薛玉芹，方　強

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結(jié)核病DNA疫苗研究進展

薛玉芹，方強

[關(guān)鍵詞]結(jié)核??；DNA疫苗；綜述

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)引起的以呼吸道為主的一種傳染性疾病，嚴重危害人類健康。隨著醫(yī)學科學技術(shù)的發(fā)展，人類對抗TB已取得了一定的成果，包括有效的治療藥物及疫苗的研發(fā)。但同時由于Mtb耐藥的嚴重性、人類免疫缺陷性病毒(HIV)與Mtb的雙重感染及流動人口的日益增多、吸毒等，加上不少國家對TB的忽視，TB在全球范圍內(nèi)呈回升趨勢。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2012年全球結(jié)核病控制報告》[1]指出，雖然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趨勢，但每年仍有數(shù)百萬TB新發(fā)病例，2011年全球新增TB患者870萬人，死于TB的人數(shù)為140萬人，其中新增TB患者中有3.7%患有耐多藥TB，全球TB負擔仍然十分嚴重。

至今，卡介苗(BCG)仍是被批準使用的預防TB的唯一疫苗，其保護力不穩(wěn)定，差異大，究其原因可能受BCG菌株差異、感染Mtb菌株的差異性、Mtb的內(nèi)源性復燃和外源性再感染以及接種人群和臨床試驗方法的差異性等的影響[2]。隨著免疫學和分子生物學的迅速發(fā)展，新型的TB疫苗已得到廣泛研究，如活疫苗、亞單位疫苗(DNA疫苗、重組蛋白疫苗等)和滅活疫苗等，其中DNA疫苗以其安全、經(jīng)濟、有效等優(yōu)點，成為近年來TB疫苗研究的熱點之一，本文就TB DNA疫苗的研究進展作一綜述。

1DNA疫苗的概念及免疫機制

1.1DNA疫苗的概念DNA疫苗是指把能引起機體保護性免疫反應的病原體抗原編碼的外源基因和真核表達載體連接，通過某種方法導入機體，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄翻譯合成抗原蛋白，誘導機體產(chǎn)生對該抗原的體液免疫和細胞免疫反應，以達到預防和/或治療疾病的目的。WOLFF等[3]研究發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌細胞能捕獲不加任何處理的外源基因并在一定時間內(nèi)表達，并能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生相應的細胞與體液免疫反應，從而開辟了核酸疫苗學的新天地。DNA疫苗按其應用目的可分為預防性疫苗和治療性疫苗。

1.2DNA疫苗的免疫機制目前認為，TB DNA疫苗被直接導入宿主體內(nèi)后，在細胞內(nèi)表達Mtb蛋白抗原，加工形成多肽抗原，與宿主細胞MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，遞呈給宿主的免疫識別系統(tǒng)，引起特異性細胞和體液免疫應答，特別是細胞毒體細胞應答反應。組織細胞攝入質(zhì)粒DNA后，在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再在細胞質(zhì)內(nèi)翻譯成抗原蛋白分子。一部分內(nèi)源性抗原蛋白結(jié)合到泛肽上，被蛋白酶降解為多肽，通過肽轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)(TAP)轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成多肽-MHC-Ⅰ類分子聚合物，最后到達細胞膜表面，借助TCR受體被CD8+細胞識別，誘發(fā)CD8+CTL T細胞應答；同時，部分抗原從抗原提呈細胞(APC)的細胞膜進入，通過MHC-Ⅱ遞呈途徑，被APC溶酶體降解為多肽，最后形成成熟的MHC異聚體，在細胞膜表面，被CD4+T細胞識別，引起細胞免疫和體液免疫應答。其中，還有一部分抗原多肽遞呈給B細胞，激活B細胞，部分轉(zhuǎn)化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體，引發(fā)體液免疫[4-6]。

2TB DNA疫苗的種類

2.1TB預防性DNA疫苗疫苗的最初目的是為了預防疾病的發(fā)生，DNA疫苗也是如此。TB DNA疫苗的研究目的也是由于BCG保護力不穩(wěn)定，而作為第二代疫苗的重組蛋白亞單位疫苗誘發(fā)細胞免疫應答的能力較弱，對TB的預防并不理想，需要研發(fā)能夠全面誘發(fā)體液免疫和細胞免疫的新型疫苗來預防TB的發(fā)生。近年來，隨著對結(jié)核菌致病機制認識的深入，預防性DNA疫苗的研制目標不僅限于針對正常人群抗結(jié)核桿菌感染的預防，更重要的是要研發(fā)針對潛伏期感染的疫苗，達到抑制、清除潛伏感染的細菌，防止TB復發(fā)也是其重要的目標[7]。目前，已有多種TB預防性DNA疫苗在動物實驗中獲得了較理想的效果。

2.2TB治療性DNA疫苗由于化療藥的不良反應和耐多藥結(jié)核菌株的流行等，TB的免疫治療引起了學者的廣泛關(guān)注。治療性疫苗是指接種于已感染病原體的個體，發(fā)揮主動免疫，成為近年來控制傳染性疾病的新方向[8]。 TB治療性疫苗的目的是誘導和增強細胞介導的免疫反應，殺死細胞內(nèi)寄生的Mtb，DNA疫苗在細胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原，不僅能誘導體液免疫和TH1型細胞免疫應答，還能誘導特異性的CTL應答，能將低效的抑菌反應轉(zhuǎn)換成高效的殺菌作用。日本科學家[9]將白細胞介素(IL)-6相關(guān)基因連接到腺病毒載體，構(gòu)建IL-6相關(guān)DNA疫苗，采用該疫苗治療小鼠后，發(fā)現(xiàn)其肺部Mtb數(shù)目明顯低于BCG東京株，且能激發(fā)CTL活性，具有顯著的治療效果。目前在TB疫苗研制中備受關(guān)注的Ag85分泌性抗原，梁艷等[10-11]證明Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型DNA疫苗與藥物聯(lián)合使用能顯著提高藥物對耐藥Mtb感染的治療效果。其中，Mtb早期表達的蛋白，適應宿主體內(nèi)的免疫環(huán)境，成為免疫系統(tǒng)的誘導蛋白，因此在潛伏感染期首次表達的蛋白(休眠期蛋白)是治療性疫苗表達的重要抗原，但目前研究甚少，主要包括休眠相關(guān)基因熱休克蛋白(HSP)X、休眠相關(guān)蛋白(Dormancy-related，DosR)等。有研究[12-13]證明，HSP65與IL-12編碼基因融合表達構(gòu)建的DNA疫苗，在治療TB小鼠的實驗中，能顯著提高TH1細胞免疫反應，減少Mtb的數(shù)目。

3結(jié)核DNA疫苗研究的主要疫苗候選基因

3.1DosR編碼基因DosR是由Rv3407基因編碼，是Mtb從潛伏期轉(zhuǎn)化到再活化狀態(tài)時產(chǎn)生的特異性蛋白，對潛伏期人群有明顯的保護作用[14]，是治療性疫苗的重要抗原。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，Rv3407能誘導Mtb潛伏期的特異性記憶T細胞分泌干擾素(IFN)，構(gòu)建的 PVAX1-Rv3407 DNA 疫苗，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達蛋白抗原，能誘導宿主產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫應答，對Mtb的潛伏期感染狀態(tài)，產(chǎn)生高效的T細胞免疫。研究[18]報道，Mtb休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制備的疫苗具備有效預防潛伏期感染結(jié)核菌的復活。

3.2HSP編碼基因HSP又稱“分子伴侶”，屬于胞質(zhì)蛋白，是被免疫系統(tǒng)識別的重要抗原，其編碼基因是研究最早的DNA疫苗候選分子之一，近年來被用來研究DNA疫苗的主要是HSP65、HSP70編碼基因。二者質(zhì)粒DNA疫苗既可用作預防性疫苗又可作為治療性疫苗。ANDEREN等[19-20]構(gòu)建了HSP65與人IL-2融合基因的DNA疫苗，研究發(fā)現(xiàn)其能誘導產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-2和特異性的IgG2a抗體，在用于治療TB小鼠模型時，能明顯降低Mtb的數(shù)目，提高TH1型細胞免疫反應。胡方靖等[21]構(gòu)建pIHsp65GM真核表達質(zhì)粒并研究其DNA疫苗的免疫原性和對感染Mtb小鼠的免疫保護效果，研究表明，pIHsp65GM DNA疫苗能誘導小鼠產(chǎn)生特異性的IgG，脾淋巴細胞增殖和分泌IFN-γ，且脾、肺載菌量均低于對照組。HSP70具有基因佐劑作用，有多個T細胞和B細胞表位，免疫原性比Hsp65更強，可誘發(fā)特異性Th1反應。LOWRIE等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用HSP-70 DNA疫苗治療感染Mtb的小鼠，其HSP-70DNA疫苗可誘導IFN-γ的產(chǎn)生和特異性的CTL活性，小鼠脾、肺菌落數(shù)顯著低于對照組。史小玲等[23]把Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗接種于用H37Rv強毒株攻擊后的小鼠，研究表明該疫苗具有良好的免疫治療作用。

3.3Ag85復合物編碼基因Ag85復合物是Mtb和BCG主要的分泌性蛋白，由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個組分構(gòu)成。在Ag85編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗中，Ag85A和Ag85B效果為佳，Ag85C基因重組的DNA疫苗效果不及Ag85A和Ag85B[24]。Ag85A和Ag85B含有數(shù)個T細胞抗原決定簇，可誘導感染鼠產(chǎn)生Ⅳ型超敏反應(DTH)和保護性免疫。HA等[25]將Ag85A DNA疫苗及IL-12用于感染TB小鼠的治療，發(fā)現(xiàn)該疫苗和藥物聯(lián)合治療能顯著減少小鼠TB的復發(fā)。此外，國內(nèi)研制的Ag85A DNA疫苗，正在進行中試工藝研究中[26]。

3.4MPT64編碼基因MPT64編碼基因位于RD2區(qū)，在某些BCG菌株缺失，編碼的分泌性MPT64蛋白是重要的T細胞抗原和B細胞抗原，能誘導Mtb感染的豚鼠發(fā)生很強的DTH反應。KAMATH等[27]首次將MTP64 DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠，在間隔免疫過程中血清特異性抗體滴度逐漸升高，可誘導脾細胞產(chǎn)生IFN-γ和特異性的CTL活性。梁艷等[11,28]比較Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B 4種DNA疫苗的免疫原性發(fā)現(xiàn)，4組DNA疫苗肌內(nèi)注射后均可在體內(nèi)表達，MPT64DNA疫苗誘導的抗體水平最高。但與IL-12或IFN-γ質(zhì)粒DNA同時免疫時，抗體水平無明顯增加，證明MPT64DNA疫苗與細胞因子共刺激后，細胞因子可降低小鼠對其疫苗的抗原特異性抗體反應，而轉(zhuǎn)為以誘導細胞免疫為主。

3.5PstS編碼基因Mtb磷酸鹽特異轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(phosphate-specific transport system，PstS)包括3個磷酸鹽結(jié)合蛋白,分別稱為PstS-1(也稱為蛋白抗原b)、PstS-2、PstS-3，PstS 基因所構(gòu)建的DAN疫苗免疫小鼠后可產(chǎn)生特異性的抗體和誘導TH1型細胞免疫應答，產(chǎn)生IL-12及IFN-γ等，其中PstS-1 DNA疫苗免疫不能激發(fā)細胞免疫應答，PstS-3 DNA免疫可產(chǎn)生較高水平的免疫應答，接受H37Rv強毒株攻擊后，脾、肺菌數(shù)量明顯減少，PstS-2 DNA免疫產(chǎn)生的免疫水平介于中間[29]。

3.6RD1區(qū)優(yōu)勢抗原ESAT6、CFP10編碼基因BCG缺失的RD1區(qū)，僅存在于致病性分枝桿菌和一些非典型分枝桿菌。RD1區(qū)同一操縱子的ORFs Rv3875和Rv3874分別編碼的ESAT6和CFP10，是RD1區(qū)核心抗原，可誘導T細胞，PBMC、NK及TB患者PBMCs產(chǎn)生強烈的IFN-γ[30]，具有良好的抗原性，而全部BCG都缺失這兩種蛋白，使其成為當今TB疫苗研制的熱點候選分子。有研究[31-32]表明，ESAT6和CFP10可使感染Mtb的小鼠體內(nèi)記憶效應T細胞增殖及在感染早期即可產(chǎn)生高水平的IFN-γ。張海等[33]構(gòu)建的Mtb ESAT6-CFP10融合DNA疫苗免疫小鼠后，能誘導產(chǎn)生較強的細胞免疫應答，產(chǎn)生的IFN-γ與對照組BCG相比無明顯差異，可產(chǎn)生較好的免疫效果。WANG等[34]將泛素和ESAT6基因融合，研究發(fā)現(xiàn)，該DNA疫苗顯著增加了細胞免疫應答，提供了較好的保護作用。

4提高TB DNA疫苗免疫效力的策略

眾多研究表明，TB DNA疫苗免疫效力不高，單一Mtb抗原的DNA疫苗的保護效果一般不及BCG，嚴重制約著DNA疫苗的發(fā)展。增強DNA保護效應的方法除了選擇更為有效的保護性抗原和多種抗原聯(lián)合免疫或采用Prime-Boost免疫策略[35](即初次用DNA疫苗免疫，再次用BCG、抗原蛋白或抗結(jié)核藥物加強免疫)等方法外，表達載體與佐劑的選擇以及免疫途徑也至關(guān)重要。

4.1DNA疫苗載體的選擇及優(yōu)化自TB DNA疫苗研究以來，質(zhì)粒作為其研究載體仍然占重要地位。人們通過優(yōu)先選擇具備基因特異性的強啟動子、功能性剪接體和受體位點的內(nèi)含子、特異有效的非甲基化CpG序列以及影響真核生物表達的Kozak序列等的質(zhì)粒[36-39],構(gòu)建優(yōu)化質(zhì)粒載體的DNA疫苗。近年來，隨著載體應用研究的深入，病毒載體以其可在宿主體內(nèi)長期、穩(wěn)定的表達目的基因的優(yōu)勢，成為DNA疫苗表達載體研究的熱點。最新研究[40-41]報道的一種ESAT6新型DNA疫苗，可表達ESAT6T細胞表位的減毒流感病毒A/New Caledonia/20/99株活疫苗可誘導ESAT6的高水平的抗血清抗體滴度，表明病毒樣顆粒作為展示表位載體的有效性和可操作性。目前，病毒性載體的研究主要以腺病毒和痘病毒為主。

慢病毒載體具備能感染分裂期細胞和非分裂期細胞，攜帶的外源基因表達水平高，容納外源目的基因的片段大等優(yōu)點。其中腺病毒具有強有力的免疫原性和佐劑作用，可誘發(fā)CD8+T細胞的細胞免疫反應[42]和特異性的記憶免疫反應，有研究者[43]認為第5型腺病毒用于結(jié)核疫苗的研究具有廣泛性,但5型腺病毒在人群中有高度流行性，感染后的人體易產(chǎn)生中和抗體，削弱流行區(qū)的疫苗效率，而35型是非流行株，用途較為廣泛；痘病毒具有接種一次，就能獲得長期免疫效果的優(yōu)點。目前，已有眾多實驗研究表明用該兩種病毒載體構(gòu)建的TB DNA疫苗的優(yōu)勢性和有效性，如ESAT6的重組腺病毒DNA疫苗，用于感染小鼠的免疫治療，發(fā)現(xiàn)其肺部的細菌數(shù)和病灶的炎癥反應程度減少[44]；以痘病毒為載體的重組Ag85A DNA疫苗目前已進入臨床二期試驗[45]。

此外，病原體與感染宿主在密碼子使用偏嗜性方面的差異可能導致外源性蛋白表達偏低，從而導致DNA疫苗的誘發(fā)免疫效應偏低，這已成為DNA疫苗發(fā)展的重要瓶頸之一。隨著生物技術(shù)手段的發(fā)展，密碼子優(yōu)化技術(shù)為研制有效的TB DNA疫苗提供了新思路。密碼子優(yōu)化是指在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列的前提下，利用序列定點突變或全基因合成的方法，改變保護性抗原基因的稀有密碼子，使之更適合在真核宿主細胞內(nèi)高效表達，刺激宿主產(chǎn)生更強的免疫應答和保護力。在TB疫苗研究中，LAKEY等[46]將Mtb85A、85B及超氧化物歧化酶(SOD)在大腸埃希菌中使用率低的密碼子進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)85B蛋白表達量增加約54倍，85A和SOD蛋白表達量提高4～6倍。KO等[47]對MtbAg85B抗原基因優(yōu)化，構(gòu)建人源化的Ag85BDNA疫苗，體內(nèi)外試驗均提示，優(yōu)化后的Ag85B蛋白表達量顯著提高，且優(yōu)化后hAg85BDNA疫苗可誘導小鼠產(chǎn)生更強的Th1和CTL免疫反應應答，產(chǎn)生更好的保護效應。本實驗室將CFP10和ESAT6基因進行優(yōu)化，構(gòu)建CFP10/PVAX1和ESAT6/PVAX1重組DNA疫苗，通過與優(yōu)化前比較，觀察其免疫效應及保護力是否有所提高。這將是一個有意義的嘗試，目前該研究正在進行之中。

4.2免疫佐劑TB DNA疫苗的使用可以不聯(lián)合佐劑，但合適的佐劑在某種程度上可解決其免疫原性低的問題，提高其免疫效應和保護力，減少疫苗的免疫劑量和免疫次數(shù)。佐劑從最初的鋁鹽佐劑、弗氏佐劑，到各種新型佐劑已取得了迅速的發(fā)展，目前臨床上批準用于人體的佐劑主要是鋁佐劑和MF59兩種。其次，細胞因子IL-2、IL-12、IL-18等可促進TH1反應，在TB DNA疫苗的發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。SHI等[48]將Hsp65基因與人IL-2融合構(gòu)建DNA疫苗，研究顯示對感染Mtb的小鼠具有很好的保護效果。李暉等[49]將Mtb8.4/hIL-12嵌合DNA疫苗免疫小鼠，與BCG和Mtb8.4疫苗相比免疫作用增強。結(jié)核菌DNA中未甲基化的CpG序列一方面可誘導B細胞的增殖分化，同時還可激活T細胞、巨噬細胞等分泌細胞因子，誘發(fā)以TH1為主的體液免疫和細胞免疫應答。

此外，泛素、單磷酰脂(MLA)、IC31以及一些新型的復合佐劑如CAF01、TBD等可誘導有效的細胞免疫應答和免疫保護效應[50-53]。目前作為免疫佐劑熱門研究領域的Toll樣受體(TLR)激動劑，可介導即時的非特異性的抗病原體反應，并能通過相應的信號通路和免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡調(diào)節(jié)特異性免疫反應，發(fā)揮佐劑作用，在疫苗研究中已有所研究[54-55]。隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學中的發(fā)展，納米材料以其具有易于加工修飾、促進功能分子入胞、保護DNA和蛋白質(zhì)等降解，延長在血液的循環(huán)時間等優(yōu)點，作為載體或佐劑在增強抗原免疫原性方面具有巨大的潛力，目前已有相關(guān)納米粒子作為佐劑在DNA疫苗中的一些研究[56-59]。

4.3免疫途徑DNA疫苗的免疫途徑有多種，不同的免疫途徑可影響抗原的吸收和表達，誘導的免疫強度和免疫機制也不同[60]。早期DNA疫苗采用的常規(guī)肌內(nèi)注射法，其骨骼肌細胞攝取DNA后，可長時間持續(xù)表達，且肌肉接種誘發(fā)的免疫以TH1型為主，激活CTL、TH1細胞及產(chǎn)生IgG2a為主的B細胞[61]，但質(zhì)粒DNA注射后，由于肌束膜的影響，僅有1%～2%的肌纖維被轉(zhuǎn)染，大部分DNA未能進入細胞內(nèi)，只留在細胞間隙被降解，攝取量極低。所以，有研究者通過肌內(nèi)注射聯(lián)合體內(nèi)電轉(zhuǎn)染技術(shù)來提高質(zhì)粒DNA的攝取量，增強免疫應答反應。體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(又稱體內(nèi)電穿孔、電轉(zhuǎn)化、電脈沖)是通過脈沖電流增加靶細胞的滲透性，使DNA易透過細胞膜，而不損害靶細胞，解決質(zhì)粒DNA在靈長類動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低的問題。有研究[62]將質(zhì)粒DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射后立即施加方型波電脈沖，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)注射10 μg DNA疫苗加電轉(zhuǎn)染，能誘導出與不加電轉(zhuǎn)染接種100 μg DNA疫苗相似或更強的抗體免疫應答，表明使用電轉(zhuǎn)染技術(shù)可減少DNA疫苗的劑量和成本。

此外，新的免疫途徑如基因槍法、黏膜免疫途徑法、口服納米乳或微針陣列經(jīng)皮免疫途徑等目前處于大量試驗階段，對未來DNA疫苗的發(fā)展具有巨大的潛力。

5結(jié)語

TB DNA疫苗是20世紀90年代發(fā)展起來的新型疫苗，近年來已經(jīng)取得了可喜的進展，其可作為預防性疫苗，也可作為治療性疫苗，被認為在TB防治中占有很大的優(yōu)勢。但同時也存在著一些問題：一是目前TB DNA疫苗的研究主要局限于小鼠和豚鼠模型，很少用靈長類動物模型，所以要想在臨床試驗中取得突破，還有很長的一段路要走；二是疫苗的安全問題，疫苗應用中不良反應的報道越來越多，主要包括免疫抑制、超敏反應及自身免疫等。因此，在日后的DNA疫苗研究進程中，我們要繼續(xù)探求合適的保護抗原和載體，摸索最適宜的免疫策略、途徑以及免疫劑量，充分利用佐劑的作用，將研發(fā)的新型疫苗免疫多種動物模型，進一步研究其保護性免疫機制，建立有效的體內(nèi)和體外疫苗評價模型，同時建立量化的免疫毒理學評價指標[63]。我們相信，隨著DNA疫苗的免疫學機制和免疫策略的深入研究，人類定能克服困難，逐個攻破難題，研制出安全有效、經(jīng)濟合理的DNA疫苗用于TB的預防和治療。

[參考文獻]

[1]Global tuberculosis Control WHO Report(2012)[R].Geneva:WHO,2012.

[2]吳雪瓊.新型結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J].中國防癆雜志,2012,34(3):133.

[3]WOLFF JA,WILLIAMS P,ACSADI G,etal.Direct gene transfer into mouse muscleinvivo[J].Science,1990,247(4949 pt 1):1465.

[4]FLYNN JL,GOLDSTEIN MM,TRIEBOLD KJ,etalMajor histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance toMycobacteriumtuberculosisinfection[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(24):12013.

[5]VAN PINXTEREN LA,CASSIDY JP,SMEDEGAARD BH,etal.Control of latentMycobacteriumtuberculosisinfection is dependent on CD8 T cells[J].Eur J Immunol,2000,30(12):3689.

[6]HOHN H,KORTSIK C,ZEHBE I,etal.MHC class II tetramer guided detection ofMycobacteriumtuberculosis-specific CD4+T cells in peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis[J].Scand J Immunol,2007,65(5):467.

[7]KAUFMANN SHE.Novel tuberculosis vaccination strategies based on under standing the immune response(Foresight )[J].J Intern Med,2010,267(4):337.

[8]聞玉梅.治療性疫苗研究現(xiàn)狀與前景[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2009:1.

[9]OKADA M,KITA Y,KANAMARU N,etal.Novel therapeutic vaccination (granulysin DNA,adenoviral vector/IL-6 related genes) against tuberculosis[J/OL].http://www.fasebj.org/cgi/content/meetin-gabstract /22/2 Meeting Abstracts/491.

[10]梁艷,吳雪瓊,李忠明,等.結(jié)核分枝桿菌 Ag85A/ESAT-6 嵌合型質(zhì)粒DNA 疫苗和抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療小鼠耐藥結(jié)核病的效果研究[J].中國防癆雜志,2007,29(5):382.

[11]梁艷,吳雪瓊,李忠明,等.結(jié)核分枝桿菌 Ag85A DNA疫苗抗結(jié)核作用的研究[J].中國防癆雜志,2012,34(3):181.

[12]OKADA M,KITA Y,NAKAJIMA T,etal.Novel prophylactic and therapeutic vaccine against tuberculosis [J].Vaccine,2009,27(25/26):3267.

[13]CHANGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin 2 fusion gene[J].Tuberculosis,2009,89(1):54.

[14]SCHUCK SD,MUELLER H,KUNITZ F,etal.Identification of T-cell antigens specific for latentMycobacteriumtuberculosisinfection[J].PLoS One,2009,4(5):e5590.

[15]MUELLER H,DETJEN AK,SCHUCK SD,etal.Mycobacteriumtuberculosis-specific CD4+,IFN IFNγ+,and TNFα+multifunctional memory T cells coexpress GM-CSF [J].Cyt Okine，2008,43(2):143.

[16]KAUFMANN SH.Recent findings in immunology give tuberculosis vaccines a new boost[J].Trends Immunol.2005,26(12):660.

[17]KHERA A,SINGH R,SHAKILA H,etal.Elicitation of efficient，protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis[J].Vaccine,2005,23(48/49):5655.

[18]AAGAARD C,HOANG T,DIETRICH J,etal.A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure[J].Nat Med,2011,17(2):189.

[19]ANDERSEN P,ROSENKRANDS I,STRYHN A.Use of one or more polypeptides or their fragments,which are expressed during the latent stage of the mycobacterial infection,and/ or nucleicacids encoding the polypeptides,fora therapeutic vaccine against tuberculosis:WO,2004006952-A2;US,2004057963-A1;AU,2003242504-A1;EP,1523331-A2;AU,2003242504-A8[P/OL].

[20]CHANGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin 2 fusion gene [J].Tuberculosis,2009,89(1):54.

[21]胡方靖,武軍駐.pIHsp65GM的構(gòu)建及其對結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的保護[J].免疫學雜志，2011,27(8):666.

[22]LOWRIE DB,TASCON RE,BONATO VL,etal.Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination[J].Nature,1999,400(6741):269.

[23]史小玲，李暉，鐘森,等.Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗對結(jié)核桿菌的治療作用[J].中華傳染病雜志,2004,22(1):30.

[24]MALIN AS,HUYGEN K,CONTENT J,etal.Vaccinia expression of Mycobacterium tuberculosis-secreted proteins:tissue plasminogen activator signal sequence enhances expression and immunogenicity ofM.tuberculosisAg85[J].Microbes Infect,2000,2(14):1677.

[25]HA SJ,JEON BY,KIM SC,etal.Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice withMycobacteriumtuberculosis[J].Gene Ther,2003,10(18):1592.

[26]LIANG Y,WU X,ZHANG J,etal.The treatment of mice infected with multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosisusing DNA vaccines or in combination with rifampin[J].Vaccine,2008,26(35):4536.

[27]KAMATH AT,FENG CG,MACDONALD M,etal.Differential protective efficacy of DNA vaccine expressing secreted proteins ofMycobacteriumtuberculosis[J].Infect Immunol,1999,67(4):1702.

[28]吳雪瓊,鄭越,徐燕杰,等.不同劑量結(jié)核病DNA疫苗及細胞因子聯(lián)合免疫的研究[J].中國免疫學雜志,2006,22(10):883.

[29]TANGHE A,LEFEVRE P,DENIS O,etal.Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis DNA vaccines encoding putative phosphate transport receptors[J].Immunol,1999,162(2):1113.

[30]KUMAR M,MEENAKSHI N,SUNDARAMURTHI JC,etal.Immune response toMycobacteriumtuberculosisspecific antigen ESAT-6 among south Indian[J].Tuberculosis(Edinb),2010,90(1):60.

[31]ZHANG H,PENG P,MIAO S,etal.Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing an ESAT6-CFP10 fusion protein induces anti-mycobacterial immune responses and protects againstMycobacteriumtuberculosischallenge in mice[J].Scand J Immunol,2010,72(4):349.

[32]WOODWORTH JS,FORTUNE SM,BEHAR SM.Bacterial protein secretion is required for priming of CD8+T cells specific for theMycobacteriumtuberculosisantigen CFP10[J].Infect Immun,2008,76(9):4199.

[33]張海,師長宏，王麗梅,等.表達結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007,28(6):489.

[34]WANG QM,KANG L，WANG XH.Improved cellular response elicited by a ubiquitin-fused Esat6 DNA vaccine againstMycobacteriumtuberculosis[J].Microbiol Immunol,2009,53(7):384.

[35]HUYGEN K.On the use of DNA Vaccines for the prophylaxis of mycobacterial diseases[J].Infect Immun,2003,71(4):1613.

[36]JATHOUL AP,HOLEY JL,GARMORY HS.Efficacy of DNA vaccines expressing the type F botulinum toxin Hc fragment using different promoters[J].Vaccine,2004,22(29/30):3942.

[37]CHINSANGARAM J,BEARD C,MASON PW,etal.Antibody response in mice inculated with DNA expressing foot -and -mouth disease virus capsid proteins[J].J Virol,1998,72 (5):4454.

[38]COBAN C,ISHII KJ,GURSEL M,etal.Effect of plasmid backbone modification by different human CpG motifs on the immunogenicity of DNA vaccine vectors[J].J Leukoc Biol,2005,78(3):647.

[39]KOZAK M.Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6[J].EMBO J,1997,16(9):2482.

[40]KRAMMER F,SCHINKO T,MESSNER P,etal.Influenza virus-like particles as an antigen-carrie-r platform for the ESAT-6 epitope ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Virol Methords,2010,167(1):17.

[41]KANG SM,SONG JM,QUAN FS,etal.Influenza vaccines based on virus-like particles[J].Virus Res,2009,143(2):140.

[42]BANGARI DS,MITTAL SK.Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors [J].Vaccine,2006,24(7):849.

[43]MU J,JEYANATHAN M,SMALL CL,etal.Immunization with a bivalent adenovirus-vectored tuberculosis vaccine provides markedly improved protection over its monovalent counterpart against pulmonary tuberculosis[J].Mol Ther,2009,17(6):1093.

[44]ZABOLOTNYKH NV,VINOGRADOVA TI,STUKOVA MA,etal.The effectiveness of influenza vectors expressing the protective mycobacterial antigen ESAT-6 in the complex therapy of generalized tuberculosis in mice[J].Probl Tuberk Bolezn Legk,2008,(12):30.

[45]SCRIBA TJ,TAMERIS M,MANSOOR N,etal.Modified vaccinia Ankara-expressing Ag85A,a novel tuberculosis vaccine,is safe in adolescents and children,and induces polyfunctional CD4+T cells[J].Eur J Immunol,2010,40(1):279.

[46]LAKEY DL,VOLADRI RK,EDWARDS KM,etal.Enhanced production of recombinantMycobacteriumtuberculosisantigens in Escherichia coli by replacement of low-usage codons[J].Infect Immun,2000,68(1):233.

[47]KO HJ,KO SY，KIM YJ,etal.Optimization of codon usage enhances the immunogenicity of a DNA vaccine encoding mycobacterial antigen Ag85B[J].Infect Immun,2005,73(9):5666.

[48]CHONGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin2 fusion gene[J].Tuberculosis(Edinb),2009,89(1):54.

[49]李暉,李榕,鐘森.結(jié)核病Mtb8.4 /hIL-12嵌合基因疫苗免疫保護效果研究[J].免疫學雜志,2007,23(2):139.

[50]王慶敏,殷明,章建程,等.泛素-結(jié)核抗原融合基因DNA疫苗誘導小鼠較強的細胞免疫應答[J].第二軍醫(yī)大學學報,2007,28(3):261.

[51]AGGER EM,ROSENKRANDS I,OLSEN AW,etal.Protective immunity totuberculosis with Ag85B-E SAT-6 in a synthetic cationic adjuvant system IC31[J].Vaccine,2006,24 (26):5452.

[52]GARCON N,CHOMEZ P,VAN MECHELEN M.Adjuvant Systems in vaccines:concepts,acievements and perspectives [J].Expert Rev Vaccines,2007,6(5):723.

[53]AGGER EM,ROSEN KRANDS I,HANSEN J,etal.Cationic liposomes formulated with syntheic mycobacterial cordfactor(CAF01):a versatile adjuvant for vaccines with different immunological requirements [J].PLoS One,2008,3(9):e3116.

[54]TRIOZZI PL,ALDRICH W,PONNAZHAGAN S.Regulation of the activity of an adeno-associated virus vector cancer vaccine administered with synthetic Toll-like receptor agonists[J].Vaccine,2010,28(50):7837.

[55]VENUGOPAL PG,NUTMAN TB,SEMNANI RT.Activation and regulation of toll-like receptor (TLRs) by helminth parasites[J].Immunol Res,2009,43(1/3):252.

[56]許利耕,陳春英.納米材料作為重大疾病疫苗載體或佐劑的研究進展[J].科學通報，2012,57(25):2341.

[57]XU L,LIU Y,CHEN Z,etal.Surface-engineered gold nanorods:Promising DNA vaccine adjuvant for HIV-1 treatment[J].Nano Lett,2012,12(4):2003.

[58]POWELL TJ,PALATH N,DEROME ME,etal.Synthetic nanoparicle vaccines produced by layer-by-layer assembly of artificial biofilms induce potent protective T-cell and antibody responsesinvivo[J].Vaccine,2011,29(3):558.

[59]蔣青桃,馮旰珠,夏梅,等.結(jié)核桿菌ESAT-6抗原Th1優(yōu)勢表位與FL重組納米疫苗的制備及其特性研究[J].南京醫(yī)科大學學報,2011,31(5):620.

[60]DA′DARA AA,SKELLY PJ,FATAKDAWALA M,etal.Comparative efficacy of the Schistosoma mansoni nucleic acid vaccine,Sm23,following microseeding or gene gun delivery[J].Parasite Immunol,2002,24(4):179.

[61]XU XM,SONG GX,SI JY.Advance in research on DNA vaccine[J].Prog Microbiol Immunol,2002,30(1):65.

[62]宋丹,張穎,黃嘉璐,等.電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合初免后加強免疫策略增強結(jié)核桿菌核酸疫苗免疫原性的研究[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(2):127.

[63]都偉欣,董娜,陳保文,等.結(jié)核病新疫苗的免疫毒理學評價方法研究[J].中國防癆雜志,2012,34(3):138.

(本文編輯姚仁斌)

[文章編號]1000-2200(2016)03-0408-06·綜述·

[收稿日期]2013-12-25

[基金項目]國家自然科學基金項目(30600518/C030112)

[作者簡介]薛玉芹(1985-)，女，碩士研究生.[通信作者] 方強，博士，碩士研究生導師，教授.E-mail：fq333@sohu.com

[中圖法分類號]R 378.91

[文獻標志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.043

[作者單位] 蚌埠醫(yī)學院 病原生物學教研室，感染與免疫安徽省重點實驗室，安徽 蚌埠 233030