王建華，陳小金，肖　妍，王玉玲，譚旭菲，趙　丹，張俊哲，陳本龍，王乃福，董志珍，趙祥平（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津　300456）

A型豬流感病毒TaqMan探針熒光RT-PCR檢測方法的建立

王建華，陳小金，肖妍，王玉玲，譚旭菲，趙丹，張俊哲，陳本龍，王乃福，董志珍，趙祥平
（天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300456）

根據(jù)A型豬流感病毒（SIV）的基質蛋白（M）編碼基因保守序列設計合成一對特異性引物和一條TaqMan探針，建立了一種檢測A型SIV的熒光RT-PCR方法。結果顯示，該方法對H1N1、H3N2和H9N2亞型SIV均呈特異性擴增，對豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒等豬的其他常見病毒無交叉擴增反應；該方法對M基因RNA對照（SIV-M-RNA）的最適線性檢測范圍為3.8×101～3.8×108拷貝數(shù)/反應，標準曲線方程為Y= -3.4365X+40.091，相關系數(shù)（R2）為0. 999 8，最低檢出限為38個拷貝數(shù)的SIV-M-RNA。對3個不同濃度（3.8×103～3.8×105copies /μL）的SIV-M-RNA進行組間和組內重復試驗，每個濃度的Ct值變異系數(shù)均小于1.5%，具有良好的重現(xiàn)性。用該方法對860份進口豬的鼻拭子樣本和78份國內豬場豬鼻拭子樣本進行SIV檢測，結果進口豬鼻拭子樣本的SIV檢測均為陰性，17份國內豬場豬鼻拭子樣本SIV檢測為陽性。本研究提供了一種快速、敏感和特異的A型豬流感病毒檢測方法。

A型豬流感病毒；TaqMan探針；熒光RT-PCR

豬流感（Swine Influenza，SI）是由正粘病毒科A型流感病毒（SIV）引起的一種急性、高度傳染性的豬呼吸道疾病[1]。豬群單一發(fā)病時，發(fā)病率高，但死亡率低，通常5～7天后快速康復但如果與豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）、豬圓環(huán)病毒?。≒CV）、豬傳染性胸膜肺炎（APP）和豬支原體肺炎（MH）等病原混合或繼發(fā)感染時，死亡率就會升高，導致經(jīng)濟損失增大[2]。目前SI為我國規(guī)模化養(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的群發(fā)性疾病[3-5]。近年來SIV引發(fā)的流感病毒進化與公共衛(wèi)生安全問題已受到國內外研究者的普遍關注，豬作為流感病毒的“混合器”在流感病毒新毒株的產生及跨種屬障礙感染新宿主的過程中起著重要作用[6]。對SIV要做出準確診斷，需要借助實驗室方法。由于目前診斷SIV的常規(guī)方法存在操作繁瑣和診斷周期長等不足[7]，近年來實時熒光定量PCR技術已用于SIV核酸的檢測[8-9]。本研究基于保守的M基因建立了一種檢測A型豬流感病毒的通用型TaqMan探針熒光RTPCR檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒核酸及臨床樣本。H1N1、H3N2和H9N2亞型豬流感病毒核酸，H5N1禽流感病毒核酸，豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒核酸，由天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心動物檢疫實驗室保存。938份豬鼻拭子樣本，2012—2015年保存，其中860份鼻拭子樣品來自美國和丹麥進口豬，78份鼻拭子樣品來自國內疑似發(fā)病豬。

1.1.2主要儀器與試劑。Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）、5417R EPPENDORF冷凍離心機、ESCO CLASS ⅡBSC生物安全柜、TRIzol? LS Reagent，購自Invetrogent公司；TaKaRa ExTaqRDNA 聚合酶、PstI限制性內切酶、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購自大連寶生物工程（大連）有限公司；質?？焖偬崛≡噭┖校徸员本┣f盟國際生物基因科技有限公司；Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System、RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購自Promega公司。其他試劑均為國內或進口分析純試劑。

1.2方法

1.2.1設計合成引物及探針。從GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載SIVM基因序列，進行生物學信息分析，選出高度保守且特異的區(qū)域，用Beacon Designer7.0軟件設計特異引物和TaqMan探針，由上海百力格生物技術有限公司合成。5′端用HEX標記，3′端用BHQ1標記，引物和探針序列見表1，預期擴增片段長度為74 bp。

表1　引物與探針序列

1.2.2制備RNA標準對照。根據(jù)SIV M基因序列（KM028202 ）設計4條引物，序列見表2。以SIVM1/SIVM2為模板，SIVMF/SIVMR為引物，按常規(guī)PCR方法擴增。將擴增產物用膠回收試劑盒回收后與PMD18-T克隆載體連接，轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性重組克隆。以經(jīng)PstI酶切線性化的插入SIV M基因靶序列的重組質粒DNA為模板，用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒進行體外轉錄，對體外轉錄產物經(jīng)RQ1 DNA酶消化及純化，即制備成含有靶擴增序列的RNA標準對照，命名為SIV-MRNA。用核酸蛋白分析儀測定SIV-M-RNA的濃度。按相應公式換算出的拷貝數(shù)為3.8×108copies/μL。

表2　用于制備RNA標準對照的寡核酸鏈

1.2.3提取總RNA。按常規(guī)TROZOL試劑方法，分別提取樣本的總RNA，并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4優(yōu)化熒光RT-PCR反應條件。使用One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect RealTime）試劑及其推薦的25 μL反應體系及擴增條件，以3.8×106copies/μL的SIV-M-RNA為模板，在Light Cycler? 480熒光PCR（Rochi）儀上，首先對不同濃度組合的引物和標記探針進行熒光RT-PCR方陣篩選試驗，確定最適引物和探針使用濃度；然后在最適引物和標記探針濃度下，在56～61℃范圍內，篩選最適的退火延伸溫度。

1.2.5繪制標準曲線。將SIV-M-RNA用滅菌去離子水稀釋成3.8×101～3.8×108copies /μL的濃度范圍。每個稀釋度分別取1 μL作為模板，在1.2.4優(yōu)化的反應條件下進行熒光RT-PCR擴增。反應結束后以Ct值為橫坐標、SIV-M-RNA模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6敏感性、重復性和特異性試驗。將SIV-MRNA做10倍系列稀釋。每個稀釋度分別取1 μL作為模板，在1.2.4優(yōu)化的反應條件下進行熒光RT-PCR擴增，確定該方法可以檢出SIV-M-RNA的最低拷貝數(shù)；將3個稀釋度（3.8×103～3.8×107copies /μL）的SIV-M-RNA為模板，按1.2.4優(yōu)化的反應條件，分別進行組內和組間重復試驗，確定該方法的可重復性；以SIV、CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA為模板，按1.2.4優(yōu)化的反應條件，進行熒光RT-PCR擴增，同時設陰性對照，確定該方法的特異性。

1.2.7臨床樣本檢測。對2012—2015年期間保存的938份豬鼻拭子樣本，采用本研究建立的實時熒光RT-PCR方法進行SIV核酸檢測，評價該方法的實用性。當Ct值小于37時判定為陽性，Ct值在37～40之間的判定為可疑；如重復試驗結果的Ct值仍在37～40之間時判定為陰性，無Ct值時判定為陰性。

2　結果

2.1熒光RT-PCR反應優(yōu)化條件

通過對不同濃度的引物和標記探針組合以及退火延伸溫度的篩選試驗，最后確定最適熒光RTPCR擴增條件為：在25 μL反應體系中，依次加入2×One Step RT-PCR bufferⅢ 12.5 μL，TaKaRa Ex TaqHS（5U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.5 μL，SIV-M-F（10.0 pmmol/μL）SIV-M-R（10.0 pmmol/μL）和SIV-M-P（4.0 pmmol/μL）各0.5 μL，SIV-M-RNA（×106copies /μL）模板1 μL，補足純水至25 μL。反應參數(shù)為42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，然后95 ℃ 10 sec，60 ℃ 30 sec，45個循環(huán)。在每一次循環(huán)60 ℃退火結束前，采集HEX通道的熒光信號。在該優(yōu)化熒光RT-PCR反應條件下，可獲得典型的S型擴增曲線（圖1）。

圖1　SIV-M-RNA（3.8×106copies /μL）的實時熒光RT-PCR動力學曲線

2.2標準曲線

以3.8×101～3.8×108copies /μL的RNA標準對照為擴增模板，按優(yōu)化反應條件進行熒光RT-PCR反應，擴增曲線見圖2-A；以起始模板濃度的對數(shù)為X軸，Ct 值為Y軸繪制成的標準曲線見圖2-B。Ct 值與RNA標準對照拷貝數(shù)之間的線性關系表達式為Y= -3.4365X+40.091，相關系數(shù)（R2）為0. 999 8，呈現(xiàn)良好的線性關系。

圖2　SIV-M-RNA實時熒光RT-PCR擴增曲線（A）和標準曲線（B）

2.3敏感性試驗

對不同稀釋度的RNA標準對照，按優(yōu)化后的反應條件進行熒光RT-PCR反應，擴增曲線見圖2。由圖2可知該方法最低可檢出個38拷貝的RNA標準對照分子。

2.4重復性試驗

選取3個濃度的RNA標準對照為模板，按優(yōu)化的反應條件進行組內和組間重復試驗。每個稀釋度的Ct值和標準差（SD）及變異系數(shù)（CV）見表3。3個濃度的RNA標準對照的Ct值變異系數(shù)均小于1.0%，表明本試驗所建立的熒光RT-PCR檢測體系穩(wěn)定，具有良好的重復性。

表3　實時熒光RT-PCR重復性試驗結果

2.5特異性試驗

以SIV、CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA為模板進行熒光RT-PCR擴增，擴增結果見圖3。由圖3可知，H1N1和H3N2亞型的SIV均呈特異性擴增，而CSFV、PRRSV、PEDV和TGEV的基因組RNA均無擴增曲線出現(xiàn)，表明該方法檢測SIV核酸有良好的特異性。

圖3　熒光RT-PCR檢測SIV的特異性

2.6臨床樣本檢測

用該方法對2012—2015年保存的860份進口豬的鼻拭子樣本和78份國內豬場豬鼻拭子樣本進行SIV檢測，結果見表4。由表4可知，860份進口豬鼻拭子樣本的SIV檢測結果均為陰性，在78份國內豬場豬鼻拭子樣本中有17份為SIV檢測結果陽性。

表4　938份實際樣本的SIV實時熒光RT-PCR檢測結果

3　討論

一些研究表明，SIV作為一種豬呼吸道疾病綜合癥的原發(fā)性病原，在破壞豬呼吸道上皮的防御屏障后，極易使豬合并PRRSV、PCV2、肺炎支原體和胸膜肺炎放線桿菌感染或繼發(fā)感染，從而導致呼吸道病程的延長和死亡率的增高，對豬群危害極大[2]。因此，對豬群SIV感染的監(jiān)測可為調查豬呼吸道疾病綜合癥的病因及制定控制措施提供重要的病原學依據(jù)。此外，SIV不僅危害豬群，而且同時具有感染人和禽的潛力[6]，因此SIV的檢測具有重要的公共衛(wèi)生意義。與傳統(tǒng)的檢測SIV方法相比，熒光RT-PCR檢測SIV核酸技術具有快速而敏感的優(yōu)勢。目前國內研究人員已報道了多種檢測SIV的熒光RT-PCR方法[8-9]。本試驗建立的這種基于TaqMan 探針的通用型SIV熒光RT-PCR 檢測方法具有良好的特異性，并顯示出良好的定量線性關系和重復性。通過對860份進口豬的鼻拭子樣本和78份國內豬場豬鼻拭子樣本的SIV檢測，結果表明本研究建立的通用型SIV熒光RT-PCR檢測方法可用于臨床中SIV的檢測。

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Development of a Real-time RT-PCR Assay with TaqMan Probe for Detecting Swine Influenza A Virus

Wang Jianhua，Chen Xiaojin，Xiao Yan，Wang Yuling，Tan Xufei，Zhao Dan，Zhang Junzhe，Chen Benlong，Wang Naifu，Dong Zhizhen，Zhao Xiaoping
（Animals and Plants and Food Inspection Center of Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin300456）

A Taqman probe-based real-time RT-PCR was developed with a pair of primers and a probe designed according to the conserved region of M gene sequence of swine influenza A virus （SIV）. Results showed the assay was specific to detect subtype H1N1，H3N2 and H9N2 of swine influenza A virus and had no cross-reaction with classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）and transmissible gastroenteritis virus（TGEV）. The real-time RT-PCR assay has a broad linear detection range for RNA standard control of M gene of SIV（SIV-M-RNA）from 3.8×101copies/μL to 3.8×108copies/μL，the standard curve equation was Y= -3.4365X+40.091，and the correlation coefficient of the assay was 0.999 8. This assay could detect 38 copies/μL of SIV-M-RNA at the lowest level. Three different concentrations of SIV-M-RNA were used to test the repeatability，and the coefficients of variation（CVs）of both inter-assay and intra-assay were less than 1.5%，showing good repeatability. 938 nasal swab samples were tested for SIV detection by the assay. No positivereaction was found for all 860 samples from imported pigs. 17 of 78 samples from domestic pigs were found to be positive for SIV detection. These results suggested that the newly established real-time RT-PCR would provide a rapid，sensitive and specific detection for swine influenza A virus.

swine influenza A virus；TaqMan probe；real-time RT-PCR

S852.65

B

1005-944X（2016）12-0085-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.023

天津市科技支撐項目（13ZCZDNCO1300）；天津市濱海新區(qū)惠民項目（2013-BK15H013）

（責任編輯：朱迪國）