王 鶴，王田田，胡麗萍，趙 強，孫國華，孫靈毅

( 1.煙臺市水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264003； 2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006 )

仿刺參中國群體與韓國群體雜交子代微衛(wèi)星標記分析

王 鶴1，王田田1，胡麗萍1，趙 強1，孫國華2，孫靈毅1

( 1.煙臺市水產(chǎn)研究所，山東 煙臺 264003； 2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺 264006 )

應用微衛(wèi)星DNA技術(shù)對仿刺參中國群體、韓國群體及其雜交后代的遺傳多樣性進行了研究。15對微衛(wèi)星引物共擴增獲得60個等位基因，平均等位基因數(shù)為4，平均有效等位基因數(shù)為2.5855。3個群體的平均觀測雜合度分別為0.2965、0.3548、0.2755，平均期望雜合度為0.5296、0.5574、0.5364，多態(tài)性信息含量為0.0000～0.8480，平均值為0.4653、0.4860和0.4630。Hardy-Weinberg平衡的P值檢驗，發(fā)現(xiàn)3個群體普遍存在偏離平衡的現(xiàn)象。試驗結(jié)果表明，15個位點中，14個位點為中度或高度多態(tài)，3個群體多樣性處于中等偏上水平；韓國群體的遺傳多樣性水平在3個群體中最高，雜交后代并未表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢，但在某些微衛(wèi)星位點觀測到的等位基因頻率和基因型頻率表現(xiàn)出與親本的差異，說明雜交過程使后代獲得了一定程度的遺傳分化，中國群體與韓國群體的雜交后代具一定的選育潛力。

仿刺參；遺傳多樣性；雜交；微衛(wèi)星

仿刺參(Apotichopusjaponicus)自然分布于我國、韓國、日本及俄羅斯遠東地區(qū)的部分海域，具有較高的營養(yǎng)保健和藥用價值，是我國重要的海洋經(jīng)濟動物之一[1-2]。但近年來由于北方地區(qū)夏季高溫導致海參大量死亡，造成了嚴重的經(jīng)濟損失，制約了整個行業(yè)的健康發(fā)展。以2013年為例，山東地區(qū)受夏季高溫影響，池塘養(yǎng)殖、底播增殖海參大量死亡，產(chǎn)量驟減，經(jīng)濟損失嚴重，據(jù)不完全統(tǒng)計，僅煙臺市受災面積約達4.33×103hm2，直接經(jīng)濟損失約11億元。如何讓海參健康度夏，成為近年來北方地區(qū)制約海參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

雜交是水產(chǎn)動物育種的有效途徑之一，不僅能夠豐富遺傳結(jié)構(gòu)，使不同類型的親本優(yōu)良性狀得以結(jié)合，還能獲得具有雜種優(yōu)勢的新品種，故其在水產(chǎn)動物品種改良、預防種質(zhì)退化等方面發(fā)揮了巨大作用[3]。優(yōu)良性狀的雜交優(yōu)勢在鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚(Carassiusauratus)、羅非魚(Oreochromis)等魚類[4-6]；中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、三疣梭子蟹(Portunstrituberculatus)等甲殼類[7-9]；海灣扇貝(Argopectensirradias)、皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等貝類[10-13]中均有較為廣泛的應用。胡美燕等[14]報道了仿刺參日本群體(原文章中的日本紅刺參)與中國群體正交、反交及自交后代在幼蟲期和稚參期的生長性狀，指出中國群體♂與日本群體♀雜交組合更具生長優(yōu)勢，雜種優(yōu)勢率較為明顯。孫秀俊等[15]在此基礎(chǔ)上通過對上述雜交優(yōu)勢組合雜交子代胚胎發(fā)育的觀察，對比幼參培育期間雜交稚參與自交稚參的生長與成活情況，得出在高溫條件下雜交苗種較自交苗種具明顯生長優(yōu)勢的結(jié)論。

微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高、共顯性、遵循孟德爾遺傳規(guī)律等特點，是當前水產(chǎn)動物遺傳多樣性研究中應用最多的分子標記[16-19]，在海參的遺傳多樣性研究中有較為廣泛的應用[20-24]。潘傳燕等[20]用FISCO方法構(gòu)建了仿刺參的微衛(wèi)星序列文庫，篩選出118條微衛(wèi)星DNA序列，并應用其中的20對序列分析了中國、韓國、俄羅斯、日本和美國的幾種仿刺參的遺傳多樣性。譚杰等[22]在用微衛(wèi)星技術(shù)分析煙臺、威海、大連3個地理種群遺傳多樣性時，發(fā)現(xiàn)3個群體間的遺傳變異較小，且大連群體和威海群體的親緣關(guān)系更近。李雪燕等[23]將微衛(wèi)星標記技術(shù)應用于仿刺參親本識別中，并成功將229只仿刺參幼體在14只疑似親本中找到真正親本，鑒定成功率達95%以上。

仿刺參有多個不同地理種群，本研究中的韓國種群生活水溫偏高，體色鮮艷呈暗紅色，俗稱韓國紅刺參，且其夏眠時間短，生長速度快，具一定的耐高溫特性。本研究以仿刺參韓國種群和中國種群作為親本，開展雜交試驗，以期通過雜交手段，使雜交后代獲得親本的耐高溫特性，在同等高溫條件下，降低死亡率，進而健康度夏，促進海參養(yǎng)殖業(yè)健康有序發(fā)展。本文利用微衛(wèi)星標記技術(shù)對三者的DNA進行研究，分析其遺傳多樣性，旨在為培育耐高溫雜交優(yōu)勢種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用仿刺參中國群體于2011年5月取自煙臺海益苗業(yè)有限公司，韓國群體于2011年1月采自韓國濟州島沿海。采用同步催產(chǎn)方法，對中國群體和韓國群體親本陰干、流水刺激后人工授精獲得雜交子代。以中國群體、韓國群體和雜交子代作為3個群體，每個群體隨機選取26只個體用于微衛(wèi)星試驗(由于引進的韓國群體數(shù)量有限，僅剩余26只，其他2個群體參照該數(shù)量隨機選取26個個體)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

將用于試驗的仿刺參樣品保存于無水乙醇中備用。用Segama試劑盒提取DNA，用分光光度計檢測濃度后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星DNA標記的選擇

本研究所用微衛(wèi)星DNA標記引物參考文獻[25]，選擇其中25對引物合成備用。微衛(wèi)星引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成, 引物具體信息見表1。

表1 微衛(wèi)星引物的重復單元、引物序列和復性溫度

1.2.3 多態(tài)性檢測

以3個仿刺參群體基因組DNA 為模板摸索各引物退火溫度后，進行PCR擴增。PCR擴增采用25 μL體系，其中包含 0.4 μmol/L的引物, 2.5 mol MgCl2, 0.2 mol dNTP, 1 U Taq DNA 聚合酶及約100 ng的基因組DNA。PCR 擴增條件參考文獻[25]。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選擇有明顯擴增產(chǎn)物的引物用8%(m/V)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態(tài)性。使用TaKaRa 公司10 bp DNA ladder Marker 為標準，人工計數(shù)統(tǒng)計條帶。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Popgen32 軟件計算各位點在3個群體中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、群體間的相似性系數(shù)和群體間遺傳距離。參照Botstein等[26]的方法計算各位點多態(tài)信息含量，χ2檢驗估計群體Hardy-Weinberg平衡偏離。根據(jù)群體間的Nei’s 遺傳距離，用Mega5.0軟件非加權(quán)組平均法構(gòu)建群體間聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果及各位點遺傳多樣性

應用25對引物對中國群體、韓國群體、雜交后代3個群體各26只個體進行了PCR擴增，其中15對引物有明顯的PCR產(chǎn)物，且15對引物均表現(xiàn)為多態(tài)。共獲得60個等位基因信息點，每個位點獲得的等位基因數(shù)從3(SSR8、SSR10、SSR15、SSR16、SSR18、SSR19、SSR20、SSR21)至9(SSR2)不等，每個位點的平均等位基因數(shù)為4。有效等位基因數(shù)在1.0000(SSR19)到7.3333(SSR2)之間，平均有效等位基因數(shù)為2.5855。3個群體的觀測雜合度為0.0000～0.07500，平均觀測雜合度分別為：0.2965(中國群體)、0.3548(韓國群體)、0.2755(雜交后代)，期望雜合度為0.0000～0.8837，平均期望雜合度分別為：0.5296(中國群體)、0.5574(韓國群體)、0.5364(雜交后代)。韓國群體的平均觀測雜合度與平均期望雜合度均為3個群體最高。3個群體的多態(tài)性信息含量為0.0000(SSR19)～0.8480(SSR2)，韓國群體的多態(tài)性信息含量也為最高(0.4860)，其余兩個群體平均多態(tài)性信息含量值為0.4653和0.4630。除SSR19為低多態(tài)性位點(多態(tài)性信息含量<0.25)外，SSR8、SSR10、SSR13、SSR15、SSR17、SSR18、SSR20和SSR21這8個位點表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25<多態(tài)性信息含量<0.5)，其余6個位點為高度多態(tài)(多態(tài)性信息含量>0.25)。通過P值檢驗，發(fā)現(xiàn)偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象在3個群體普遍存在，在本試驗的15對引物中，僅有1對引物(SSR20)在3個群體中均符合平衡。中國群體在SSR19位點上表現(xiàn)為單態(tài)，韓國群體在該位點有2個條帶，雜交參群體則明顯有二者的雜交組合帶(3條條帶信息)(表2)。

2.2 遺傳距離、相似性指數(shù)及非加權(quán)組平均法構(gòu)建聚類圖

根據(jù)15個微衛(wèi)星位點在3個群體中的條帶信息，計算遺傳距離、相似性指數(shù)(表3)。中國群體與雜交子代的遺傳距離最遠，距離為0.1880，中國種群與韓國群體、韓國群體與雜交子代的遺傳距離相近，分別為0.0990和0.0972，遺傳相似性數(shù)據(jù)結(jié)果與此吻合。利用Nei’s遺傳距離數(shù)值用非加權(quán)組平均法對3個群體進行聚類分析親緣關(guān)系，結(jié)果表明：雜交后代與韓國群體親緣關(guān)系更近，表現(xiàn)為先與韓國群體聚為一支，再與中國群體聚合(圖1)。

3 討 論

3.1 遺傳多樣性

3個群體都觀測到了顯著偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象，偏離平衡的現(xiàn)象可能與微衛(wèi)星技術(shù)本身的特異性、試驗樣本容量以及無效等位基因的存在有關(guān)[27]。在仿刺參的微衛(wèi)星相關(guān)研究中，偏離平衡的現(xiàn)象普遍存在[20-24]。潘傳燕等[20]利用微衛(wèi)星技術(shù)對不同地域的6個仿刺參群體進行研究，在120個位點中有83個位點(69.17%)顯著偏離了平衡。

遺傳多樣性被認為是生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)與核心內(nèi)容，與生物多樣性的形成、發(fā)展和消失有著密切的關(guān)系。而最大限度地維持種內(nèi)遺傳多樣性，則是利用種質(zhì)資源的前提和基礎(chǔ)，觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)性信息含量均為反映群體遺傳多樣性的重要指標，其數(shù)值越大，說明基因豐富度越高，多樣性水平越豐富。無論從多態(tài)性信息含量還是平均期望雜合度、平均觀測雜合度，韓國群體的數(shù)值均為最高。表明韓國群體的遺傳多樣性水平較高。本試驗中，中國群體并非野生群體，選育、連續(xù)自交導致的多樣性水平下降是中國群體多樣性水平低于韓國群體的可能原因之一。盡管如此，3個群體的多態(tài)性信息含量值均處中度多態(tài)水平，即3個群體基因變異程度處于中等水平，雜交仿刺參仍具一定的選育潛力。

譚杰等[22]應用9對微衛(wèi)星引物對3個仿刺參地理群體進行分析得到的平均觀測雜合度分別為0.6416、0.6595、0.5824，高于本試驗的平均觀測雜合度數(shù)值，該研究的試驗群體均為野生群體，本試驗除韓國群體是野生群體外，均為養(yǎng)殖群體，野生群體的多樣性水平一般要高于養(yǎng)殖群體。李紅梅等[28]應用自行開發(fā)的微衛(wèi)星標記引物對3個野生群體及2個養(yǎng)殖群體大黃魚(Pseudosciaenacrocea)進行了比對分析，得出野生群體的遺傳多樣性水平普遍高于養(yǎng)殖群體的結(jié)論。孫孝德等[24]對野生仿刺參及其兩代選育群體的遺傳變異情況進行了分析，3個群體的平均觀測雜合度為0.6469，第二代選育群體的雜合度最低，群體雜合度隨選育世代的增加呈逐代降低趨勢。

表2 3個刺參群體的15個微衛(wèi)星位點的遺傳參數(shù)

注：標*表示Hardy-Weinberg平衡檢驗P值≥0.05，符合平衡，其余P值<0.05，偏離平衡.

表3 仿刺參3個群體的遺傳距離和相似性指數(shù)

注：對角線上數(shù)據(jù)為遺傳相似性，對角線下數(shù)據(jù)為遺傳距離.

圖1 基于非加權(quán)組平均法構(gòu)建3個群體的聚類分析圖注:CS，中國群體; HS，韓國群體; ZJ，雜交群體.圖2同.

圖2 3 個仿刺參群體SSR21位點的微衛(wèi)星檢測圖譜

在群體隨機交配的情況下，雜交種的雜合度一般要高于雙親，但本試驗中，雜交參的雜合度低于雙親(比中國群體的雜合度低0.021)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與所選取的微衛(wèi)星位點或樣本容量有關(guān)。在本研究的15個微衛(wèi)星位點上，由于樣本數(shù)量的限制，所選取的親本之一是自繁后代，遺傳背景較為相似，對子代的貢獻率可能比較一致，所以導致出現(xiàn)了雜合度并未因雜交而提高的現(xiàn)象。

3.2 雜種優(yōu)勢

根據(jù)親緣關(guān)系的遠近，雜交可分為種間雜交(不同科、亞科、屬之間的雜交)和種內(nèi)雜交兩種。魚類在種間雜交方面獲得了不少具明顯雜種優(yōu)勢的優(yōu)良品種[29]?！柏S鯉”、“荷元鯉”、“三雜交鯉”、“奧尼羅非魚”等雜交種具有抗寒、生長快、適應性強等明顯的雜交優(yōu)勢，是生產(chǎn)中推廣應用較多的雜交品種，且通過雜交后代的選育培育出“建鯉”和“松浦鯉”等新品種在生產(chǎn)中也獲得了成功[4]。但魚類的雜種多由某科不同亞科之間或同一種亞科不同屬之間的雜交獲得，雙親間的遠緣雜交使得魚類的雜交獲得成功，且鮮有利用近緣雜交來建立遺傳變異品系并應用于生產(chǎn)實踐的報道。相反，貝類則是在種內(nèi)雜交應用中獲得了成功。牡蠣的種間雜交常因種間隔離而導致雜交失??；鮑的種間雜交雜種幼蟲存活率顯示出負的雜種優(yōu)勢。海灣扇貝、皺紋盤鮑等貝類的種內(nèi)群體間或系群間雜交可操作性強、易推廣，獲得了明顯的生長優(yōu)勢[11]。

雜種優(yōu)勢的產(chǎn)生與親本間的遺傳差異密切相關(guān)[14]，孫靈毅等[30]認為，韓國紅刺參(即本研究中的韓國群體)與中國仿刺參生長環(huán)境條件不同，有各自不同的生長特性，具有基因異質(zhì)性，且二者正反交后代在生長方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。本試驗通過分子生物學手段進行分析，發(fā)現(xiàn)中國群體與韓國群體的遺傳差異較小(遺傳距離為0.0990)，基因異質(zhì)性體現(xiàn)并不明顯，該結(jié)果可能與本次試驗選取的遺傳位點或樣本容量有關(guān)。目前，在仿刺參雜交中，還未培育出可穩(wěn)定遺傳的雜交優(yōu)良品系。張黎黎等[31]以仿刺參的2個不同地理群體——俄羅斯仿刺參及中國仿刺參為親本進行了雜交，雜交仿刺參子一代幼參存活率及生長上表現(xiàn)了一定的優(yōu)越性。李莉等[32]等用2個微衛(wèi)星位點對中國仿刺參、日本紅刺參及其雜交子代進行了分析，證明了雜交子代的等位基因均來自于雙親，但由于位點有限，雜交后代與親本的遺傳多樣性信息并沒有詳盡的對比數(shù)據(jù)。

3.3 耐高溫品系的人工選育

群體遺傳多樣性的高低與其適應能力、生存能力和進化潛力密切相關(guān)，遺傳多樣性的降低可能導致生物的經(jīng)濟性狀衰退甚至是種質(zhì)退化[33]。本試驗中，韓國群體的遺傳多樣性處于相對高的水平，中國群體的遺傳多樣性相對較低，而雜交后代的遺傳多樣性水平并未因雜交而顯示出明顯的變化。盡管如此，雜交后代在某些微衛(wèi)星位點觀測到的等位基因頻率和基因型頻率仍表現(xiàn)出與親本的差異，說明雜交過程使后代獲得了一定程度的遺傳分化，中國群體與韓國群體的雜交后代具一定的選育潛力。但人工選育，尤其多代人工選育中常伴隨著遺傳多樣性指數(shù)的降低，而保證足夠大的有效親本數(shù)量是保持群體維持較高遺傳變異水平的有效手段之一，所以為保證仿刺參耐高溫優(yōu)勢性狀在雜交后代中的表達，擴大野生親本數(shù)量也許是有效途徑之一。

至于引進韓國種群后對中國仿刺參種群的危害，暫時尚無支撐結(jié)論的數(shù)據(jù)，但本研究的目的并非單純引進新品種，而重在改良本地仿刺參性狀方面的雜交，旨在通過雜交提高本地仿刺參遺傳多樣性，促進基因交流，獲得耐高溫性狀。若引進該韓國種群，則還需充分評估引種后續(xù)問題后具體實施。本部分分子生物學研究為仿刺參韓國群體與中國群體雜交提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，但由于樣本量有限，一些數(shù)據(jù)還有待于在后續(xù)試驗中不斷的補充和完善。

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MicrosatelliteAnalysisofGeneticCharacteristicsinCrossesbetweenKoreaPopulationandChinaPopulationofSeaCucumberApostichopusjaponicus

WANG He1, WANG Tiantian1, HU Liping1, ZHAO Qiang1, SUN Guohua2, SUN Lingyi1

( 1. Yantai Fisheries Research Institute, Yantai 264003, China;2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China )

Genetic diversities of the crosses between Korea population and China population of sea cucumberApostichopusjaponicuswere studied using microsatellite DNA techniques. A total of 60 alleles were detected at 15 loci in the three populations and each locus had the alleles ranging from 3 to 9 with an average of 4, and average effective allele of 2.5855. The average observed and expected heterozygosities were found to be 0.2965 and 0.3548 in Korea population, 0.2755 and 0.5296 in China population, and 0.5574 and 0.5364 in the cross. The polymorphism information content was found to be ranged from 0.0000 to 0.8480 with an average of 0.4653 in Korea population, 0.4860 in China population, and 0.4630 in the cross. The Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) analysis revealed that the deviation was ubiquity in these three populations. There were 14 loci which had intermediate or high polymorphism information among the 15 loci, showing that the diversity level was moderate polymorphisms in the three populations. The maximal level of genetic diversity was observed in Korea population (HS), and no significant cross vigour was found in the cross (ZJ). However, there were differences in the allele frequency or genotype frequency among the populations with potentiality in breeding.

Apostichopusjaponicus; genetic diversity; hybridization; microsatellite

Q78

A

1003-1111(2016)01-0060-07

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.01.011

2015-06-19；

2015-09-15.

山東省科技發(fā)展計劃項目(2010GHY10519)；山東省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(201304).

王鶴(1985-)，女，工程師；研究方向：海洋經(jīng)濟動物繁育. E-mail: wanghebird@126.com. 通訊作者：孫靈毅(1963-)，女，研究員；研究方向：遺傳育種. E-mail: sunly1963@163.com.