驗(yàn)。結(jié)果顯示，病原為哈維弧菌，該菌對(duì)喹諾酮類、磺胺類藥物敏感，對(duì)青霉素、阿莫西林等耐藥；藥物治療結(jié)果顯示，試驗(yàn)組諾氟沙星、復(fù)方磺胺甲惡唑、苯扎溴銨及對(duì)照組的最終存活率分別為39.05%、32.38%、29.52%和14.29%，諾氟沙星的治療效果較好，可用于治療方斑東風(fēng)螺“翻背癥”。

方斑東風(fēng)螺；翻背癥；哈維弧菌；藥物治療

方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)屬腹足綱、腹足目、蛾螺科、東風(fēng)螺屬，在中國(guó)主要分布于福建、廣東、廣西和海南等地。東風(fēng)螺肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，是中國(guó)東南沿海重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖貝類。隨著東風(fēng)螺養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種爆發(fā)性病害頻發(fā)，已威脅到東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前已報(bào)道的主要病原有：有害寄生性動(dòng)物[1-3]、細(xì)菌[4-6]和其他病原[7-8]，其中細(xì)菌性病害最為常見。近年來(lái)海南多個(gè)東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)爆發(fā)的“翻背癥”(亦稱“急性死亡癥”)，該病癥狀與“腫吻癥”類似，發(fā)病時(shí)東風(fēng)螺活力很差，螺體仰翻于沙面上，不能鉆沙；腹足表面積累較多黑色雜質(zhì)，足肌邊緣收縮內(nèi)卷呈波紋狀，足部全伸或半伸出螺殼，用物刺激僅能部分縮回殼中；與腫吻癥明顯不同的是病螺吻管并無(wú)水腫、伸出等病癥；該病發(fā)病快，初期少量螺表現(xiàn)出該癥狀后2～3 d迅速爆發(fā)至全池甚至全養(yǎng)殖場(chǎng)，且其死亡率可達(dá)80%以上。目前，東風(fēng)螺細(xì)菌性病害治療，多為病原對(duì)藥物的敏感性分析[9-10]，進(jìn)一步治療效果的報(bào)道較少。筆者對(duì)方斑東風(fēng)螺“翻背癥”的病原進(jìn)行了分離與鑒定，針對(duì)生產(chǎn)上養(yǎng)殖戶習(xí)慣使用化學(xué)消毒劑和抗生素甚至是水產(chǎn)禁用藥物治療東風(fēng)螺疾病的現(xiàn)象，探索了幾種水產(chǎn)常用藥物的治療效果，以期為東風(fēng)螺“翻背癥”的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用螺：患病方斑東風(fēng)螺采于海南省萬(wàn)寧某東風(fēng)螺養(yǎng)殖場(chǎng)，為發(fā)生“翻背癥”初期的稚螺，單粒體質(zhì)量(1.35±0.49) g。感染用螺取自海南省三亞市某東風(fēng)螺養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)期間狀態(tài)良好，單粒體質(zhì)量(1.31±0.45) g。

主要試驗(yàn)藥物與試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，藥敏分析紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)，Bacterial DNA kit(Omega公司)，PCR反應(yīng)套裝(Takara公司)；根據(jù)病原藥敏分析結(jié)果及養(yǎng)殖戶用藥習(xí)慣選取的治療藥物：復(fù)方磺胺甲惡唑(廣東臺(tái)城制藥股份有限公司)、呋喃西林(南昌白云藥業(yè)有限公司)、苯扎溴銨(廣州精博生物技術(shù)有限公司)和諾氟沙星(廣州精博生物技術(shù)有限公司)。

試驗(yàn)用暫養(yǎng)容器為聚乙烯框(68 cm×42 cm×18 cm)，框底鋪厚3 cm、粒徑1～3 mm的消毒河沙，試驗(yàn)用沙濾海水。

1.2 優(yōu)勢(shì)菌的分離培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，取發(fā)病初期癥狀典型病螺的足肌、鰓、外套膜、內(nèi)臟等組織勻漿，無(wú)菌生理鹽水稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，分離純化形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落，供人工感染與鑒定。

1.3 人工感染

將純培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水洗脫菌苔制成菌懸液，平板培養(yǎng)法測(cè)定活菌密度；將菌液10倍梯度連續(xù)稀釋后，對(duì)健康東風(fēng)螺進(jìn)行肌肉注射，每個(gè)菌液梯度注射2組，每組10粒，每粒菌液劑量0.1 mL，另設(shè)對(duì)照組注射無(wú)菌生理鹽水。人工感染后記錄螺死亡情況，連續(xù)記錄7 d。采用 Karber 法計(jì)算菌株的半數(shù)致死劑量(LD50)[11]。整個(gè)試驗(yàn)期間，水溫(28±1) ℃，鹽度30±1，pH 8.0±0.2，溶解氧>6 mg/L。

1.4 病原菌的16 S rDNA鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌的總DNA，以總DNA 為模板，用細(xì)菌通用引物對(duì)8F/1492R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由Invitrogen公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中已報(bào)道的序列進(jìn)行相似性比較，確定該病原菌的種屬。

1.5 藥敏分析

采用藥敏紙片法進(jìn)行，將不同藥物的藥敏紙片貼于涂滿病原菌的平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑，并根據(jù)藥敏紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏性。

1.6 藥物治療試驗(yàn)

取“翻背癥”初期具明顯癥狀的東風(fēng)螺1批隨機(jī)分配到試驗(yàn)框中，每框放置35 粒。每種藥物設(shè)3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行，每日藥浴約18 h，流水6 h，不投餌料。試驗(yàn)組復(fù)方磺胺甲惡唑質(zhì)量濃度分別為2、4 mg/L和6 mg/L；苯扎溴銨質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L；諾氟沙星質(zhì)量濃度分別為1、2 mg/L和3 mg/L；呋喃西林質(zhì)量濃度分別為3、6 mg/L和9 mg/L；另設(shè)對(duì)照。每日檢查并記錄死亡情況，刺激無(wú)反應(yīng)即判斷為死亡。

根據(jù)每日各試驗(yàn)組的死亡情況計(jì)算每日存活率：

存活率/%=(試驗(yàn)螺總數(shù)-死亡螺總數(shù))/試驗(yàn)螺總數(shù)×100%

用SPSS 19.0對(duì)各試驗(yàn)組的最終存活率進(jìn)行分析，用F檢驗(yàn)差異顯著性，LSD法進(jìn)行多重比較。整個(gè)試驗(yàn)期間海水溶解氧7～8 mg/L，水溫27～28.5 ℃，pH 8.0±0.1，鹽度28～33，試驗(yàn)周期17 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 翻背癥病螺癥狀

正常螺晝伏夜出，白天很少在沙面上活動(dòng)；螺體背腹面顛倒后能通過(guò)足肌旋轉(zhuǎn)迅速翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)(圖1a)?！胺嘲Y”病螺活力很差，體表黏液減少；背腹面顛倒，殼口朝上，不能自行翻轉(zhuǎn)；足肌伸縮無(wú)力，對(duì)刺激不敏感；足部邊緣收縮呈波紋狀，部分病螺腹足因表面積累異物呈黑色(圖1b)。人工感染后，健康螺表現(xiàn)出與“翻背癥”相同癥狀(圖1c)。

圖1 方斑東風(fēng)螺a.正常螺；b. “翻背癥”螺；c. 人工感染螺.

2.2 優(yōu)勢(shì)菌的分離

將“翻背癥”方斑東風(fēng)螺組織勻漿液稀釋涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，分別分離到3株優(yōu)勢(shì)菌F1、F2和F3，其中F1含量占平板總細(xì)菌量的85%，F(xiàn)2為80%，F(xiàn)3超過(guò)80%；這3株菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上表現(xiàn)出相同的特點(diǎn)：淡黃色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑2～3 mm，在腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰白色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑1.5～3 mm，在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖培養(yǎng)平板上呈現(xiàn)黃色、圓形、不透明、邊緣光滑、濕潤(rùn)、直徑1.5～3 mm。

2.3 優(yōu)勢(shì)菌的人工感染結(jié)果

優(yōu)勢(shì)菌F1、F2和F3分別人工感染后，東風(fēng)螺均出現(xiàn)與“翻背癥”相同的癥狀(圖1c)，累計(jì)死亡結(jié)果見表1，半數(shù)致死劑量分別為：7.01×106cfu/g、6.13×106cfu/g、7.43×106cfu/g。

表1 東風(fēng)螺“翻背癥”優(yōu)勢(shì)菌的人工感染結(jié)果

2.4 病原菌的16 S rDNA鑒定

菌株F1、F2、F3及人工感染后分離的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rDNA獲得大小約1500 bp的片段，產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì)后顯示，3株優(yōu)勢(shì)菌及人工感染后分離的優(yōu)勢(shì)菌株與哈維弧菌(Vibrioharveyi)相似度高于99%，可確定病原菌為哈維弧菌。

2.5 病原菌的藥敏分析

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，病原菌對(duì)土霉素、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、四環(huán)素等敏感，對(duì)卡那霉素、利福平、新霉素、慶大霉素等中度敏感，對(duì)頭孢氨芐、阿莫西林、青霉素等表現(xiàn)為耐藥。

2.6 患“翻背癥”方斑東風(fēng)螺藥浴的每日存活率

各試驗(yàn)組每日存活率曲線呈現(xiàn)先急劇下降后逐漸平緩的變化趨勢(shì)(圖2)。由圖2可見，前3 d，藥物治療組和對(duì)照組存活率下降都很快，說(shuō)明發(fā)生“翻背癥”的東風(fēng)螺死亡率高且死亡迅速；藥物治療組3 d后的存活率不到60%，而未采取任何藥物治療措施的對(duì)照組存活率約30%，可見若未及時(shí)采取治療措施，損失將十分巨大。

另外，對(duì)照組與大部分藥物治療組在第1 d存活率就存在較大差別，大部分藥物治療組第1 d存活率約70%，而對(duì)照組存活率僅為55.2%，說(shuō)明這些藥物有一定的治療效果，并且用藥越早越好。

2.7 患“翻背癥”方斑東風(fēng)螺藥物治療的最終存活率

從試驗(yàn)各組的最終存活率結(jié)果可知，對(duì)照組東風(fēng)螺的平均存活率不到20%；呋喃西林和諾氟沙星治療的存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且不同藥物質(zhì)量濃度的治療效果存在差異，其中以2 mg/L諾氟沙星和3 mg/L呋喃西林效果最佳，平均存活率約40%，兩者治療的最終存活率無(wú)明顯差異(P>0.05)；而復(fù)方磺胺甲惡唑片和苯扎溴銨效果稍差，平均存活率低于35%(圖3)。

圖2 藥浴試驗(yàn)各組的每日存活率變化

圖3 藥浴試驗(yàn)各組最終存活率

3 討 論

3.1 東風(fēng)螺細(xì)菌性病害的病原分析

“翻背癥”與“腫吻癥”是東風(fēng)螺工廠化養(yǎng)殖過(guò)程中常見的細(xì)菌性病害。目前已報(bào)道“腫吻癥”的病原有鰻弧菌生物變種Ⅰ(V.anguillarumBiovar Ⅰ)[6]和哈維弧菌[5,13-14]，同時(shí)該病的發(fā)生、發(fā)展與水體環(huán)境中異養(yǎng)菌的數(shù)量及體內(nèi)條件致病菌的感染程度密切相關(guān)[15]；研究發(fā)現(xiàn)，本次海南萬(wàn)寧地區(qū)東風(fēng)螺“翻背癥”的病原也為哈維弧菌，癥狀與“腫吻癥”存在明顯差異“翻背癥”病螺不出現(xiàn)吻管外伸、腫大、局部發(fā)紅等現(xiàn)象。相同宿主感染哈維弧菌卻表現(xiàn)出不同的癥狀，這可能與宿主生活的環(huán)境、生理狀態(tài)及病原的感染途徑等有關(guān)。

3.2 東風(fēng)螺“翻背癥”的藥物治療效果分析

對(duì)東風(fēng)螺“翻背癥”病原哈維弧菌的藥敏分析顯示，該病菌對(duì)磺胺類、喹諾酮類藥物等藥物敏感，這與曾德乾等[16]調(diào)查海南、廣東等地哈維弧菌的抗生素敏感性一致，因此考慮用這些病原菌敏感的藥物進(jìn)行治療試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，諾氟沙星與呋喃西林治療的效果最佳，呋喃西林作為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁藥不能用于治療，而諾氟沙星是一種抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)代謝快、休藥期短、藥效穩(wěn)定的喹諾酮類抗菌藥物，可用于治療多種常見淡水魚疾病如細(xì)菌性敗血病、腸炎病、爛鰓病、豎鱗病、白頭白嘴病、打印病、赤皮病等[17-18]，這些都提示在生產(chǎn)上發(fā)生由哈維弧菌引起的東風(fēng)螺“翻背癥”時(shí)可以使用諾氟沙星替代呋喃西林來(lái)治療。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，方斑東風(fēng)螺稚螺對(duì)苯扎溴銨較為敏感，藥物安全質(zhì)量濃度為0.58 mg/L，僅高于生產(chǎn)廠家推薦用量(0.1 mg/L)數(shù)倍[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.1、0.2 mg/L和0.3 mg/L苯扎溴銨的治療存活率分別為29.52%、23.81%和17.14%，即隨著藥物質(zhì)量濃度的升高存活率反而降低，這說(shuō)明與正常東風(fēng)螺相比，發(fā)生“翻背癥”的東風(fēng)螺對(duì)苯扎溴銨更敏感。因此，東風(fēng)螺養(yǎng)殖中尤其是病害發(fā)生時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎使用苯扎溴銨。

3.3 東風(fēng)螺“翻背癥”的防治措施

“翻背癥”爆發(fā)快、傳染性強(qiáng)、死亡率高，給東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)沉重的打擊。針對(duì)其主要病原哈維弧菌的藥敏試驗(yàn)顯示，該病原對(duì)磺胺類和喹諾酮類藥物敏感，治療結(jié)果表明，“翻背癥”發(fā)生后3 d內(nèi)東風(fēng)螺死亡率最高，治療效果最佳為呋喃西林和諾氟沙星，發(fā)病群體存活率約40%。因此，發(fā)生“翻背癥”時(shí)可以使用諾氟沙星來(lái)治療。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)這幾種藥物治療“翻背癥”的效果比較有限，推測(cè)其原因可能是：藥物較難透過(guò)螺殼作用于軟體部分；東風(fēng)螺長(zhǎng)時(shí)間在沙層中生活，藥物難以透過(guò)沙層而殺滅環(huán)境中的病原菌；病原菌給東風(fēng)螺軟體造成難以恢復(fù)的損傷，導(dǎo)致其死亡。另外，高質(zhì)量濃度的苯扎溴銨治療效果比低質(zhì)量濃度的差，這說(shuō)明病害發(fā)生時(shí)，濫用藥物是造成東風(fēng)螺死亡嚴(yán)重的重要原因。因此，東風(fēng)螺病害的防治重點(diǎn)還在于預(yù)防。在養(yǎng)殖過(guò)程中可采取各種措施改善養(yǎng)殖條件，提高東風(fēng)螺自身抵抗力水平；及時(shí)清理養(yǎng)殖底沙中的殘餌殘?jiān)?，定期消毒養(yǎng)殖底沙，破壞細(xì)菌滋生的溫床；養(yǎng)殖用品消毒，防止交叉感染；與其他養(yǎng)殖動(dòng)植物混養(yǎng)、施加益生菌等，營(yíng)造一個(gè)相對(duì)復(fù)雜而穩(wěn)定的養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)，是預(yù)防東風(fēng)螺“翻背癥”的重要途徑。

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PathogenandTreatmentof“ReverseBackSyndrome”ofWhelkBabyloniaareolata

ZHAO Wang1,2, WU Kaichang1,2, WANG Jiangyong1,2, LING Hui1,2, YANG Rui3, CEN Xiaoyong4, YE Le1,2

( 1. Tropical Fisheries Research and Development Center, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Sanya 572018, China; 2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resource Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510300, China; 3. Sanya Yiyuan Aquatic Products Corporation Limited, Sanya 572000, China; 4. Wanning Fishery Technical Extension Station, Wanning 571500,China )

The pathogens of “reverse back syndrome” of whelkBabyloniaareolatain Hainan were isolated and identificated, and drug sensitivity and treatment were tested. The results showed that the pathogen isVibrioharveyi, which is sensitive to quinolones and sulfonamides, and resistant to penicillin and amoxicillin. Drug treatment test indicated that the final survival rates of the whelk treated by norfloxacin, compound sulfamethoxazole, benzalkonium and bromide and of the animals in the control group were 39.05%, 32.38%, 29.52% and 14.29%,respectively. The efficacy of norfloxacin is better, and it can be used to treat “reverse back syndrome” in the whelk.

Babyloniaareolata; reverse back syndrome;Vibrioharveyi; drug treatment

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.05.016

S968.319

A

1003-1111(2016)05-0552-05

2015-07-07；

2016-03-14.

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2014TS13,2015YD04)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CARS-48)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(314180)；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)(ZDXM2015058)；三亞市院地科合作項(xiàng)目(2013YD79)；三亞市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015KJ05).

趙旺(1987—)，男，實(shí)習(xí)研究員；研究方向：貝類病害防控.E-mail: zhaowang522@163.com.通訊作者：葉樂(lè)(1974—)，男，副研究員；研究方向：貝類養(yǎng)殖及病害防控技術(shù). E-mail: yele2008@163.com.