李　印，張美晶，沈朝建，孫向東，康京麗，黃保續(xù)，王幼明（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島　266032）

抗體監(jiān)測抽樣數(shù)量及結(jié)果判定的有關(guān)討論與演算

李印，張美晶，沈朝建，孫向東，康京麗，黃保續(xù)，王幼明
（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

為詳細闡述抗體監(jiān)測中抽樣數(shù)量及合格群體判定標準等問題，進而為相關(guān)人員提供科學(xué)參考，本文對相關(guān)流行病學(xué)原理進行了介紹，對國內(nèi)在免疫后抗體監(jiān)測中抽樣數(shù)量及結(jié)果判定等方面存在的爭議進行了系統(tǒng)分析，并通過計算給出了不同規(guī)模場戶評價免疫合格率時的抽樣量及結(jié)果判定方法。分析結(jié)果證實了目前我國在免疫抗體監(jiān)測中存在不足，并說明了為何不應(yīng)固守“70%抗體免疫合格率”這一指標的理由。這些結(jié)果為進一步改進動物免疫后的抗體監(jiān)測提供了借鑒。

獸醫(yī)流行病學(xué)；抗體監(jiān)測；抽樣；群體免疫；傳染病動力學(xué)；

疫苗免疫是防治動物疫病的重要手段。我國自2001年開始，在每年春秋兩季集中對部分重大動物疫病實施強制免疫。目前我國實行強制免疫的動物疫病有高致病性禽流感、口蹄疫、豬瘟、布魯氏菌病和高致病性藍耳病等[1]。

為了解免疫效果，通常在免疫一定時間后，采集動物血清進行抗體檢測。通過抗體檢測，評價個體抗體合格率，并評價群體抗體水平。除此之外，抗體監(jiān)測還可以評價不同疫苗的免疫效果。因此科學(xué)合理的采樣及結(jié)果分析是實現(xiàn)這些目的的基礎(chǔ)。

在具體工作實踐中，很多人對抗體監(jiān)測中抽樣數(shù)量及合格群體判定標準等問題認識不清。本文介紹了相關(guān)流行病學(xué)原理，系統(tǒng)剖析了國內(nèi)在免疫后抗體監(jiān)測中抽樣數(shù)量及結(jié)果判定等方面存在的爭議，并通過計算給出了不同規(guī)模場戶評價免疫合格率時的抽樣量及結(jié)果判定方法。

1　免疫后抗體監(jiān)測抽樣量的爭議：太多還是太少？

我國目前通常采取每個場戶抽取30頭/只動物血清，以其中抗體合格個體占比是否超過70%（即21個）作為該群體是否為免疫合格場戶的判定標準。其中有兩個問題經(jīng)常引起爭議：一是30個樣本是否合適？二是為什么群體免疫合格的閾值定為70%？關(guān)于這兩個問題，需要首先了解抽樣量計算及群體免疫的原理。

1.1發(fā)現(xiàn)疫病或證明無疫的抽樣量計算

現(xiàn)實工作中，往往需要通過抽樣檢測來確定一個場群內(nèi)是否有無某種疫病。通過抽樣來發(fā)現(xiàn)疫病，需要設(shè)定兩個指標：一是置信水平，即對結(jié)果的把握度，一般設(shè)定為95%；二是該病可能的最低流行率，即該病在群體中可能的最小流行率。此時所需最小抽樣量計算公式為：

其中：n為抽樣個數(shù)；CL為置信水平；N為群內(nèi)個體數(shù)；D為群中的陽性動物數(shù)，即D=N×p，p為預(yù)設(shè)的最低流行率[2]。如果一個雞場內(nèi)存在新城疫變異株流行的話，它最低的可能流行率也不會低于10%，此時，依據(jù)該公式計算樣本量為：

為了簡便，此處默認為群體大小為1 000只，規(guī)模較小時，需要對樣本量進行調(diào)整；如無特殊說明，本文默認檢測方法的敏感性及特異性均為100%（下同）。

這里的含義是指如果該群體中存在某種疾病，那么抽取28只檢測，有95%的把握至少檢測到1只感染動物。需要注意的是，這是以發(fā)現(xiàn)疫病或證明無疫為目的的抽樣量，并且是基于該疫病最低流行率為10%的假設(shè)之上。這些假設(shè)并非對所有的疫病都合適。現(xiàn)實工作中，往往需要同時采集病原樣本和血清樣本。其中病原學(xué)采樣的目的往往是發(fā)現(xiàn)疫病，但采集血清的目的卻往往是評估抗體合格率是否達到70%。30只的抽樣量對于病原學(xué)采樣可能是合適的（如果一個疫病群內(nèi)流行率通常高于10%），但是對于評價抗體合格率，則可能存在估計精度不足。但在現(xiàn)實工作中，為了操作便利，采樣人員往往選取30頭/只動物，同時采集病原學(xué)樣品和血清學(xué)樣品。這就是抗體監(jiān)測時通常采樣量為30頭/只的原因。

1.2評估流行率的抽樣量計算

有時候需要通過抽樣估計某種疫病在一個群體中的流行率或者群內(nèi)的抗體合格率，這時要首先確定幾個指標：一是預(yù)計該病在群內(nèi)的可能流行率，即該病在群體內(nèi)最可能的流行率；二是置信水平，一般設(shè)為95%；三是需要估計的精度，即可接受的誤差大小。此時的抽樣量計算公式為：

其中：p為預(yù)期流行率；z為來自正態(tài)分布1-α/2百分位點對應(yīng)的統(tǒng)計量。對于每一個置信水平，都有一個相應(yīng)的z值。生物學(xué)研究中，常用的置信水平為90%、95%、99%，其對應(yīng)的z值分別是1.64、1.96、2.58。e為可接受的最大絕對誤差[2]。根據(jù)上述公式，推導(dǎo)出根據(jù)抽樣結(jié)果推斷總體流行率的置信區(qū)間為：

1.3每場抽樣30只時群體免疫合格的判定

現(xiàn)實工作中，各級動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)通常從一個場戶中抽取30只動物檢測抗體，以21個動物的抗體達標作為群體是否免疫合格的標準。這一標準是否合理呢？根據(jù)評估流行率的計算公式，如果從一個大型場戶中（如1 000頭/只動物）采集30頭/只動物血清，其中有21個抗體合格，此時該群內(nèi)抗體合格率為：21/30=70%，其95%的置信區(qū)間為：

該結(jié)果說明，95%的置信度情況下，這個場戶內(nèi)抗體合格率介于53%～87%之間，所以該場戶的抗體合格率仍有可能低于70%。再假設(shè)另一種情形：某1000頭豬場內(nèi)個體抗體合格率只有60%，如果隨機抽取30頭檢測抗體，抽到合格動物的數(shù)量會是多少？如果個體抗體合格率只有65%呢？利用Poptool軟件[3]，使用二項分布模擬運算1 000次，得到以上兩種情況下該場戶抽到抗體合格動物數(shù)量的概率分布（圖1）。模擬運算結(jié)果表明，當場內(nèi)個體抗體合格率只有60%時，隨機抽取30頭檢測抗體，有17.3%的概率抽到21個以上的陽性動物；當場內(nèi)個體抗體合格率只有65%時，隨機抽取30頭檢測抗體，則有38.9%的概率抽到21個以上的陽性動物，這種情況發(fā)生的可能性已經(jīng)較高。因此，每場采集30份血清時，以陽性數(shù)量高于21個作為判定免疫合格的標準是不夠嚴謹?shù)摹?/p>

圖1　場內(nèi)個體合格率分別為60%和65%時30份抽樣中陽性個體數(shù)的概率分布

1.4群體免疫理論及傳染病動力學(xué)

通常認為群內(nèi)抗體合格率達到70%以上時，該群體就是一個免疫合格群，就會因抗體保護而對某些疫病具有免疫力。這一說法來源于“群體免疫”這一概念[4-5]。簡單地說，該理論認為如果一個群體內(nèi)具有免疫力的個體達到一定比例，那么即使有病原進入到該群體內(nèi)，也不能引發(fā)疫病流行，該群體就具有了“免疫力”，不會被感染。

70%這一數(shù)字來源于傳染病動力學(xué)有關(guān)數(shù)學(xué)模型模擬計算的結(jié)果。1926年Kermack和McKendrick為了研究1665—1666年黑死病在倫敦的流行規(guī)律，以及1906年瘟疫在孟買的流行規(guī)律，構(gòu)造了著名的SIR倉室模型[6]。該模型的基本思想一直到現(xiàn)在仍然被廣泛使用和不斷發(fā)展，并衍化出許多其它模型。所謂SIR倉室模型就是針對某種傳染病，將一個群體內(nèi)的個體分為三類（即三個倉室）：

易感者（Susceptibles）：其數(shù)量記為S（t），表示t時刻未染病但有可能被該類疾病傳染的個體數(shù)；

感染者（Infectives）：其數(shù)量記為I（t），表示t時刻已經(jīng)染病而且有傳染力的個體數(shù)；

移出者（Removed）：其數(shù)量記為R（t），表示t時刻已經(jīng)從感染者中移出的個體數(shù)。

傳染病流行期間，群體內(nèi)個體不斷在三個倉室中轉(zhuǎn)換。假設(shè)群體總個體數(shù)為N（t），則有N（t）= S（t）+ I（t）+ R（t）。

該模型的建立基于以下三個基本假設(shè)：

一是群體在研究時段內(nèi)為封閉群體。群體中的總個體數(shù)保持穩(wěn)定。群體規(guī)模較大時，可視為其個體數(shù)在一段時間內(nèi)穩(wěn)定；

二是一個感染者與易感者接觸就必然具有一定傳染力。假設(shè)t時刻單位時間內(nèi)，1個感染者能夠傳染的易感者數(shù)量與此環(huán)境內(nèi)易感者總數(shù)S（t）成正比，比例系數(shù)為β，則t時刻單位時間內(nèi)被所有感染者傳染的新病例數(shù)為βS（t）I（t）；

三是t時刻單位時間內(nèi)從感染者中移出的個體數(shù)與感染者數(shù)量成正比，比例系數(shù)為γ，從而單位時間內(nèi)移出者數(shù)量為γI（t）。

該模型經(jīng)過演算，得出一個重要參數(shù)：基本再生數(shù)（R0）。其含義為1個感染者在其整個傳染期內(nèi)通過與易感者有效接觸可以傳染的新病例期望數(shù)。如果R0>1，則1個感染者將會傳染給1個以上的易感者，那么新病例將越來越多，疾病就會流行；如果R0<1，則1個感染者將會傳染給少于1個的易感者，那么新病例將越來越少，疾病流行就會逐漸停止。如果需要在一個地區(qū)消滅某傳染病，需要采用多種措施使得R0<1。

由公式：R0=βS0/γ可知，需要使三個參數(shù)盡量減小，它們各自的含義及相關(guān)影響因素見表1。

根據(jù)表1可知，疫病是否會流行不僅與免疫覆蓋率有關(guān)，而是由多種因素共同決定的。不同的疫病種類、不同的易感動物群體、不同的養(yǎng)殖和交易模式，應(yīng)該會得到不同的免疫合格閾值。甚至在不同地區(qū)對同一種疫病開展強制免疫時，因為養(yǎng)殖密度、動物品種、養(yǎng)殖和交易模式不同，需要達到的場戶免疫合格率也不同。公共衛(wèi)生流行病學(xué)研究方面有類似例子：如相關(guān)研究認為在歐洲消滅麻疹和風(fēng)疹需要在人群中的免疫密度分別達到96%～99%以上和87%～99%以上[7]；麻疹在美國城鎮(zhèn)地區(qū)的R0為8.3到13.0，免疫密度要達到88%～92.3%以上才能消滅，而在英國麻疹的R0為12.5到16.3，免疫密度要達到92.9%～94%以上才能消滅[6]。

綜上，70%的免疫合格率不可能適用于所有疫病和所有地區(qū)，應(yīng)該根據(jù)不同疫病在不同地區(qū)的特定流行病學(xué)特征，確定不同的免疫合格率要求。

表1　傳染病基本再生數(shù)相關(guān)影響因素

2　抗體監(jiān)測抽樣數(shù)量及判定標準

日常工作中，對某一個場戶的動物免疫過后，往往需要抽樣檢測，評價個體抗體合格率是否達到一定比例，比如70%。此時，應(yīng)該抽多少動物檢測，并且對于檢測結(jié)果如何解讀呢？解答這一問題涉及概率分布中的二項分布、負二項分布和超幾何分布等數(shù)學(xué)理論，相關(guān)概率分布過于復(fù)雜，在此不做交代。利用Freecalc軟件中“證明無疫抽樣模塊”（Free from disease）[8]，計算不同情境下所需要的抽樣量，并解讀各種情況下的結(jié)果判定。為了簡化，下面的計算有如下假設(shè)：一是群內(nèi)抽樣是以完全隨機方式抽?。欢浅闃拥闹眯潘胶托Ф染O(shè)為95%；三是當抽樣檢測為完美試驗時，總的敏感性和特異性均設(shè)為100%，當不完美抽樣檢測總的敏感性設(shè)為90%，特異性設(shè)為90%，但實際情況中不同疫病的抽樣檢測方法總的特異性和敏感性各不相同。

2.1針對小群體抗體監(jiān)測的抽樣

當在小群體中抽樣時，經(jīng)常遇到抽樣比例超過10%的情況，此時抽樣概率分布應(yīng)使用超幾何分布進行計算。注意，在部分情況下抽樣比例雖然并沒有超過10%，但因接近10%，此時無論按照超幾何分布計算，還是按照二項分布計算，結(jié)果都相近。為了簡化，將這些情形按照同一種分布計算，一并放在同一張表內(nèi)。

2.1.1當抽樣檢測為完美試驗時的抽樣量及結(jié)果解讀。抽樣數(shù)量及結(jié)果判定見表2。從表2可以看出，隨著群體規(guī)模增加，需要抽樣量從1逐漸增加到9，而且所有檢測個體均為抗體陽性時，則有95%以上把握認為該場內(nèi)抗體合格率高于70%。

2.1.2當抽樣檢測為不完美試驗時的抽樣量及結(jié)果解讀。抽樣數(shù)量及結(jié)果判定見表3。從表3可以看出，隨著群體規(guī)模增加，需要抽樣量從1逐漸增加到32，而且當檢測結(jié)果中抗體陰性個體數(shù)小于某個值時，則有95%以上把握認為該場內(nèi)抗體合格率高于70%。例如群體大小為101頭時，需要采樣31頭，當抗體陰性頭數(shù)小于6頭，也就是抗體陽性數(shù)高于25頭以上時，可以有95%以上把握認為該場內(nèi)抗體合格率高于70%。

2.2針對大群體抗體監(jiān)測的抽樣

當在大群體中抽樣時，抽樣比例不超過10%，此時抽樣概率分布應(yīng)使用二項分布進行計算。

2.2.1當抽樣檢測為完美試驗時的抽樣量及結(jié)果解讀。抽樣數(shù)量及結(jié)果判定見表4。從表4可以看出，群體規(guī)模在100頭以上時，需要抽樣量為9，當所有檢測個體均為抗體陽性時，則有95%以上把握認為該場內(nèi)抗體合格率高于70%。

2.2.2當抽樣檢測為不完美試驗時的抽樣量及結(jié)果解讀。抽樣數(shù)量及結(jié)果判定見表5。從表5可以看出，群體規(guī)模在200頭以上時，需要抽樣量為32，而檢測陰性數(shù)少于6個，也就是陽性數(shù)量在26個以上時，則有95%以上把握認為該場內(nèi)抗體合格率高于70%。

表2　對小群體使用完美檢測方法時所需抽樣量及結(jié)果判定

表3　對小群體使用不完美檢測方法時所需抽樣量及結(jié)果判定

3　討論

目前我國對幾種重大動物動物疫病實行強制免疫政策，而免疫后抗體監(jiān)測通常被用來作為官方疫病控制部門免疫工作效果考核的重要指標。然而在生產(chǎn)實踐中，抗體合格率除了受實際免疫的覆蓋范圍影響以外，還受其它多種因素影響。比如，疫苗的質(zhì)量是否過關(guān)、疫苗運輸儲存的方式是否恰當、免疫動物的身體狀況是否良好、抗體監(jiān)測時采樣是否合理以及血清是否正確處理和冷藏等。因此，在進行抗體監(jiān)測的同時，應(yīng)該收集必要的基礎(chǔ)信息，進行必要的分析?？贵w效價的評價不僅僅可以得到一個數(shù)值，更重要的是利用這個數(shù)值，分析免疫失敗的原因，進一步改進免疫工作。這也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）和國際糧農(nóng)組織（FAO）所倡導(dǎo)的[9]。

本文通過對群體免疫理論及傳染病傳播動力學(xué)模型的介紹，分析了影響抗體合格率閾值大小的相關(guān)因素。根據(jù)傳染病動力學(xué)原理，防止疫病流行所需要達到的免疫合格率水平受到多種因素的影響。我國地域廣闊，不同地區(qū)的養(yǎng)殖方式和交易模式可能差別較大，而且不同規(guī)模場戶交易頻次和交易模式也不同，這些因素都可能導(dǎo)致相應(yīng)要達到的免疫合格率不同。這也說明免疫不是控制疫病的唯一手段。此外，也可以通過制定政策，如引導(dǎo)交易前檢疫、鼓勵疫病凈化等方式，減小感染場戶與非感染場戶的有效接觸。需要說明的是，我國獸醫(yī)流行病學(xué)剛剛起步，對于某種疫病流行病學(xué)參數(shù)的研究還很缺乏。例如：某地區(qū)某種動物養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)如何？不同類型場戶地理上分布有何特點？不同類型的場戶間動物交易模式？場戶間交易頻率是多少？建議進一步開展現(xiàn)場流行病學(xué)研究，探索不同地區(qū)養(yǎng)殖交易模式下的不同疫病傳播模式，為當?shù)刂贫茖W(xué)合理的免疫策略提供基礎(chǔ)。

表4　對大群體使用完美檢測方法時所需抽樣量及結(jié)果判定

表5　對大群體使用不完美檢測方法時所需抽樣量及結(jié)果判定

[1]農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局. 2015年重大動物疫病強制免疫方案[A].北京：農(nóng)業(yè)部，2015.

[2] 沈朝建，王幼明.獸醫(yī)流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測：抽樣技術(shù)手冊[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[3] Hood G M. PopTools version 3.2.5. Available on the internet [Z/OL].（2011-09-22）[2016-06-30]. http://www.poptools.org.

[4] Fine P，Eames K， Heymann D L. “Herd immunity”：a rough guide，Clinical infectious diseases：an official publication of the Infectious Diseases[J]. Society of America，2011，52：911-916.

[5] Plans-Rubio P. The vaccination coverage required to establish herd immunity against influenza viruses[J]. Preventive medicine，2012，55：72-77.

[6] 馬知恩，周義倉，王穩(wěn)地，等. 傳染病動力學(xué)的數(shù)學(xué)建模與研究[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2004.

[7] Plans-RubioP.Is the current prevention strategy based on vaccination coverage and epidemiological surveillance sufficient to achieve measles and rubella elimination in Europe? [J]. Expert review of anti-infective therapy，2014，12：723-726.

[8] A.A.H. Services.Survey Toolbox for Livestock Diseases-A practical manual and software package for active surveillance of livestock diseases in developing countries[Z/OL][2016-06-30]. https://www.ausvet.com.au/.

[9] Food and Agriculture Organization of the United Nations（FAO）& World Organisation for Animal Health（OIE）. The Global Strategy for the Control and Eradication of PPR[Z]. Paris：FAO/OIE，2015.

（責任編輯：朱迪國）

Discussion and Calculation：Sampling Size and Interpretation of the Results in Serosurveillance

Li Yin，Zhang Meijing，Shen Chaojian，Sun Xiangdong，Kang Jingli，Huang Baoxu，Wang Youming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong266032）

In order to illuminate how to decide the sampling size and interpret the testing results during conducting antibody surveillance，so as to provide reference for practitioners，relevant epidemiological principles were introduced and debates about sampling size and result interpretation were analyzed and demonstrated systematically. Through necessary calculations，different ways of evaluating the immune qualification rate towards different scale livestock and poultry farms were put forward. The results indicated that the deficiencies of post-vaccination antibody surveillance still existed in China，and evidences on why the “70% coverage rate”was not suitable were given. This discussion and calculation would offer reference on how to further improve post-vaccination antibody surveillance in China.

veterinary epidemiology；serosurveillance；sampling；herd immunity；epidemic dynamics

S851.3

B

1005-944X（2016）12-0069-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.12.020

科技部科技基礎(chǔ)性專項“重要畜禽疫病流行病學(xué)調(diào)查”（2012FY111000）

王幼明