童艷麗，翟海云，劉　翠，梅華清,潘育方，陳纘光

(1.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東　廣州　510317；2.廣東藥科大學(xué)　藥科學(xué)院，廣東　廣州　510006;3.中山大學(xué)　藥學(xué)院，廣東　廣州　510006)

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微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法快速測(cè)定鹽酸克林霉素的含量

童艷麗1，翟海云2*，劉翠3，梅華清1,潘育方2，陳纘光3

(1.廣東省第二人民醫(yī)院，廣東廣州510317；2.廣東藥科大學(xué)藥科學(xué)院，廣東廣州510006;3.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006)

建立了微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法快速測(cè)定鹽酸克林霉素膠囊中鹽酸克林霉素的方法?？疾炝司彌_液種類和濃度、添加劑種類、分離電壓以及進(jìn)樣時(shí)間等因素對(duì)分離檢測(cè)的影響。以2.0 mmol·L-1HAc +2.0 mmol·L-1NaAc為緩沖溶液，分離電壓為1.5 kV，進(jìn)樣時(shí)間15.0 s，在1.0 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)鹽酸克林霉素的快速分離測(cè)定。鹽酸克林霉素的線性范圍為20.0～200.0 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 2，檢出限(S/N=3)為5.0 μg·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，加標(biāo)回收率為95.9%～103%。該方法簡(jiǎn)便、快速，可為鹽酸克林霉素檢測(cè)提供新的方法和技術(shù)。

微流控芯片；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)；鹽酸克林霉素膠囊；鹽酸克林霉素

鹽酸克林霉素(Clindamycin hydrochloride)為林可霉素衍生物，其抗菌譜和林可霉素相同，但抗菌作用強(qiáng)，臨床主要用于骨髓炎、厭氣菌引起的感染、呼吸系統(tǒng)感染、膽道感染、心內(nèi)膜炎、中耳炎、皮膚軟組織感染及敗血癥等。鹽酸克林霉素的含量測(cè)定對(duì)藥品質(zhì)量控制、藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究等具有重要意義。已報(bào)道的鹽酸克林霉素含量測(cè)定方法有高效液相色譜(HPLC)法[1-3]、紫外-可見分光光度法[4-5]和旋光法[6]等，其中紫外-可見分光光度法及旋光法雖然簡(jiǎn)便，但選擇性較差；HPLC法分析成本相對(duì)較高，試劑消耗量大，樣品處理繁瑣。微流控芯片分析法具有分析速度快、樣品處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)，近年受到重視[7-13]，但用于鹽酸克林霉素含量測(cè)定尚未見報(bào)道。本文建立了測(cè)定鹽酸克林霉素膠囊中鹽酸克林霉素含量的微流控芯片-非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法，為該藥物的含量測(cè)定提供了一種方便、準(zhǔn)確、低成本的新方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

微流控芯片分析儀(型號(hào)CCD-08B，中山大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)藥儀器與應(yīng)用研究所研制)：由PMMA芯片(微通道上寬30 μm，下寬100 μm，深30 μm，進(jìn)樣通道為十字結(jié)構(gòu)，分離通道長(zhǎng)44 mm，有效分離長(zhǎng)度43 mm)、微型壓電陶瓷高壓電源[14]、非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器[15]和數(shù)據(jù)工作站組成；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，鞏儀市英峪予華儀器廠)；超聲波提取器(DA-3A型，順德樂(lè)從靈通電子廠)；數(shù)據(jù)記錄與處理在普通微機(jī)上完成。

三羥基氨基甲烷(Tris)，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES，上海生工生物工程有限公司)，鹽酸克林霉素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；鹽酸克林霉素膠囊(廣東臺(tái)城制藥股份有限公司，批號(hào)20140802)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2對(duì)照品與樣品溶液的制備

精密稱取鹽酸克林霉素對(duì)照品0.050 0 g，用水溶解并定容至50 mL容量瓶中，制得1.00 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。各種濃度的對(duì)照品溶液可在臨用時(shí)由儲(chǔ)備液稀釋得到。

取鹽酸克林霉素膠囊20粒，稱總重，將內(nèi)容物全部倒出，混勻，囊殼用水沖洗干凈后吹干并稱重，求得膠囊內(nèi)容物的平均質(zhì)量。精密稱取1粒膠囊量(約相當(dāng)于0.15 g鹽酸克林霉素)，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，加水，超聲振蕩10 min使之溶解，冷卻后加水定容，搖勻。精密量取濾液1.0 mL，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用水稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

進(jìn)樣前所有溶液均過(guò)0.22 μm微孔濾膜。

1.3分離測(cè)定

新芯片使用前用0.1 mol·L-1HNO3沖洗并浸泡20 min左右。每次實(shí)驗(yàn)使用芯片前，十字通道依次用0.1 mol·L-1NaOH活化15 min，水沖洗10 min，緩沖液平衡15 min。

一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，若仍使用同種緩沖液，則只需用該緩沖液沖洗通道2～3 min后平衡10 min左右；若更換緩沖液，則需重新活化以確保有較好的分離檢測(cè)重現(xiàn)性。每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，依次用水、0.1 mol·L-1HNO3沖洗通道，再用水充滿通道，以防堵塞。進(jìn)樣電壓100～500 V，分離電壓500～4 000 V；非接觸電導(dǎo)檢測(cè)器的激發(fā)電壓選擇60 V(Vp-p)，激發(fā)頻率60 kHz[9]。實(shí)驗(yàn)在恒溫(25 ℃)、恒濕(55%)條件下進(jìn)行。

2　結(jié)果與討論

2.1緩沖溶液的選擇

緩沖液對(duì)樣品的分離度和檢測(cè)靈敏度具有很大影響，是分離檢測(cè)條件優(yōu)化的重要因素。實(shí)驗(yàn)考察了H3BO3-NaH2PO4、檸檬酸-甘氨酸、MES-Tris、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、醋酸、檸檬酸、乳酸等緩沖液體系在不同濃度、不同配比條件下對(duì)分離和檢測(cè)效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-甘氨酸、乳酸、檸檬酸等緩沖體系中，基線漂移、噪音大，雜峰較多，鹽酸克林霉素的峰形和分離效果較差。在醋酸緩沖體系中，基線平穩(wěn)，鹽酸克林霉素出峰快，但與水峰接近，分離度欠佳。在MES-Tris和H3BO3-NaH2PO4緩沖體系中，基線不穩(wěn)定，且鹽酸克林霉素不出峰。而在醋酸-醋酸鈉緩沖體系中，基線較穩(wěn)定，電泳電流小，且鹽酸克林霉素的峰形較好，與雜質(zhì)峰和水峰分離度大，靈敏度高，故選擇醋酸-醋酸鈉作為最佳緩沖體系。

實(shí)驗(yàn)還考察了醋酸-醋酸鈉的不同濃度和濃度比對(duì)分離檢測(cè)效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)醋酸-醋酸鈉的濃度比為2.0 mmol·L-1∶2.0 mmol·L-1時(shí)，鹽酸克林霉素的峰高最大，且峰形最好。綜合考慮，選擇2.0 mmol·L-1HAc+2.0 mmol·L-1NaAc(pH 3.0)為分離介質(zhì)。

2.2添加劑的影響

考察了甲醇、乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-環(huán)糊精(β-CD)等添加劑對(duì)分離和檢測(cè)的影響，各以5%～10%的濃度進(jìn)行添加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加劑對(duì)鹽酸克林霉素的分離檢測(cè)并無(wú)明顯改善，甚至?xí)蛊浞逍巫儾睿蔬x擇不加任何添加劑。

2.3進(jìn)樣時(shí)間

考察了進(jìn)樣時(shí)間(5.0～20.0 s)對(duì)分離檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽酸克林霉素的峰高增大，但當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間超過(guò)15.0 s后，其增高的幅度減少，且峰形變差。綜合考慮，選擇進(jìn)樣時(shí)間為15.0 s。

2.4分離電壓

在分離通道內(nèi)徑和長(zhǎng)度固定的條件下，一定范圍內(nèi)提高分離電壓有利于樣品分離，但組分的遷移時(shí)間和分離電壓成反比。實(shí)驗(yàn)考察了分離電壓在0.5～3.5 kV范圍內(nèi)對(duì)樣品分析的影響。結(jié)果表明：當(dāng)分離電壓高于1.5 kV時(shí)，電壓對(duì)遷移時(shí)間的影響幅度降低；當(dāng)分離電壓達(dá)到3.5 kV時(shí)，基線有明顯的毛刺，且高壓電極與微芯片緩沖液池內(nèi)的接觸面有放電現(xiàn)象。綜合考慮，選擇分離電壓為1.5 kV。

2.5線性關(guān)系、檢出限及精密度

用對(duì)照品儲(chǔ)備液配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述優(yōu)化條件下進(jìn)樣，考察峰高(Y，μV)與對(duì)應(yīng)濃度(X，μg/mL)的關(guān)系，確定線性范圍為20.0～200.0 μg·mL-1，線性方程為Y=1 447X+19 824，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 2。檢出限(S/N=3)為5.0 μg·mL-1。以濃度為100.0 μg·mL-1的鹽酸克林霉素對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得鹽酸克林霉素峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%。

2.6樣品的測(cè)定及回收率

在選定條件下，鹽酸克林霉素對(duì)照品溶液和鹽酸克林霉素膠囊樣品溶液的芯片毛細(xì)管電泳圖譜見圖1，取樣品溶液3次測(cè)定所得峰高的平均值，代入線性回歸方程計(jì)算得每粒膠囊中鹽酸克林霉素的含量為0.142 g/粒(標(biāo)示量為0.15 g/粒)，為標(biāo)示量的94.5%。以此測(cè)定值，將試液配成含鹽酸克林霉素94.5 μg/mL的溶液3份，按高、中、低濃度分別加入鹽酸克林霉素對(duì)照品溶液，測(cè)得回收率為95.9%～103%(表1)。

3　結(jié)　論

本文采用微流控芯片非接觸電導(dǎo)檢測(cè)法測(cè)定鹽酸克林霉素膠囊中鹽酸克林霉素的含量，方法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，可用于鹽酸克林霉素膠囊的質(zhì)量控制。

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Rapid Determination of Clindamycin Hydrochloride by Contactless Conductivity Detection with Microfluidic Chip

TONG Yan-li1,ZHAI Hai-yun2*,LIU Cui3,MEI Hua-qing1,PAN Yu-fang2,CHEN Zuan-guang3

(1.Guangdong No.2 Provincial People’s Hospital,Guangzhou510317,China;2.College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou510006,China;3.School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou510006,China)

A method for the rapid determination of clindamycin hydrochloride in clindamycin hydrochloride capsules by microchip capillary electrophoresis with contactless conductivity detection was developed.Influence parameters on the separation and detection such as type and concentration of buffer,type of additive,separation voltage and injection time were investigated.Under the optimal conditions,using 2.0 mmol·L-1HAc-2.0 mmol·L-1NaAc as buffer solution,clindamycin hydrochloride was separated and detected within 1.0 min at a separation voltage of 1.5 kV and an injection time of 15.0 s.Clindamycin hydrochloride showed a good linear response in the range of 20.0-200.0 μg·mL-1,with a correlation coefficient(r) of 0.999 2.The limit of detection(S/N=3)was 5.0 μg·mL-1with RSD of 2.1%,and the recoveries were in the range of 95.9%-103%.This method was simple and rapid,and could be used for the detection and quality control of clindamycin hydrochloride in clindamycin hydrochloride capsules.

microfluidic chip；contactless conductivity detection；clindamycin hydrochloride capsules；clindamycin hydrochloride

2015-12-14；

2016-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(21375152)；廣東省自然科學(xué)基金(21005021)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020221098)

翟海云，博士，副教授，研究方向：藥物分析，Tel:020-39352135,E-mail：zhaihaiyun@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.021

O657.1;TQ460.72

A

1004-4957(2016)07-0893-04

實(shí)驗(yàn)技術(shù)