任 洪 濤

( 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003 )

不同質(zhì)量濃度Zn2+對(duì)草魚腦、肝胰臟組織結(jié)構(gòu)及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響

任 洪 濤

( 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003 )

水溫(20±1) ℃，采用靜水測(cè)試法研究了養(yǎng)殖水體中不同質(zhì)量濃度Zn2+(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)對(duì)體質(zhì)量約10 g的草魚腦和肝胰臟的組織結(jié)構(gòu)及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，探討重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+對(duì)草魚的24、48 h和96 h半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317、10.155 mg/L，由公式(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和96 h LC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。中毒初期草魚腦細(xì)胞輕微聚集，細(xì)胞核微增大；隨時(shí)間延長(zhǎng)腦異常加重，細(xì)胞聚集明顯，核增大幾乎充滿整個(gè)腦細(xì)胞；肝胰臟細(xì)胞膨大，離散，核縮小，胞漿輕微溢出，少數(shù)肝胰臟細(xì)胞胞漿溢出，殘留的核物質(zhì)散亂分布，肝胰臟細(xì)胞凝固性壞死。隨著Zn2+質(zhì)量濃度的升高和時(shí)間延長(zhǎng)，草魚肝臟中超氧化物歧化酶活性降低。

草魚；Zn2+；質(zhì)量濃度；組織器官；超氧化物歧化酶

鋅是動(dòng)物必需的礦物微量元素，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，大量添加到人工配合飼料中用于集約化養(yǎng)殖生產(chǎn)，常造成鋅過(guò)剩，通過(guò)排泄物釋放到土壤和水體中，危害水生動(dòng)物的健康。Zn2+是鋅對(duì)水生生物致毒的主要離子形式，多余的Zn2+能夠與生物體內(nèi)的酶和核酸等生物大分子結(jié)合，使水生動(dòng)物中毒。其毒性大小與環(huán)境的理化因素、受試生物的種類、規(guī)格、生長(zhǎng)條件等多種因素有關(guān)[1]。草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為我國(guó)淡水養(yǎng)殖四大家魚之一，也是主要的池塘養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖范圍與面積非常廣，草魚在全國(guó)各地的河流、湖泊、水庫(kù)中皆有分布。每年的草魚總產(chǎn)量居于所有水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的前列，草魚肉質(zhì)細(xì)嫩、個(gè)體大、肌間刺少；含有豐富的不飽和脂防酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高；另外草魚的消化力強(qiáng)，生長(zhǎng)快，適應(yīng)能力強(qiáng)，具有極高的經(jīng)濟(jì)和研究?jī)r(jià)值。目前有關(guān)草魚的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、轉(zhuǎn)基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，而對(duì)于養(yǎng)殖水環(huán)境重金屬污染對(duì)草魚毒性效應(yīng)方面的研究較少。

養(yǎng)殖水環(huán)境中的Zn2+的毒性主要取決于Zn2+在生物體內(nèi)的吸收和積累，所以，研究在一定含量和時(shí)間下，Zn2+在草魚組織中吸收、積累的影響，有利于揭示重金屬離子的吸收、積累機(jī)制。因此本試驗(yàn)主要研究了養(yǎng)殖水體中不同質(zhì)量濃度鋅對(duì)草魚腦和肝胰臟組織學(xué)及肝胰臟中超氧化物歧化酶活性的影響，以期為研究重金屬的毒性積累和毒性機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用草魚購(gòu)自洛陽(yáng)市水產(chǎn)市場(chǎng)，暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間24 h連續(xù)充氣，每日投喂市售商品s飼料1～2次，并及時(shí)清理殘餌及糞便等雜物。正式試驗(yàn)前停食1 d，選取體長(zhǎng)8.0～10.0 cm、體質(zhì)量約10 g、體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。

試驗(yàn)在6 L水桶中進(jìn)行。Zn2+由硫酸鋅(ZnSO4·7H2O，分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠生產(chǎn))配制。

1.2 方法

試驗(yàn)用水為曝氣24 h的自來(lái)水，水溫(20±1) ℃，pH 7.0±0.5。試驗(yàn)期間連續(xù)充氣。每一試驗(yàn)桶中加入1 L的藥液， 10尾草魚，不投喂也不充氧。死亡標(biāo)準(zhǔn)為腹部朝上、失去游動(dòng)能力、針刺無(wú)反應(yīng)，死亡個(gè)體及時(shí)撈出。

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)

配制1000 mg/L的硫酸鋅母液，以十倍之差估計(jì)系列質(zhì)量濃度0.5、5、50、500、5000 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度組放入5尾草魚，用靜態(tài)方式進(jìn)行，試驗(yàn)持續(xù)24 h，每日至少2次記錄各容器內(nèi)死魚數(shù)，及時(shí)取出死魚。試驗(yàn)進(jìn)行2～3次，找出Zn2+的100%致死質(zhì)量濃度與最小致死質(zhì)量濃度，記錄重金屬離子染毒時(shí)，草魚的反應(yīng)。

1.2.2 正式試驗(yàn)

(1)采用靜水生物測(cè)試法[2]，試驗(yàn)周期為96 h，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，按等比級(jí)數(shù)設(shè)5個(gè)質(zhì)量濃度組(0、9.52、13.14、18.30、25.02、34.53 mg/L)。每個(gè)質(zhì)量濃度組設(shè)3個(gè)平行組，每一個(gè)系列設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每組用10尾魚，所有魚在10 min內(nèi)轉(zhuǎn)移完畢。連續(xù)觀察草魚對(duì)Zn2+的行為反應(yīng)和中毒癥狀，分別于24、48、96 h記錄不同質(zhì)量濃度下死亡的草魚尾數(shù)，統(tǒng)計(jì)各Zn2+質(zhì)量濃度下不同時(shí)間內(nèi)草魚的死亡率。

(2)根據(jù)各質(zhì)量濃度狀態(tài)下不同時(shí)間(24、48、96 h)的死亡率，采用直線回歸法，求出各種毒物的半致死質(zhì)量濃度LC50。再根據(jù)公式SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)和公式SCⅡ=96 h LC50×0.1求出毒物的安全質(zhì)量濃度[3]。

(3)取出死亡草魚肝胰臟和腦組織，一部分放入10%甲醛溶液中固定，用來(lái)制作組織切片；另一部分裝入1.5 mL EP管中，做標(biāo)記，置于冰箱中-20 ℃保存。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)的方法測(cè)定肝胰臟中超氧化物歧化酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理；運(yùn)用SPSS軟件中的單因素方差分析檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚Zn2+中毒的行為癥狀

高質(zhì)量濃度Zn2+組中的草魚短時(shí)間內(nèi)就出現(xiàn)明顯中毒癥狀：局促不安、快速游動(dòng)、亂竄，持續(xù)數(shù)小時(shí)后游泳速度逐漸減緩，反應(yīng)遲鈍，身體失去平衡，與水面成45°角，頭露出水面游動(dòng)，偶爾躍出水面；隨后，呼吸困難，失去游泳能力，在水中側(cè)翻、旋轉(zhuǎn)，腹部側(cè)斜并朝向水面，最后側(cè)臥底部不動(dòng)，僅見(jiàn)鰓蓋微動(dòng)直至死亡。低質(zhì)量濃度組草魚中毒癥狀出現(xiàn)的比高質(zhì)量濃度組晚，在試驗(yàn)剛開(kāi)始的數(shù)小時(shí)內(nèi)，魚的行為特征與對(duì)照組差異不大，在容器底部緩慢自如地游動(dòng)，隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸失去活力，胸鰭和腹鰭基部充血，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍。臨死前的癥狀與高質(zhì)量濃度組相似。

2.2 Zn2+對(duì)草魚的急性毒性

草魚在不同質(zhì)量濃度、不同暴露時(shí)間的死亡率見(jiàn)表1。

由表1可知，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚的平均死亡率之間呈現(xiàn)明顯的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系：相同的時(shí)間內(nèi)，草魚的死亡率隨著Zn2+質(zhì)量濃度升高而增加；相同質(zhì)量濃度下，草魚的平均死亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

不同暴露時(shí)間下，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚死亡概率的線性回歸方程及相應(yīng)時(shí)間下的半致死質(zhì)量濃度、安全質(zhì)量濃度的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 草魚在不同質(zhì)量濃度Zn2+和暴露時(shí)間的死亡率

表2 Zn2+對(duì)草魚的急性毒性試驗(yàn)線性回歸方程、半致死質(zhì)量濃度及安全質(zhì)量濃度

注：y：死亡概率；x：質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)；n：試驗(yàn)魚個(gè)體數(shù)；r：相關(guān)系數(shù)；LC50：半致死質(zhì)量濃度；SC：安全質(zhì)量濃度.

由表2可知，Zn2+對(duì)草魚的24、48、96 h 半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317、10.155 mg/L；由SCⅠ=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2和SCⅡ=96 h LC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚對(duì)Zn2+的敏感性逐漸增強(qiáng)，半致死質(zhì)量濃度值越小毒性越強(qiáng)，即24 h半致死質(zhì)量濃度>48 h半致死質(zhì)量濃度> 96 h半致死質(zhì)量濃度。

2.3 Zn2+對(duì)草魚腦和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，Zn2+處理的草魚腦細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖1)。

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組草魚腦細(xì)胞完整，可以清晰地分辨出細(xì)胞輪廓，無(wú)異常；Zn2+處理24 h時(shí)，腦組織輕微異常，腦細(xì)胞輕微聚集，細(xì)胞核輕微增大；Zn2+處理96 h時(shí)，腦組織異常嚴(yán)重，腦細(xì)胞聚集明顯，細(xì)胞核明顯增大，幾乎充滿整個(gè)腦細(xì)胞。Zn2+誘導(dǎo)自由基介導(dǎo)過(guò)程發(fā)生改變，脂質(zhì)過(guò)氧化，生物膜被破壞和細(xì)胞功能障礙，以上組織病變程度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加深。

Zn2+處理的草魚肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異常(圖2)。由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組草魚肝胰臟細(xì)胞完整，可以清晰地分辨細(xì)胞輪廓，無(wú)異常；Zn2+處理24 h時(shí)，肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)多不完整，輕微異常，細(xì)胞輕微膨大，呈離散狀態(tài)，細(xì)胞核相對(duì)縮小，胞漿輕微溢出；Zn2+處理96 h時(shí)，肝胰臟細(xì)胞明顯膨大，無(wú)序散程度增大，細(xì)胞核明顯相對(duì)縮小，少數(shù)肝細(xì)胞胞漿完全溢出，殘留的核物質(zhì)散亂分布，肝細(xì)胞出現(xiàn)凝固性壞死，正常壁狀結(jié)構(gòu)消失。

圖1 Zn2+對(duì)草魚腦組織結(jié)構(gòu)的影響A1：空白對(duì)照；A2：Zn2+處理24 h；A3：Zn2+處理96 h，×40.

2.4 Zn2+對(duì)草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性的影響

與對(duì)照組相比，24 h時(shí)，Zn2+質(zhì)量濃度13.14 mg/L處理組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性下降不顯著(P>0.05)，到96 h時(shí)，下降顯著(P<0.05)；34.53 mg/L時(shí)，24 h和96 h時(shí)，草魚肝臟超氧化物歧化酶活性下降顯著(P<0.05)。同一質(zhì)量濃度下，不同時(shí)間相比： 24 h和96 h時(shí)13.14 mg/L組草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)； 34.53 mg/L時(shí)，24 h和96 h時(shí),草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異不顯著(P>0.05)。同一時(shí)間，不同質(zhì)量濃度條件相比：24 h時(shí)，13.14 mg/L和34.53 mg/L組草魚肝臟超氧化物歧化酶活性差異顯著(P<0.05)；96 h，差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3 Zn2+作用下草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的活性注：圖中標(biāo)注星號(hào)(*)表示相同時(shí)間不同質(zhì)量濃度之間的差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 急性毒性試驗(yàn)

本試驗(yàn)中，Zn2+質(zhì)量濃度與草魚的平均死亡率之間呈明顯的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系：相同的時(shí)間內(nèi)，草魚的死亡率隨Zn2+質(zhì)量濃度升高而增加；相同質(zhì)量濃度下，草魚的平均死亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。Zn2+對(duì)草魚的24、48 h和96 h 半致死質(zhì)量濃度分別為23.058、19.317 mg/L和10.155 mg/L，安全質(zhì)量濃度分別為4.068 mg/L和1.0155 mg/L。Zn2+對(duì)草魚魚種的毒性隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚對(duì)Zn2+的敏感性逐漸增強(qiáng)，半致死質(zhì)量濃度值越小毒性越強(qiáng)，即24 h半致死質(zhì)量濃度>48 h半致死質(zhì)量濃度>96 h半致死質(zhì)量濃度。此結(jié)果與侯麗萍等[4]的研究結(jié)果和張彩明等[5]對(duì)日本黃姑魚(Nibeaalbiflora)和脊尾白蝦(Exopalamoncarincauda)的研究的結(jié)果一致。但是，本試驗(yàn)得出96 h半致死質(zhì)量濃度為10.155 mg/L，這與侯麗萍等[4]研究的Zn2+對(duì)草魚96 h半致死質(zhì)量濃度為5.73 mg/L有差異，且與Zn2+對(duì)脊尾白蝦[5]96 h半致死質(zhì)量濃度為0.33 mg/L差異也很大，說(shuō)明不同物種對(duì)Zn2+的耐受能力不同。

3.2 Zn2+對(duì)草魚腦和肝胰臟組織結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著Zn2+暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚腦和肝胰臟組織的形態(tài)變化和損壞程度加深：腦細(xì)胞輕微聚集，細(xì)胞核微增大，幾乎充滿整個(gè)腦細(xì)胞。肝胰臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)多不完整，細(xì)胞輕微膨大，離散，細(xì)胞核相對(duì)縮小，胞漿輕微溢出，凝固性壞死。此結(jié)果與王少博等[6]對(duì)草魚研究的結(jié)果一致。

3.3 Zn2+對(duì)超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶作為保護(hù)酶系統(tǒng), 能維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，防止自由基的毒害。而逆境條件下，細(xì)胞中活性氧往往增多或清除能力減弱，在這種情況下，活性氧清除能力的高低也就成為生物抗逆境能力的大小和能否在逆境中生存的關(guān)鍵。本試驗(yàn)結(jié)果表明，把草魚放在含有不同質(zhì)量濃度Zn2+的養(yǎng)殖水體中后，該平衡被打破，體現(xiàn)于超氧化物歧化酶活性隨Zn2+質(zhì)量濃度的提高而下降。

本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，24 h時(shí)，低質(zhì)量濃度組超氧化物歧化酶活性下降不顯著，96 h時(shí)，超氧化物歧化酶活性下降顯著；高質(zhì)量濃度組在24 h和96 h時(shí)，超氧化物歧化酶活性下降均顯著。低質(zhì)量濃度組在24～96 h之間，超氧化物歧化酶活性下降依然很顯著，但高質(zhì)量濃度組在24～96 h，超氧化物歧化酶活性下降不顯著。在急性染毒的24 h和48 h期間，較低質(zhì)量濃度的鎘鋅溶液會(huì)導(dǎo)致短暫的“毒性興奮效應(yīng)”，保護(hù)機(jī)體免受抗氧化損傷。王重剛等[7-8]研究表明，不利因素對(duì)魚肝臟超氧化物歧化酶誘導(dǎo)作用，本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)論相一致。此結(jié)果與張迎梅等[9]對(duì)泥鰍的研究結(jié)果一致。他們認(rèn)為，Zn2+能抑制泥鰍的超氧化物歧化酶活性，使超氧化物歧化酶活性降低。由于草魚肝胰臟組織超氧化物歧化酶活性的降低程度與水體Zn2+污染水平有一定的關(guān)系，這一現(xiàn)象可否用Zn2+作為檢測(cè)水體污染的一種生物學(xué)指標(biāo)，還有待進(jìn)一步深入研究。

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EffectsofDifferentConcentrationsofZincIononHistologicalStructureofBrainandHepatopancreasandHepatopancreaticSODActivityinGrassCarpCtenopharyngodonidellus

REN Hongtao

( Animal Science and Technology College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003，China )

The influences of different concentrations of zinc ion (Zn2+) (0, 9.52, 13.14, 18.30, 25.02, and 34.53 mg/L) on histological structure of brain and hepatopancreas and superoxide dismutase(SOD) activity in hepatopancreas were studied in grass carpCtenopharyngodonidelluswith body weight of some 10 g at water temperature of(20±1) ℃ by a hydrostatic test to seek for the accumulation and toxicity mechanism of heavy metals. It was found that the LC50of Zn2+to grass carp was 23.058 mg/L in 24 h, 10.155 mg/L in 48 h, and 19.317 mg/L in 96 h, with safe concentration of 4.068 mg/L calculated by formula(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2and 1.0155 mg/L estimated by formula 96 h LC50×0.1. In the early stage of Zn2+poisoning, the grass carp exposed to Zn2+had clustered brain cells with the slightly enlarged nuclei, and as the time elapsed, the brain cells aggregated significantly, and the whole brain cells were almost filled with the nuclei. The hepatopancreas cells were found to be expansion, discrete, nuclear reduction, a slight overflow of the cytoplasm, a small number of liver cell cytoplasm overflow, and residual nuclear material scattered distribution in the grass carp exposed to Zn2+, thus leading to cell necrosis. With the increase in Zn2+concentration and time, the activity of SOD in the hepatopanceas of grass carp was decreased.

Ctenopharyngodonidellus; Zn2+; mass concentration; tissue and organ; SOD

S965.112

A

1003-1111(2016)04-0415-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.018

2015-09-26；

2015-11-24.

河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(09001760)；河南科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2014QN059)；河南科技大學(xué)教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2013Y—003).

任洪濤(1977-)，男，講師，博士；研究方向:水產(chǎn)動(dòng)物分子生物學(xué).E-mail:hthn2012@163.com.