任海偉,邢軍梅,劉曉風(fēng),李雪雁,李志忠,范文廣

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

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菊芋渣的組分分析及其酶解糖化條件研究

任海偉,邢軍梅,劉曉風(fēng),李雪雁,李志忠,范文廣

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730050)

探索了菊芋渣酶解糖化制備可發(fā)酵糖的工藝條件。詳細(xì)考查了纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶以不同組合形式(單一或復(fù)合酶水解)進(jìn)行酶解對(duì)其酶解得率的影響,并結(jié)合掃描電鏡(SEM)和X-衍射(XRD)技術(shù)考察酶解前后的菊芋渣結(jié)構(gòu)變化,篩選適宜的酶解方案。結(jié)果表明,菊芋渣中纖維素、半纖維素和淀粉含量分別為22.54%、18.00%、20.49%,總碳水化合物含量高達(dá)61%以上,是制備葡萄糖等可發(fā)酵糖的良好原料。酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,依次添加纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶(方案Ⅰ)的分步水解法酶解得率最高為75.33%,3種酶添加量分別為7200、12000和10000 U/g,酶解時(shí)間依次為3.5、3.5和3.0 h。SEM和XRD表征結(jié)果發(fā)現(xiàn),原先致密的菊芋渣表面微觀結(jié)構(gòu)經(jīng)酶解作用后出現(xiàn)許多孔洞和裂痕,溝壑明顯,且方案Ⅰ的酶解殘?jiān)鄬?duì)結(jié)晶指數(shù)最高,說(shuō)明纖維素結(jié)晶區(qū)也發(fā)生了降解?？傊?菊芋渣中碳水化合物含量豐富,復(fù)合酶解后能制得微生物可發(fā)酵糖,為下游乙醇發(fā)酵奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

菊芋渣,組分分析,酶解,糖化

菊芋(Jerusalemartichoke)為菊科向日葵屬植物,俗稱鬼子姜、洋姜等,是一種以塊莖繁殖,耐低溫、貧瘠和鹽堿,產(chǎn)量較高的可食用作物和能源植物[1]。菊芋塊莖中富含菊糖(也稱菊粉),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為菊芋濕重的10%～20%,干重的80%左右,是加工生產(chǎn)菊粉、低聚果糖和超高果糖漿等多功能食品配料的首選原料[2]。目前國(guó)內(nèi)菊芋原料主要被用來(lái)制作醬菜或泡菜、菊粉加工。與此同時(shí),菊芋作為能源植物進(jìn)行生物乙醇的開發(fā)利用也日益受到人們關(guān)注。國(guó)內(nèi)外開展了大量菊芋塊莖菊糖制乙醇的工作,如先將菊糖酸解或酶解,然后利用酵母或細(xì)菌等具有發(fā)酵能力的菌株進(jìn)行發(fā)酵,或者利用產(chǎn)菊糖酶能力較高的微生物如黑曲霉或脆壁克魯維酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵[3-4]。然而,相對(duì)于菊芋塊莖或菊粉直接生產(chǎn)乙醇而言,將菊芋優(yōu)先用于食品加工(如菊粉提取)、再利用菊粉提取殘?jiān)?菊芋渣)進(jìn)行生物乙醇開發(fā),既能充分體現(xiàn)菊芋原料的食用價(jià)值和能源價(jià)值,又符合“不與人爭(zhēng)糧、不與人爭(zhēng)地”的中國(guó)國(guó)情,也有利于菊芋產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

菊芋渣(Jerusalemartichokeresidue)是菊粉加工提取后的副產(chǎn)物,1 t菊芋塊莖加工后可得菊芋渣650 kg(水分含量約為83%),若不進(jìn)行有效利用會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。菊芋渣富含纖維素、半纖維素和淀粉等碳水化合物,與菊芋秸稈相似[5],是一種廉價(jià)易得的木質(zhì)纖維類生物質(zhì)原料,若能將菊芋渣中所含的碳水化合物組分糖化制成富含可發(fā)酵糖的碳源基質(zhì),并最終用于生物乙醇發(fā)酵,將是有別于菊芋塊莖或菊粉直接生產(chǎn)生物乙醇的一種方法。目前,菊芋渣研究主要集中在動(dòng)物飼料[6]、蛋白提取和抗氧化肽制備[7-8]、果膠提取[9]等方面,本課題組也對(duì)菊芋渣中的膳食纖維、殘?zhí)呛偷鞍椎冉M分進(jìn)行了提取,并分析了蛋白質(zhì)的氨基酸組成和功能特性[10]。但有關(guān)菊芋渣糖化制備可發(fā)酵糖的研究還未見報(bào)道。

鑒此,本文以菊芋渣為原料,以其酶解糖化獲得可發(fā)酵糖為目標(biāo),著重研究纖維素酶、木聚糖酶和淀粉酶等碳水化合物酶對(duì)菊芋渣進(jìn)行酶解糖化的方案優(yōu)化,并利用掃描電鏡(SEM)和X-衍射(XRD)技術(shù)比較菊芋渣酶解前后的結(jié)構(gòu)特征,以期為菊芋渣的糖化和后續(xù)乙醇發(fā)酵奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

表1 三種酶組合的酶解方案Table 1 The combination methods of three enzymes

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋渣 甘肅白銀熙瑞生物工程有限公司提供,自然風(fēng)干后粉碎過(guò)40目篩,備用。

纖維素酶(濾紙酶活1.2×105U/g,廠家推薦最適溫度50 ℃,最適pH4.8)和木聚糖酶(酶活2.0×105U/g,廠家推薦最適溫度50 ℃,最適pH5.0) 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司;淀粉酶(酶活2.0×105U/g,廠家推薦最適溫度60 ℃,最適pH6.0) 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-9200紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;Z-5000火焰原子吸收分光光度計(jì) 日本Hitachi;JSM5600LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;D/MAX-2004粉末X射線衍射儀 日本理學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化成分的測(cè)定 水分測(cè)定參照GB 50093-2010;灰分測(cè)定參照GB 50094-2010;蛋白質(zhì)測(cè)定參照GB 50095-2010;淀粉測(cè)定參照GB/T 5009.9-2008;中性洗滌纖維(NDF)測(cè)定參照GB/T 20806-2006;酸性洗滌纖維(ADF)測(cè)定參照NYT 1459-2007;酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)測(cè)定參照GB/T 20805-2006。纖維素(CL)和半纖維素(HC)由公式計(jì)算而得:CL=ADF-ADL;HC=NDF-ADF[11]。

1.2.2 單種酶的酶解糖化實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取3.00 g菊芋渣樣品三份,以1∶10 (g/mL)料液比加入蒸餾水,調(diào)節(jié)至廠家提供酶的最適溫度和pH,分別加入纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解糖化反應(yīng)。酶解反應(yīng)結(jié)束后,沸水浴滅酶10 min并快速冷卻,然后4000 r/min離心10 min,收集上清液定容至100 mL,分析其總糖濃度并計(jì)算酶解得率?？偺且赃€原糖計(jì),采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。通過(guò)動(dòng)態(tài)分析酶解得率變化確定3種酶的適宜酶解時(shí)間和加酶量。酶解得率按公式(1)計(jì)算:

式(1)

式中:c-總糖濃度(g/mL);v-酶解上清液體積(mL);m-菊芋渣試樣質(zhì)量(g)。

1.2.2.1 纖維素酶的酶解糖化實(shí)驗(yàn) 在50 ℃,pH4.8條件下,分別研究加酶量(1200、2400、3600、4800、6000、7200U/g,加酶量以原料質(zhì)量為基準(zhǔn),下同)和酶解時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3和3.5h)對(duì)纖維素酶酶解菊芋渣的酶解得率影響。

1.2.2.2 木聚糖酶的酶解糖化實(shí)驗(yàn) 在50 ℃,pH5.0條件下,分別研究加酶量(2000、4000、6000、8000、10000、12000U/g)和酶解時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3和3.5h)對(duì)木聚糖酶酶解菊芋渣的酶解得率影響。

1.2.2.3 淀粉酶的酶解糖化實(shí)驗(yàn) 在60 ℃,pH6.0條件下,分別研究加酶量(2000、4000、6000、8000、10000、12000U/g)和酶解時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3和3.5h)對(duì)淀粉酶酶解菊芋渣的酶解得率影響。

1.2.3 復(fù)合酶解方案的篩選 按照1.2.2確定的3種酶最佳酶解時(shí)間和加酶量,如表1所示進(jìn)行多酶組合酶解實(shí)驗(yàn),方法同1.2.2。準(zhǔn)確稱取3.00g菊芋渣樣品,以1∶10 (g/mL)料液比加入蒸餾水,添加酶Ⅰ在相應(yīng)條件下反應(yīng),酶解結(jié)束后沸水浴滅酶,冷卻并調(diào)至酶Ⅱ的最適條件繼續(xù)反應(yīng)。酶Ⅱ反應(yīng)結(jié)束后滅酶再進(jìn)行酶Ⅲ作用,方法同前。比較不同方案的酶解得率,篩選適宜的酶解組合順序。

表2 菊芋渣主要組分分析(以干基計(jì),%)Table 2 Components analysis of Jerusalem artichoke residue(%)

1.3 結(jié)構(gòu)特性分析

1.3.1 掃描電鏡分析 原料和酶解殘?jiān)鬯楹筮^(guò)200目篩,取篩上物用導(dǎo)電膠帶固定在銅臺(tái)上,采用JSM5600LV掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行觀察照相,分析其表觀結(jié)構(gòu)變化。

1.3.2 結(jié)晶度分析 用D/MAX-2004粉末X射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行X-衍射(XRD)分析。X光管為銅靶,掃描范圍5°～90°,取樣間隔為0.02°。采用Segal公式計(jì)算相對(duì)結(jié)晶指數(shù),按公式(2)計(jì)算:

式(2)

式中:CrI-相對(duì)結(jié)晶指數(shù);I002-主結(jié)晶峰002面(2θ=22°)晶格衍射強(qiáng)度;Iam-2θ=18°時(shí)的衍射強(qiáng)度[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菊芋渣的主要組分分析

由表2可知,菊芋渣中淀粉和纖維素含量均高于20%,半纖維素含量約18%,這三種碳水化合物組分的含量之和高達(dá)61%。淀粉是葡萄糖的高聚體;纖維素是由多個(gè)葡萄糖分子組成的大分子多糖,二者完全水解后能得到葡萄糖;半纖維素主要由幾種不同類型的五碳糖(β-D-木糖、α-L-阿拉伯糖)、六碳糖(β-D-葡萄糖、β-D-甘露糖、α-D-半乳糖等)和糠醛酸以糖苷鍵連接形成。根據(jù)酶的專一特性,這些碳水化合物組分經(jīng)相應(yīng)酶降解后能夠得到含有葡萄糖和木糖等單糖的可發(fā)酵糖液,并用作乙醇等生化產(chǎn)品的發(fā)酵基質(zhì)。

2.2 單一種類酶的酶解效果比較

2.2.1 加酶量對(duì)酶解得率的影響 由圖1可知,3種酶的酶解得率均隨著加酶量增加呈快速增加趨勢(shì),達(dá)到一定量后酶解得率增度放緩并趨于恒定。因?yàn)楫?dāng)加酶量較少時(shí)原料與酶的接觸機(jī)率較小,使各種酶的酶解得率較低;當(dāng)加酶量逐漸增加時(shí),酶與底物充分接觸反應(yīng),酶解作用增強(qiáng)。纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶的加酶量分別為7200、12000、10000 U/g時(shí),酶解得率達(dá)到各自最高值,分別為29.51%、18.49%和13.01%。另一方面,纖維素酶的酶解得率始終高于淀粉酶和木聚糖酶,木聚糖的酶解得率最低。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用纖維素酶本身是一種由蛋白酶、淀粉酶、果膠酶和纖維素酶等組成的多酶復(fù)合物,在這種酶復(fù)合體系中一種酶的產(chǎn)物可以成為另一種酶的底物[13],所以纖維素酶的酶解得率較高。而木聚糖酶主要作用于半纖維素,但原料中半纖維素含量相對(duì)較少,且半纖維素的完全水解需要多種酶的協(xié)同作用[14-15],半纖維素自身網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也會(huì)影響其酶解效率。淀粉酶專一水解淀粉,菊芋渣中的纖維素骨架對(duì)淀粉的降解形成了一定的阻礙作用,使其酶解得率偏低。因此,3種酶的酶解得率高低順序依次為纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶,適宜添加量分別為7200、12000和10000 U/g。

圖1 加酶量對(duì)菊芋渣酶解得率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on enzymolysis yield of Jerusalem artichoke residue

2.2.2 時(shí)間對(duì)酶解得率的影響 由圖2可知,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),3種酶的酶解得率逐漸增加,顯著高于酶解前菊芋渣原料中的總糖含量(1.9%),一段時(shí)間后3種酶的酶解得率變化均趨于平緩。纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶分別作用3.5、3.5、3.0 h時(shí)達(dá)到各自酶解得率的最高值,分別為28.65%、16.81%和11.61%,較作用1 h時(shí)的酶解得率分別升高了10.33%、4.49%和3.05%。因?yàn)榉磻?yīng)初期,酶與底物接觸充分,反應(yīng)速度較快,底物被不斷分解;隨著反應(yīng)進(jìn)行,底物濃度逐漸下降,且水解產(chǎn)物也存在反饋抑制作用,導(dǎo)致酶解反應(yīng)放緩。故確定纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶的酶解作用時(shí)間分別為3.5、3.5、3.0 h。

圖2 時(shí)間對(duì)菊芋渣酶解得率的影響Fig.2 Effect of time on enzymolysis yield of Jerusalem artichoke residue

2.3 三種酶不同組合方式對(duì)酶解得率的影響

在篩選獲得單一酶適宜添加量和酶解時(shí)間的基礎(chǔ)上進(jìn)行多酶復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)。由圖3可知,3種酶組合水解的酶解得率明顯高于單種酶作用效果,分別為單一種類酶最大酶解得率的2.55倍(纖維素酶)、4.07倍(淀粉酶)和5.79倍(木聚糖酶),可見纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶3種酶表現(xiàn)出極強(qiáng)的協(xié)同組合效應(yīng)。其中,方案Ⅰ的酶解得率最高(75.33%),方案Ⅱ和Ⅳ次之,方案Ⅲ和Ⅴ之間差異不顯著(p>0.05),3種酶同時(shí)添加效果最差。方案Ⅰ的酶解得率顯著高于其他方案(p<0.05),為最適合底物結(jié)構(gòu)的酶系組成。說(shuō)明纖維素酶先于木聚糖酶作用于原料底物更有利于酶解得率的提高和總糖獲得。在木質(zhì)纖維素原料中,纖維素組成微細(xì)纖維,構(gòu)成纖維細(xì)胞壁的網(wǎng)狀骨架,而半纖維素則填充在纖維和微細(xì)纖維之間[16]。首先添加纖維素酶,可以在分解纖維素的同時(shí)進(jìn)一步破壞難降解的木質(zhì)纖維骨架,增加原料與酶的接觸面積,有利于后續(xù)2種酶對(duì)目標(biāo)組分的作用;而且木聚糖酶的后續(xù)添加降解了底物中的半纖維素,減少了空間位阻,使得纖維素酶更容易吸附作用于纖維素組分[17]。

圖3 三種酶不同組合方案的酶解得率Fig.3 Enzymolysis yield of three enzymazes in different protocols

2.4 菊芋渣在酶解前后掃描電鏡觀察

掃描電鏡是一種常用的木質(zhì)纖維素基質(zhì)表面結(jié)構(gòu)特征顯微觀察的重要技術(shù)手段,具有原位分析樣品的能力,是表面形貌研究上的有力工具,能夠有效提供酶解前后菊芋渣的表面結(jié)構(gòu)信息[18-20]。由圖4可知,菊芋渣原料結(jié)構(gòu)緊密(圖4a),酶解作用后表觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化。其中,Ⅰ法酶解時(shí),菊芋渣表面溝壑最明顯,且出現(xiàn)許多孔洞和裂痕(圖4b),Ⅱ法酶解后斷面開裂,呈光滑薄片狀(圖4c),Ⅲ法酶解后纖維束斷裂面明顯且呈現(xiàn)不規(guī)則溝壑(圖4d),Ⅳ法酶解后結(jié)構(gòu)松散,出現(xiàn)少量大的孔洞(圖4e),Ⅴ法酶解后邊緣呈齒狀(圖4f),Ⅵ法酶解后表面凸起呈絮狀(圖4g),Ⅶ法酶解后纖維束之間的結(jié)合變松弛,呈層層剝離狀(圖4h)。其中,首先加入纖維素酶的方案Ⅰ和Ⅱ破壞程度最大,這可能是因?yàn)槔w維素酶首先破壞了木質(zhì)纖維緊密結(jié)構(gòu),使淀粉酶和木聚糖酶能更好地與底物中目標(biāo)組分接觸反應(yīng)[21-22]。

圖4 菊芋渣酶解前后掃描電鏡圖(×2000倍)Fig.4 SEM micrograph of Jerusalem artichoke residue before and after enzymatic hydrolysis(×2000)

2.5 X-衍射分析

纖維素分子內(nèi)及分子間的強(qiáng)大氫鍵網(wǎng)絡(luò)使纖維素分子具有高度規(guī)則的結(jié)晶結(jié)構(gòu),酶解前后的XRD結(jié)果如圖5所示,菊芋渣纖維素在2θ=22°左右有衍射峰,酶解后的晶型結(jié)構(gòu)也未發(fā)生改變,僅峰尖形和峰強(qiáng)度出現(xiàn)不同程度地改變。7種酶解方案對(duì)應(yīng)的CrI也差異明顯。由表3可知,方案Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ酶解殘?jiān)腃rI均有提高,且方案Ⅰ提高幅度最大,而方案Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ酶解后的CrI顯著降低。由于方案Ⅰ酶解得率最高,使得纖維素?zé)o定形區(qū)及結(jié)晶區(qū)表面溶出降解,其無(wú)定形區(qū)酶解更充分,將結(jié)晶區(qū)核心部位暴露,使其吸收強(qiáng)度增大。而方案Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的酶解效率較低,還有大量無(wú)定形區(qū)未被降解,導(dǎo)致纖維素結(jié)晶區(qū)未能充分暴露。酶解過(guò)程中,結(jié)晶區(qū)向無(wú)定形區(qū)的轉(zhuǎn)化也會(huì)使CrI減小[23]。

表3 菊芋渣纖維素在酶解前后的相對(duì)結(jié)晶指數(shù)變化Table 3 Changes of crystallinity index(CrI)before and after enzymatic hydrolysis

圖5 菊芋渣酶解前后的X射線衍射圖Fig.5 XRD map analysis of Jerusalem artichoke residue before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié)論

菊芋渣富含纖維素、半纖維素和淀粉等組分,碳水化合物組分含量豐富,含量高達(dá)61%左右。采用依次添加纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶(方案Ⅰ)的多酶組合分步水解法,能獲得較高的酶解得率(75.33%)。SEM結(jié)果顯示酶解前后的菊芋渣表觀結(jié)構(gòu)變化明顯,菊芋渣經(jīng)酶解作用后出現(xiàn)許多孔洞和裂痕。XRD譜圖和CrI說(shuō)明方案Ⅰ中的纖維素組分被充分降解。因此,推薦方案Ⅰ作為菊芋渣酶解糖化制備可發(fā)酵糖的酶解條件。

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Composition analysis and enzymatic hydrolysis saccharification ofJerusalemartichokeresidues

REN Hai-wei,XING Jun-mei,LIU Xiao-feng,LI Xue-yan,LI Zhi-zhong,FAN Wen-guang

(School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

TheenzymaticsaccharificationconditionsoffermentablesugarsproductionwerestudiedtoutilizetheJerusalem artichokeresidues(JAR)effectively.Theeffectsofcombiningformsforcellulase,amylaseandxylanaseonenzymolysisyieldwerestudiedonthebasisofcomponentsanalysis,andtheoptimumenzymaticconditionswereselected.Thestructuralcharacteristicschangeswerestudiedbyscanningelectronmicroscopy(SEM)andX-diffraction(XRD).Theresultsshowedthatthecontentofcellulose,hemicellulose,andstarchwere22.54%,18.00%and20.49%,respectively.Thetotalcarbohydratescontentwerereachedupto61%inJAR,whichbeneficialtopreparethefermentablesugarsuchasglucose.Theresultsofenzymatichydrolysisshowedthattheenzymolysisyieldofmultipleenzymehydrolysis(cellulose,amylaseandxylanase,successively)werehigherthansoleenzymehydrolysis.Thedosageofthreeenzymeswas7200U/g,12000U/gand10000U/g,respectively.Theenzymolysistimeofthreeenzymeswas3.5h,3.5hand3.0h,respectively.Underthiscondition,theenzymolysisyieldwasreachedto75.33%.TheresultsofSEMandXRDindicatedthattheoriginalcompactstructureofJARwaschangedtoporousafterenzymolysis,andtheravinesonsurfacewereobvious.TherelativecrystallizationindexofsechemeⅠwasthehighestandthecrystalstructureofcellulosewasdegradedsufficiently,comparedwiththeothersechemes(Ⅱ～Ⅶ).Inconclusion,thetotalcarbohydratescontentwererichinJAR,andfermentablesugarscanbeobtainedafterenzymecompositehydrolysis,whichwouldlaythefoundationfortheethanolfermentation.

Jerusalem artichokeresidues(JAR);componentsanalysis;enzymatichydrolysis;saccharification

2016-05-10

任海偉(1983-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化利用，E-mail:rhw52571119@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(51366009，51666010)；甘肅省自然科學(xué)基金(1506RJYA106,1508RJYA097)；甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目(2014A-030)；蘭州市科技局項(xiàng)目(2014-2-20)；蘭州理工大學(xué)紅柳青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(Q201207)。

TS249.9

A

1002-0306(2016)21-0139-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.21.019