熊 宏 ，陳海濤 ，宋 健 ，趙 平 ，劉小燭 ，丁 勇

（西南林業(yè)大學 a.生命科學學院；b.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆與序列分析

熊 宏a，陳海濤a，宋 健a，趙 平b，劉小燭a，丁 勇b

（西南林業(yè)大學 a.生命科學學院；b.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室，云南 昆明 650224）

應用轉錄組測序分析和RT-PCR技術首次從樟葉越桔Vaccinium dunalianum中克隆了全長1 570 bp的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1，其完整的開放閱讀框推測編碼由337個氨基酸殘基組成的VdGAPDH1。VdGAPDH1理論相對分子量為36.57 kD，等電點為7.06，負電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為42個，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為42個，不穩(wěn)定系數(shù)為23.27，屬穩(wěn)定性蛋白質；其二級結構主要由隨機卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-轉角等構件組成。VdGAPDH1為無信號肽、無跨膜結構的親水性蛋白質，推測其為NAD+-GAPDH的新成員，與已知細胞質型GAPDH之間存在高度保守性。VdGAPDH1包含2個保守超家族結構域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N為輔酶NAD+結合結構域，Gp_dh_C是行使糖運輸和代謝的催化功能域。推測VdGAPDH1基因產物在樟葉越桔細胞質中參與糖酵解過程。該研究為后期VdGAPDH1基因的生理功能及其表達調控等研究奠定了基礎。

樟葉越桔；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；基因克??；糖酵解

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是生命活動中糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的一種關鍵酶，是維持生命活動能量形成的最基本酶之一[1-4]。在細胞質中進行的糖酵解過程，GAPDH的作用是催化3-磷酸甘油醛氧化磷酸化形成1, 3-二磷酸甘油酸，從而產生糖酵解過程中的第一個ATP[5]。普遍認為GAPDH幾乎在所有組織中都高水平表達，且通常在同種組織或細胞中的表達量相對恒定，因此其常被用作研究其他基因和蛋白表達的內參照[6]。目前研究推測GAPDH是一種多功能酶，除參與能量代謝外，在動物中還參與調節(jié)多種細胞的結構功能，如DNA修復、核RNA的輸出、維持端粒結構、膜融合和轉運、細胞骨架動態(tài)平衡和加速微管蛋白成束等[7-12]，以及在植物逆境脅迫下發(fā)揮重要作用[13-16]。

樟葉越桔Vaccinium dunalianumWight為杜鵑花科Ericaceae越桔屬Vaccinium常綠灌木或小喬木，該植物具有多方面的生理活性，植株全株可做藥用，有祛風除濕、舒筋活絡等功效[17]。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)云南省武定縣野生樟葉越桔是一種富含皮膚美白天然活性劑原料熊果苷（arbutin）及其衍生物的特殊資源植物，暗示樟葉越桔具有極大的研究和應用價值。隨后，有關樟葉越桔的系統(tǒng)進化[19]、化學成分[20-21]、核酸提取[22]、組織培養(yǎng)[23]、重要功能基因克隆[24-25]等方面的研究相繼被報道，但目前尚未見有關于樟葉越桔GAPDH基因方面的研究報道。本研究根據(jù)前期樟葉越桔葉芽轉錄組測序實驗數(shù)據(jù)拼接得到的GAPDH基因cDNA全長序列設計特異性引物，結合RT-PCR技術克隆了樟葉越桔VdGAPDH1基因全長cDNA序列，并對其編碼產物VdGAPDH1蛋白特性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗材料

實驗材料為樟葉越桔葉芽，采自云南省楚雄州武定縣高橋鎮(zhèn)唐家村（海拔高度為2 100 m，位于 25°57′N、102°24′E），原植物標本存放于中國科學院昆明植物研究所標本館，由劉恩德博士鑒定。取樟葉越桔新鮮葉芽置于液氮中速凍，帶回實驗室后于-80℃冰箱中保存，供提取總RNA用。

1.1.2 實驗試劑

植物總RNA提取試劑盒購于OMEGA公司，反轉錄試劑盒和pMD19-T載體和大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞購于寶生物工程有限公司，DNA膠回收試劑盒購于天根生化科技有限公司，其他相關試劑均購于昆明滇工科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與檢測

參照朱東陽等[22]方法提取樟葉越桔葉芽總RNA，分別用紫外分光光度計法和1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA樣品的純度和完整性。

1.2.2 樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA克隆

根據(jù)本課題組前期對樟葉越桔葉芽轉錄組測序、拼接、分析獲得的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因cDNA全長序列設計特異性引物，包括Sense Primer：5'-CAATCGTCGCTTTAGTTCCA-3'和Anti-sense Primer：5'-TAAATGAGTCCGAGCACAGG-3'，引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。第一鏈cDNA合成按照RNA反轉錄試劑盒說明書進行操作。取反轉錄cDNA模板2 μL，SensePrimer和 Anti-sense Primer各 1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立 25 μL的PCR反應體系。PCR擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產物檢測、回收、T/A克隆與測序

PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，回收目的片段并連接到pMD19-T載體上，將重組子轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，轉化復蘇后的菌液涂布在含有Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后隨機篩選白色菌落，將陽性克隆菌液送往上海生工生物工程技術服務有限公司完成測序。

1.2.4 生物信息學分析

應用NCBI的Blast工具對核酸和蛋白質序列進行相似性比對，使用ORF Finder工具分析基因mRNA的開放閱讀框；參照已知文獻[24-25]報道的生物信息學方法分析蛋白理論分子量、等電點、氨基酸含量和穩(wěn)定性，比對同源蛋白質序列，構建系統(tǒng)發(fā)生樹，并對蛋白質親水/疏水性特性、跨膜結構、信號肽及功能域進行預測；目的蛋白二級、三級結構預測參照丁勇等[26]應用的方法進行。

2 結果與分析

2.1 樟葉越桔葉芽總RNA提取與檢測

本實驗獲得的樟葉越桔葉芽總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果（見圖1）顯示28S、18S和5.8S rRNA條帶清晰，點樣孔無亮斑，無彌散拖尾，28S rRNA條帶亮度約為18S rRNA的2倍，說明總RNA完整性好且無污染；總RNA的A260/A280值為2.03，說明純度好且無蛋白質、多糖和酚類物質等雜質污染。表明本實驗提取獲得的總RNA能滿足后續(xù)分子實驗要求。

圖1 樟葉越桔葉芽總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig.1 Agrose gel electrophoresis analysis of the total RNA from Vaccinium dunalianumbuds

2.2 樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA克隆

以提取的總RNA反轉錄合成的第一鏈cDNA為模板，利用前述引物進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳圖（見圖2）顯示PCR產物條帶單一，該特異性PCR產物條帶經膠回收和TA克隆測序，得到樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA，序列長1 570 bp，與前期轉錄組測序拼接結果一致，命名為VdGAPDH1。應用NCBI中的BlastN同源性比對分析結果顯示，樟葉越桔VdGAPDH1基因與 田 七Panax notoginseng（KF815711.1）、人 參Panax ginseng（KF699323.1） 的GAPDH基因的相似性為85%，與大豆Glycine max（NM_001250615.1）、 楊 樹Populus（XM_002298558.2）、 棉 花Gossypium hirsutum（FJ415206.1）、川桑Morus notabilis（XM_010106872.1）、豌豆Pea（L07500.1）、煙草Nicotiana tabacum（AJ133422.1）、可可Theobroma cacao（XM_007037842.1） 和 菜 豆Phaseolus vulgaris（KF033722.1）等的GAPDH基因的相似性為84%，表明該實驗成功獲得樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的cDNA序列。

圖2 樟葉越桔VdGAPDH1基因RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖像Fig.2 Agrose gel electrophoresis analysis of RT-PCR product of VdGAPDH1 gene

2.3 序列分析

NCBI的ORF Finder工具分析結果顯示本實驗克隆的VdGAPDH1基因cDNA序列在50～1 063 bp區(qū)為完整的ORF區(qū)域，1～49 bp區(qū)屬于5'非編碼區(qū)，1 064～1 570 bp區(qū)屬于3'非編碼區(qū)。推測克隆的VdGAPDH1基因編碼由337個氨基酸殘基組成的樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（VdGAPDH1），蛋白質理化性質預測結果顯示，VdGAPDH1分別含負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)各42個，等電點pI值預測為7.06，理論相對分子量為36.57 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為23.27，推測VdGAPDH1屬于穩(wěn)定性蛋白質。圖3顯示了VdGAPDH1基因ORF的核苷酸序列及其推導的VdGAPDH1蛋白的氨基酸序列。

蛋白質同源性分析結果（見圖4）顯示VdGAPDH1與巨桉Eucalyptus grandis（EgGAPDH，XP_010026741.1）、 荷 花Nelumbo nucifera（NnGAPDH，XP_010248875.1）、 梅 花Prunus persica（PpGAPDH，XP_007222474.1）、芝 麻Sesamum indicum（SiGAPDH，XP_011086733.1）、甜橙Citrus sinensis（CsGAPDH，XP_006484037.1）、 丹 參Salvia miltiorrhiza（SmGAPDH，AGW24628.1）、 蓖 麻Ricinuscommunis（RcGAPDH，XP_002511235.1）、三七Panax notoginseng（PnGAPDH，AIX10772.1）、金 魚 草Antirrhinum majus（AmGAPDH，P25861.1）等的GAPDH相似性都高達93%以上，與其它許多植物的GAPDH蛋白相似性也高達90%。用不同物種GAPDH基因編碼的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹，結果（見圖5）顯示VdGAPDH1雖然獨自處在一個分支，但是它與比較的其它12個物種GAPDH的進化關系卻十分近，說明不同物種的GAPDH同源基因在進化過程中高度保守。

圖3 VdGAPDH1 ORF核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 ORF

圖4 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的氨基酸序列比對Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of VdGAPDH1 and GAPDH gene from other plants

圖5 VdGAPDH1和其他植物GAPDH的進化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of VdGAPDH1 and other plant GAPDH

分泌性蛋白在N-末端存在一段16至26個氨基酸殘基組成的特殊序列，稱為信號肽，其具有指導初生蛋白質的跨膜轉移及其定位功能，在行使功能后被切除[27]。VdGAPDH1蛋白信號肽分析結果（見圖6）顯示其存在信號肽的可能性值為0.001、信號錨定的可能性值為0，N-末端氨基酸殘基信號肽剪切值為0，表明VdGAPDH1蛋白不可能存在信號肽。結合蛋白理化性質分析結果，推測VdGAPDH1為非分泌性的穩(wěn)定性蛋白質。

蛋白質疏水性和跨膜結構域分析結果能為蛋白質二級結構預測、結構域和功能域的劃分提供參考依據(jù)[24]。親水/疏水性分析結果（見圖7）顯示VdGAPDH1整個肽鏈中均勻分布著親水性氨基酸，且在第142～143位氨基酸殘基出出現(xiàn)親水性最強值（-2.322），雖在第330位氨基酸殘基處出現(xiàn)了疏水性最強值（2.278），但VdGAPDH1整個肽鏈中沒有出現(xiàn)明顯的疏水區(qū)域，表明VdGAPDH1屬于親水性蛋白?？缒そY構域預測結果（見圖8）顯示VdGAPDH1也不存在蛋白質跨膜結構域，表明也不存在疏水性結構域，與疏水性分析結果相符合。提示VdGAPDH1在樟葉越桔中以非分泌性穩(wěn)定性蛋白質存在，其在細胞質核糖體中合成后不經運轉且不與細胞膜結合而在細胞質中行使功能。

圖6 VdGAPDH1蛋白信號肽預測Fig.6 Prediction of VdGAPDH1protein signal peptide

蛋白質分子的多肽鏈通常折疊和盤曲成比較穩(wěn)定的空間結構，形成比較穩(wěn)定的二級結構，進一步才能完成活性功能域構象的構建，形成高級結構，最終完成特定的生命活動。VdGAPDH1蛋白質二級結構預測結果（見圖9）顯示其由30.27%的隨機卷曲、29.97%的延伸鏈、26.11%的α-螺旋和13.65%的β-轉角等構件組成。蛋白質結構功能域分析結果（見圖10）表明VdGAPDH1包含2個保守結構域，分別為位于第4～154位氨基酸殘基的Gp_dh_N超家族結構域和位于第159～316位氨基酸殘基處的Gp_dh_C超家族結構域，這符合已知GAPDH的結構和功能特征，其每個亞基包含兩個保守結構域，即輔酶結合結構域和催化結構域。

圖7 VdGAPDH1蛋白質疏水性和親水性分析Fig.7 Prediction of VdGAPDH1protein hydrophobicity and hydrophilicity pro fi le

圖8 VdGAPDH1跨膜結構域預測Fig.8 Prediction of transmembrane region of VdGAPDH1

圖9 VdGAPDH1蛋白氨基酸序列的二級結構預測Fig.9 The secondary structure of the deduced VdGAPDH1 polypeptide

圖10 VdGAPDH1蛋白保守區(qū)分析Fig.10 Analysis of VdGAPDH1protein conservative region

圖11 樟葉越桔VdGAPDH1蛋白質三維結構預測圖像Fig.11 3D structure prediction of VdGAPDH1 protein

I-TASSER程序預測VdGAPDH1蛋白三級結構圖（見圖11-A）中可以明顯顯示出Gp_dh_N和Gp_dh_C兩個保守結構域，SWISS-MODEL同源建模法構建了樟葉越桔高級結構模型，顯示VdGAPDH1以同源四聚體的形式存在，與水稻Oryza Sativa細胞質型GAPDH同源四聚體模型3e5r.1.A具有85.71%的同源性，與水稻Oryza Sativa細胞質型GAPDH同源四聚體模型3e6a.1.D和3e6a.1.C也同時具有85.67%的同源性。推測VdGAPDH1屬于細胞質的NAD+-GAPDH，并類似于水稻細胞質型GAPDH在生物體中以同源四聚體的形式發(fā)揮生物學功能。

3 討 論

GAPDH存在于所有生物體中，是維持生命活動能量形成的最基本酶之一[1-4]。GAPDH的基因和蛋白已在谷子Setaria italica[28]、小麥Triticeae Dumort[29]、 家 蠶Bombyx mori[30]、 球毛殼菌Chaetomium globosum[31]等物種中得到了一定的研究。本研究首次從樟葉越桔中克隆了GAPDH基因長1 570 bp的cDNA序列，命名為VdGAPDH1。推測VdGAPDH1在樟葉越桔中編碼由337個氨基酸殘基組成的36.57 kD的VdGAPDH1。蛋白質一致性分析結果顯示VdGAPDH1與巨桉Eucalyptus grandis、荷花Nelumbo nucifera和梅花Prunus persica等多數(shù)已知植物的GAPDH都具有非常高的相似性，與已知研究觀點相一致[1-4]，表明GAPDH在不同生物中具有高度保守性。蛋白質結構功能分析結果顯示VdGAPDH1的第4～154位氨基酸殘基與Gp_dh_N超家族高度同源，而其第159～316位氨基酸殘基與Gp_dh_C超家族高度同源，表明VdGAPDH1在功能結構上符合已知GAPDH的結構和功能特征，包含2個保守超家族結構域Gp_dh_N和Gp_dh_C，這兩個保守結構域在VdGAPDH1蛋白三維結構圖中能清晰顯示出來。推測VdGAPDH1的Gp_dh_N保守結構域為輔酶結合結構域，Gp_dh_C保守結構域為催化結構域。

目前研究已證實，GAPDH以兩種不同類型存在高等植物中，一種是NAD+-GAPDH，存在于細胞質基質中，由4個相同的GapC亞基組成，特異性結合NAD+后在糖酵解過程中發(fā)揮作用；另一種是NADP+-GAPDH，存在于細胞葉綠體中，由GapA和GapB兩個不同亞基組成，特異性結合NADP+后在卡爾文循環(huán)中發(fā)揮作用[32,33]。本研究克隆的VdGAPDH1基因推測編碼由337個氨基酸殘基組成的VdGAPDH1為無信號肽、無跨膜結構的親水性蛋白質，且與已知細胞質型GAPDH具有非常高的同源性，推測VdGAPDH1為NAD+-GAPDH的新成員。該推測同時符合羅聰?shù)萚34]的研究結果，認為由337～340個氨基酸殘基組成的GAPDH存在于細胞質中主要參與糖酵解過程。

有研究認為GAPDH在同一生物體內不同組織中均高量而穩(wěn)定表達，因此可作為內參基因來研究其他功能基因的表達水平[6]。來自不同植物的GapC基因和蛋白質序列高度保守，因此又可作為植物起源與進化的分子標準[35]。也有研究認為GAPDH是一個多功能的酶，除參與能量代謝外，在動物中還參與DNA修復、核RNA的輸出、膜融合和轉運等多種細胞的結構功能[7-12]，以及在植物光合作用和逆境脅迫下發(fā)揮重要作用[13-16,36]，GAPDH基因表達和蛋白質翻譯水平會隨著內外源誘導因子變化而變化。然而VdGAPDH1基因在樟葉越桔中表達是否穩(wěn)定、是否可以作為內參用于研究其他功能基因的表達量有待于進一步的研究。

4 結 論

本研究首次從樟葉越桔中克隆了全長1 570bp的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因mRNA序列，命名為VdGAPDH1。推測VdGAPDH1基因在樟葉越桔中編碼由337個氨基酸殘基組成的36.57 kD的VdGAPDH1。VdGAPDH1為無信號肽、無跨膜結構、親水性的穩(wěn)定蛋白質，且與已知細胞質型GAPDH具有高度同源性，推測其為NAD+-GAPDH的新成員。VdGAPDH1包含2個保守超家族結構域Gp_dh_N和Gp_dh_C，Gp_dh_N保守結構域為輔酶NAD+結合結構域，Gp_dh_C保守結構域是行使糖運輸和代謝的催化功能域。推測VdGAPDH1基因產物在樟葉越桔細胞質中參與糖酵解過程。該研究為對VdGAPDH1基因的生理功能及其表達調控等進行深入研究奠定了基礎。

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Cloning and bioinformatics analysis ofVdGAPDH1gene inVaccinium dunalianum

XIONG Honga, CHEN Hai-taoa, SONG Jiana, ZHAO Pingb, LIU Xiao-zhua, DING Yongb
(a.College of Life Sciences; b.Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In this study, the geneVdGAPDH1with a full-length cDNA comprised 1570 nucleotides was primordial obtained by transcriptome sequencing and RT-PCR amplification fromV.dunalianum.The open reading frame encoded a putative VdGAPDH1 comprising 337 amino acid residues with molecular weight of 36.57 kD and isoelectric point of 7.06.The total number of positively charged residues (Arg+Lys) was 42, and the total number of negatively charged residues (Asp+Glu) was also 42.VdGAPDH1 with unstable coef fi cient 23.27 belongs to the stable protein.The main parts of predicted secondary structures of VdGAPDH1 were α-helices,random coils and extended strand.It was predictive VdGAPDH1 belongs to hydrophilic protein without any signal peptide and transmembrane structure.VdGAPDH1 was considered to be a new number of NAD+-GAPDH super family proteins.VdGAPDH1 shares with highly conservation in sequences with cytoplasmic GAPDH in many plants.There are two conserved super family structures,named as Gp_dh_N and Gp_dh_C in the structure of VdGAPDH1 protein.Homology modeling of the GAPDH inB.gymnorrhizabased on the 3D structure of the one in Spinaciaoleracea con fi rmed that the polypeptides between 70th to 405th amino acids was highly conserved.Plays a very important role in sugar metabolism and energy metabolism.TheVdGAPDH1gene product consists of two super family structures Gp_dh_N with function combining and Gp_dh_C, This work also suggested that VdGAPDH1 involve in process of glycolysis in the cytoplasm inV.dunalianum.The study results established the foundation for the expression, regulation and functional analysis ofVdGAPDH1.

Vaccinium dunalianum; GAPDH; gene cloning; glycolysis

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.004

http: //qks.csuft.edu.cn

S718.46

A

1673-923X(2016)07-0017-08

2015-10-14

國家自然科學基金項目（21462040, 31460076）；云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）

熊 宏，碩士研究生

丁 勇，高級實驗師，碩士生導師；E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

熊 宏，陳海濤，宋 健，等.樟葉越桔甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因VdGAPDH1的cDNA克隆與序列分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(7): 17-24, 30.

[本文編校：吳 毅]