張浩楠， 鄭延澤， 何靜波， 田彩云， 武海軍， 楊玉梅

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蒙藥嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)相海馬中IL-1βIL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)的影響

張浩楠， 鄭延澤， 何靜波， 田彩云， 武海軍， 楊玉梅

目的 觀察蒙藥嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)的影響。方法 360只雄性SD大鼠隨機(jī)分為腦缺血模型組、假手術(shù)組、嘎日迪-13大、中、小劑量組，每組又隨機(jī)分為6個(gè)時(shí)相組，灌胃給藥，一次/d，連續(xù)27 d后，線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，神經(jīng)功能評(píng)分后免疫組化法測(cè)定海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達(dá)。結(jié)果 嘎日迪-13明顯降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，并明顯降低腦缺血大鼠海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達(dá)水平。結(jié)論 蒙藥嘎日迪-13對(duì)大鼠腦缺血有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin等因子的表達(dá)水平有關(guān)。

蒙藥； 嘎日迪-13； 腦缺血； 大鼠； IL-1β； IL-8； ICAM-1； P-selectin

蒙醫(yī)理論認(rèn)為缺血性腦血管疾病屬于白脈病范疇之內(nèi)的“薩病”，發(fā)病原因?yàn)闅庋鰷?dǎo)致血脈阻塞而使白脈之海-腦失去功能。嘎日迪-13是蒙醫(yī)常用來治療“薩病”的傳統(tǒng)方劑之一，主要由訶子、制草烏、麝香、沉香等13味藥組成，主治半身不遂、左癱右瘓、口眼歪斜、言語不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹等癥狀，療效明顯。已有的研究表明[1～3]，嘎日迪-13對(duì)腦缺血有很好的保護(hù)作用，但缺乏實(shí)驗(yàn)機(jī)制的相關(guān)研究。本研究通過觀察腦缺血后大鼠海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達(dá)量，在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討嘎日迪-13對(duì)腦缺血的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，360只，體重(200±50)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0012。環(huán)境溫度為22 ℃～26 ℃，按每籠6只飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間各鼠均自由進(jìn)行飲水?dāng)z食。

1.1.2 試劑和藥物 嘎日迪-13，內(nèi)蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司(金山)蒙藥廠，批號(hào)：080905； IL-1 bs-6319R，IL-8 bs-0780R，ICAM-1 bs-4615R，P-selectin bs-0561R北京博奧森；PV-6000通用型二抗試劑盒，6 ml；ZLI-9018 DAB kit 3 ml；PBS緩沖液(0.01 mol;pH=7.2～7.4)；檸檬酸鹽修復(fù)液(pH=6.0；0.01 mol)。其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 Leica 2135石蠟病理切片機(jī)，德國Leica公司；YB-7B病理組織包埋機(jī)，安徽電子科學(xué)研究所；ZT-12P生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；QP切片漂烘儀，安徽電子科學(xué)研究所；Leica激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司。

1.2 方法 動(dòng)物分組及模型制備360只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為：腦缺血模型組(n=72)；假手術(shù)組(n=72)；嘎日迪-13大劑量組(n=72，1.2 g/100 ml)；嘎日迪-13中劑量組(n=72，0.6g/100 ml)；嘎日迪-13小劑量組(n=72，0.3 g/100 ml)。每個(gè)劑量組下分6個(gè)時(shí)相即1 h、6 h、12 h、24 h、72 h與120 h，72只大鼠隨機(jī)分至6個(gè)時(shí)相，每個(gè)時(shí)相12只大鼠。各組大鼠均進(jìn)行灌胃給藥(2 ml/100 g，模型組與假手術(shù)組給予等體積生理鹽水代替藥物)，連續(xù)27 d，一次/d，末次給藥后1 h開始造模。模型制備采用Longa[4]的線栓法加以改良制作大腦中動(dòng)脈缺血模型。

1.3 取材 在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)，以3%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)麻醉大鼠，剪開胸壁，暴露心臟，用室溫生理鹽水通過左心尖部，沿升主動(dòng)脈灌注沖血，同時(shí)剪開右心耳，可見右心耳流出液體的顏色逐漸由鮮紅色變?yōu)榈t色,至基本無色為止，換4%甲醛灌流，至大鼠肢體、尾巴僵直，即表明固定成功。開顱取腦，缺血側(cè)腦組織樣本放置于4%甲醛內(nèi)固定24 h，進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定 參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分為5個(gè)等級(jí)：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈(追尾現(xiàn)象)；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.4.2 免疫組化觀察腦缺血大鼠海馬不同時(shí)相IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)量 石蠟包埋，切片，65 ℃烤片1 h待用，其余步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書嚴(yán)格操作?？瞻讓?duì)照一抗為PBS。陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿棕黃色深染，鏡下(×400)隨機(jī)觀察缺血區(qū)域不重疊的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各因子胞漿陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 與假手術(shù)組比較，腦缺血模型組大鼠各時(shí)相神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(見表1)。

2.2 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)相海馬IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)量的影響 腦缺血后1 h，模型組大鼠海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，并在24 h達(dá)到峰值后呈逐漸下降趨勢(shì)；與腦缺血模型組比較，嘎日迪-13組大鼠各時(shí)相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin表達(dá)量明顯降低(P<0.05，P< 0.01)(見表2～表5)。

表1 嘎日迪-13對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響±s ，n=8)

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表2 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬中IL-1β表達(dá)量的影響±s，n=8，ng/L)

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表3 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬中IL-8表達(dá)量的影響( ±s，n=8，ng/L)

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

表4 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬中ICAM-1表達(dá)量的影響±s，n=8，ng/L)

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.01

表5 嘎日迪-13在不同時(shí)相對(duì)局灶性腦缺血大鼠海馬中P-selectin表達(dá)量的影響

與假手術(shù)組比較*P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

近年來對(duì)腦缺血損傷的作用機(jī)制有了非常深入細(xì)致的研究，從整體到分子水平的大量實(shí)驗(yàn)研究表明[5]，炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，炎癥反應(yīng)重要的病理變化是腦微血管內(nèi)白細(xì)胞聚集變形穿越血管，然后浸潤腦組織，整個(gè)過程中還會(huì)伴有微血管循環(huán)功能障礙，腦組織水腫和血漿蛋白聚集?？梢?，白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是腦缺血炎癥損傷的開端。

粘附分子在炎癥反應(yīng)起始階段介導(dǎo)了白細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的滾動(dòng)，其可分為3個(gè)家族：選擇素家族、可識(shí)別整合素的免疫球蛋白超家族成員和整合素家族。

選擇素是在血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面表達(dá)的一種表面糖蛋白，根據(jù)表達(dá)部位不同可分成3類：P-selectin，表達(dá)于活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面；E-selectin，表達(dá)于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面；L-selectin，表達(dá)于白細(xì)胞表面[6]。P-selectin在細(xì)胞受到刺激之后可通過質(zhì)膜融合的方式迅速表達(dá)于細(xì)胞表面，或者在4～6 h之后通過mRNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯再表達(dá)。大鼠MCAO再灌2～24 h均可檢測(cè)到P-selectin存在，且與白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附遷移和組織水腫形成的部位一致[7]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，血栓性疾病的早期階段血中P-selectin增高可反映體內(nèi)血小板活化程度,尤其是短暫性腦缺血發(fā)作和急性腦梗死等缺血性腦血管疾病患者[8]。

ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，生理狀態(tài)下呈低表達(dá)，其主要受體是整合素家族的CD11a/CD18。ICAM-1與其受體結(jié)合后，在介導(dǎo)白細(xì)胞向炎癥區(qū)移行及淋巴細(xì)胞歸巢和再循環(huán)的進(jìn)程中起重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[9,10]，大鼠腦缺血2～6 h后，缺血區(qū)及周邊微血管內(nèi)ICAM-1表達(dá)明顯增加，至24～48 h達(dá)到峰值，其表達(dá)程度的增加比TNF-α和IL-1β稍晚[11]。近年臨床研究也發(fā)現(xiàn)，可溶性ICAM-1在急性缺血性腦病患者腦脊液和血漿中含量顯著升高,而且發(fā)現(xiàn)ICAM-1表達(dá)水平的高低與腦缺血損傷程度成正相關(guān)[12,13]。

IL-1β在缺血腦損傷過程中是重要的一個(gè)致炎因子。IL-1β是IL-1在腦組織、血漿和組織液中的一種存在形式，在其他因子協(xié)同下促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化，更重要的是其可誘導(dǎo)ICAM-1、IL-8表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、聚集加重炎癥反應(yīng)程度[14]。有研究顯示，腦缺血后IL-1β可在腦組織、腦脊液和血清中檢測(cè)到異常增加[15]。腦組織、血漿和腦脊液中IL-1β表達(dá)明顯上調(diào)，提高血小板活化因子水平，改變內(nèi)皮細(xì)胞的抗凝血功能，進(jìn)一步加快血栓的形成[16]。

IL-8可來源于多種細(xì)胞，是一種非常重要的趨化因子，是一類典型的炎癥介質(zhì)，其可趨化激活中性粒細(xì)胞并參與中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附過程的調(diào)節(jié)[17]。IL-8及其相關(guān)趨化性多肽亦可迅速趨化活化整合素α、β鏈的連接分子，增加白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和跨膜移行[18]，并誘導(dǎo)ICAM-1的表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[19]，大鼠腦缺血再灌3 h后，缺血區(qū)IL-8濃度升高，12 h達(dá)到峰值。臨床研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦血管疾病患者血清IL-8含量高于正常人，且大面積梗死患者血清IL-8含量高于小面積梗死患者，提示IL-8與腦缺血后損傷有關(guān)[20]。

本研究通過對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分觀察，顯示嘎日迪-13對(duì)腦缺血具有很好的保護(hù)作用。且嘎日迪-13能夠明顯降低腦缺血大鼠各時(shí)相海馬中IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin的表達(dá)水平。表明嘎日迪-13可在不同時(shí)相，不同靶點(diǎn)抑制腦缺血后白細(xì)胞遷移浸潤和炎癥反應(yīng)對(duì)神經(jīng)的損傷。所以提示嘎日迪-13抑制炎癥因子和黏附因子的表達(dá)可能是其對(duì)腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制之一。

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Influence of mongolian medicine garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus

ZHANG Haonan,HENG Yanze,HE Jingbo,et al.

(Baotou Medical College,Inner Mongolia,Baotou 024000,China)

Objective To observe the influence of Mongolian Medicine Garidi-13 on the expression of IL-1β、IL-8、ICAM-1、P-selectin at different phase of cerebral ischemic rats hippocampus.Methods 360 male SD rats were randomly divided into vehicle control group,sham-operated group,Gridi-13 large dose group,Gridi-13 middle dose group and Gridi-13 small dose group,then each group was divided into the ischemia 1 h,6 h,12 h,24 h,72 h and 120 h phases.Lavage rats with Garidi-13 once a day till 27th,then established cerebral ischemia model with Suture method cerebral ischemia model.After having recorded the neurofunctional score,their brain samples were collected for immunohistochemical staining of IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin.Result The expressions of hippocampal IL-1β,IL-8,ICAM-1 and P-selectin in the model group were significantly higher than those in vehicle group (P<0.01).According to the results of immunohistochemical staining,the Garidi-13 groups could inhibit the expression of IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin.Conclusion Garidi-13’s protective mechanism for brain tissues of cerebral ischemic rats may be related to its effects in inhibiting IL-1β,IL-8,ICAM-1,P-selectin expression.

Mongolian Medicine; Garidi-13; Cerebral Ischemic; Rats; IL-1β; IL-8; ICAM-1; P-selectin

1003-2754(2016)10-0905-04

2016-06-02；

2016-09-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81160560)

(包頭醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

楊玉梅，E-mail：yym457@aliyun.com

R743.3

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