鄭春松，嚴(yán)培晶，付長龍，葉蕻芝，劉獻(xiàn)祥

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350002；

3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

·理論探討·

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探討骨關(guān)節(jié)炎方證對(duì)應(yīng)研究的思路與方法

鄭春松1，嚴(yán)培晶2，付長龍3，葉蕻芝1，劉獻(xiàn)祥1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122；

2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350002；

3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350122）

目的建立骨關(guān)節(jié)炎（OA）方證對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略。方法通過基因芯片、代謝組學(xué)等得到臨床骨關(guān)節(jié)炎氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證患者與無上述證候、無慢性骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)外傷患者比較的差異基因和代謝物，構(gòu)建和分析證候分型的分子網(wǎng)絡(luò)；查閱膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)（2015年版），運(yùn)用計(jì)算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺(tái)，構(gòu)建和分析證候分型代表方與骨關(guān)節(jié)炎靶基因、靶蛋白、生物通路的作用網(wǎng)絡(luò)，找到其關(guān)鍵化合物和靶標(biāo)，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果形成了OA證候分型的分子網(wǎng)絡(luò)研究思路，詮釋證候分型的實(shí)質(zhì)；形成了證候分型代表方的分子網(wǎng)絡(luò)研究思路，詮釋各代表方在治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理途徑異同點(diǎn)；建立了網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵化合物和靶標(biāo)的驗(yàn)證方法，詮釋各代表方對(duì)相應(yīng)證候分型治療中的優(yōu)勢。結(jié)論骨關(guān)節(jié)炎方證對(duì)應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)新方法，將為骨關(guān)節(jié)炎的個(gè)體化診療提供幫助。

骨關(guān)節(jié)炎；方證對(duì)應(yīng)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；中醫(yī)藥療法；個(gè)體化診療

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為主要特征的慢性常見病，是中醫(yī)骨傷科治療的優(yōu)勢病種［1-2］。2015年中國中醫(yī)藥研究促進(jìn)會(huì)骨傷專業(yè)委員會(huì)以及中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)骨傷科專業(yè)委員會(huì)關(guān)節(jié)工作委員會(huì)形成了膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)，認(rèn)為OA分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，分別可以用血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯等加減治療［2］。然而，這種中醫(yī)臨床的辨證用藥及各種治療方法，以經(jīng)驗(yàn)為基礎(chǔ)，缺乏現(xiàn)代的語言，難以被人們普遍理解和接受，阻礙中醫(yī)藥成為OA主流療法的可能［3］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是借助“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，從系統(tǒng)的角度探索藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，具有整體性和系統(tǒng)性特點(diǎn)，為中醫(yī)藥復(fù)雜體系的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)詮釋提供新途徑［4-5］。因此，在膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療專家共識(shí)基礎(chǔ)上，本文首次提出了從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度開展OA方證對(duì)應(yīng)研究的的思路與方法。

1 理論基礎(chǔ)

方證對(duì)應(yīng)，源于東漢醫(yī)家張仲景的《傷寒論》，是探討方藥與病證之間一一對(duì)應(yīng)關(guān)系的學(xué)說，是作為中醫(yī)辨證論治中的一個(gè)重要概念［6-7］。分析不同證下的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)特征有助于深入研究中醫(yī)藥［8］，闡明方藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制，篩選出方藥的最佳適應(yīng)人群，為開展OA的精準(zhǔn)醫(yī)療提供幫助。

OA屬于中醫(yī)的“痹癥”范疇［1，9］，《素問·逆論調(diào)篇》曰：“骨痹，是人當(dāng)攣節(jié)也?！薄吨胁亟?jīng)》曰：“骨痹者，乃食欲不節(jié)，傷于腎也。腎氣內(nèi)消，則不能關(guān)禁……?！薄端貑枴らL刺節(jié)論篇》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”《素問·脈要精微論》曰：“膝者，筋之府，屈伸不能，行則僂俯，筋將憊矣?！薄端貑枴ち?jié)臟象論》曰：“肝者，其充在筋?！薄端貑枴け哉摗吩唬骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹；寒氣勝者為著痹也?！栽谟诠莿t重，在于脈則血凝而不流，在于筋則屈不伸，在于肉則不仁，在于皮則寒?！薄吨T病源候論·風(fēng)病諸候》曰：“亦有血?dú)馓摚茱L(fēng)邪而得之者”?！毒霸廊珪吩唬骸帮L(fēng)痹之證，大抵因虛者多，惟氣血不充，故風(fēng)寒得以入之，惟陰邪留滯，故經(jīng)脈為之不利?！庇衷唬骸吧w痹者閉也，以血?dú)鉃樾八]，不得通行而病也?！薄缎l(wèi)生寶鑒》曰：“老年腰膝久痛，牽引少腹兩足，不堪步履，奇經(jīng)之脈，隸于肝腎為多?！币虼?，OA多為“本虛標(biāo)實(shí)”“本痿標(biāo)痹”之證，臨床上將其分為氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證，應(yīng)采取不同的方藥進(jìn)行治療。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是由2007年由University of Dundee的Hopkins AL首次提出［10］，是一種基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、計(jì)算模擬和各組學(xué)技術(shù)等平臺(tái)的新藥發(fā)現(xiàn)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究方法，系統(tǒng)地揭示了藥物對(duì)疾病的干預(yù)與影響，具有整體性與動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)理論的系統(tǒng)觀和整體論思想不謀而合［11］。中藥復(fù)方是中醫(yī)預(yù)防和治療疾病的主要形式，其物質(zhì)基礎(chǔ)為四氣五味。一般來說，一種藥物只有一種藥性，但可以有一種或多種氣味。氣味相近，則功效相近。氣味相異，則功效不同。功效不同，則作用機(jī)體的靶標(biāo)也不同，即中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)的作用特征［12］。而且，證候是有許多因素組成的復(fù)雜系統(tǒng)，難以用單一的生物學(xué)指標(biāo)來表達(dá)，其與生物網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制具有關(guān)聯(lián)性［13-14］。因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可以從分子層面觀察方與證的內(nèi)在整體性對(duì)應(yīng)情況，有助于證候客觀化和個(gè)體化診療。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 選擇與證對(duì)應(yīng)的方藥

2.1.1 OA氣滯血瘀證與血府逐瘀湯OA氣滯血瘀證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)疼痛如刺，休息后痛反甚；②面色黧黑；③舌質(zhì)紫暗，或有瘀斑，脈沉澀。治法是活血化瘀、通絡(luò)止痛，方劑用清代醫(yī)家王清任著作《醫(yī)林改錯(cuò)》中的血府逐瘀湯［2］。

2.1.2 OA寒濕痹阻證與蠲痹湯OA寒濕痹阻證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)疼痛重著，遇冷加劇，得溫則減；②腰身重痛；③舌質(zhì)淡，苔白膩，脈沉。治法是溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈，方劑用清代醫(yī)家程鐘齡著作《醫(yī)學(xué)心悟》中的蠲痹湯［2］。

2.1.3 OA肝腎虧虛證與左歸丸OA肝腎虧虛證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)隱隱作痛；②腰膝酸軟無力，酸困疼痛，遇勞更甚；③舌質(zhì)紅，少苔，脈沉細(xì)無力。治法是滋補(bǔ)肝腎，方劑用明代醫(yī)家張景岳著作《景岳全書》中的左歸丸［2］。

2.1.4 OA氣血虛弱證與八珍湯OA氣血虛弱證病人的典型臨床表現(xiàn)：①關(guān)節(jié)酸痛不適；②少寐多夢，自汗盜汗，頭暈?zāi)垦＃募職舛?，面上少華；③舌淡，苔薄白，脈細(xì)弱。治法是補(bǔ)氣養(yǎng)血，方劑用元朝醫(yī)家朱震亨著作《丹溪心法》中的八珍湯［2］。

2.2 證候分型的OA疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析OA組的血樣、關(guān)節(jié)液、軟骨組織、滑膜組織分別取自行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證和氣血虛弱證OA病人，正常組的血樣、關(guān)節(jié)液、軟骨組織、滑膜組織取自無慢性關(guān)節(jié)炎、無上述證候分型健康人群中僅因關(guān)節(jié)外傷引起的病人［15-16］。通過基因芯片技術(shù)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)等，與正常組比較，得到OA組病人中軟骨組織中軟骨細(xì)胞、滑膜組織中滑膜細(xì)胞的差異基因和蛋白，以及關(guān)節(jié)液、血樣中差異代謝物，綜合Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID，http：// www.thebiogrid.org）、Database of Interacting Proteins（DIP，http：//dip.doe-mbi.ucla.edu/dip/Main.cgi）和STRING 10.0（http：//string-db.org/）等數(shù)據(jù)庫信息及來自文本挖掘的數(shù)據(jù)［17-18］，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺(tái)上［19］，直觀顯示OA組證候分型相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過ClueGO、KEGG和REACTOME分析［18，20］，預(yù)測其對(duì)應(yīng)的作用通路，建立蛋白質(zhì)-通路網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 2.8.3軟件中Plugins面板下的Network analysis，比較OA證候分型的差異性。

2.3 OA“方-證”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析以血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為研究對(duì)象，利用“PubChem”“中藥原植物化學(xué)成分手冊(cè)”“中國知網(wǎng)”等檢索上述方藥的各組成中藥成分，通過Discovery Studio計(jì)算模擬與數(shù)據(jù)建模平臺(tái)［21］，構(gòu)建上述方藥的分子數(shù)據(jù)庫。以2.2項(xiàng)下的蛋白為靶標(biāo)，若其有晶體結(jié)構(gòu)，從pdb數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/），采用分子對(duì)接技術(shù)［21］，研究方藥分子數(shù)據(jù)庫中化合物與靶標(biāo)的作用；若其無晶體結(jié)構(gòu)，采用藥效團(tuán)搜索或機(jī)器學(xué)習(xí)方法［22-23］，辨識(shí)出作用于靶標(biāo)的化合物。將化合物、靶標(biāo)和通路視為節(jié)點(diǎn)，相互作用視為邊，在Cytoscape 2.8.3軟件平臺(tái)上［19］，構(gòu)建證候分型對(duì)應(yīng)方藥的化合物-靶標(biāo)-通路作用網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 2.8.3軟件中的Network analysis，分析不同方藥對(duì)OA證候分型病人所起到的作用，找到不同方藥作用的關(guān)鍵靶標(biāo)和化合物。

2.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.4.1 關(guān)鍵靶標(biāo)的驗(yàn)證

2.4.1.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以改良Hulth造模法復(fù)制大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎為模型［24］，設(shè)立血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，按照藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算［25］，分別給予相應(yīng)的藥物干預(yù)4周后，用戊巴比妥鈉麻醉下腹主動(dòng)脈采血［26］，并取膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液、軟骨組織和滑膜組織［27-28］，借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥治療后對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白表達(dá)的變化，證實(shí)其作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

2.4.1.2 體外實(shí)驗(yàn)利用2月齡的雄性大鼠，制備大鼠血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和生理鹽水組的含藥血清。以白細(xì)胞介素1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞建立體外模型，實(shí)驗(yàn)分為血府逐瘀湯組、蠲痹湯組、左歸丸組、八珍湯組和和生理鹽水組，分別給予含10%血府逐瘀湯血清、蠲痹湯血清、左歸丸血清、八珍湯血清、生理鹽水組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，收集其培養(yǎng)液和軟骨細(xì)胞［29］。借助免疫組化、Elisa和Western blot方法，分析各方藥含藥血清干預(yù)退變軟骨細(xì)胞后對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白表達(dá)的變化，證實(shí)其作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

2.4.2 關(guān)鍵化合物的驗(yàn)證在關(guān)鍵靶標(biāo)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，采取固定化藥物靶標(biāo)方法和分子烙印方法［31-32］，辨識(shí)方藥的有效成分，驗(yàn)證預(yù)測的關(guān)鍵活性化合物。固定化藥物靶標(biāo)方法，即將已經(jīng)驗(yàn)證的靶標(biāo)固定在球狀載體上，制備親和色譜，利用靶標(biāo)對(duì)血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯中化合物親和力的差異，運(yùn)用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過質(zhì)譜的選擇離子流圖來分析數(shù)據(jù)，根據(jù)化合物在親和色譜柱保留時(shí)間的長短，確定化合物對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合能力，從方藥中篩選和鑒定出活性成分。若難以得到藥物靶標(biāo)，我們可以通過這個(gè)靶標(biāo)的已知活性配體制備這個(gè)靶標(biāo)的模擬物進(jìn)行篩選，即分子烙印方法。首先，選擇一個(gè)活性分子作為模板分子，然后，選擇合適的功能高分子與之聚合，最后從聚合物中除去模板分子即得到靶標(biāo)的模擬物，用聚合物作為液相色譜的固定相直接用于方藥血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯活性成分的篩選。

3 結(jié)語

不同方劑對(duì)機(jī)體疾病狀態(tài)的改善作用會(huì)因證候分型不同而具有差異性，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，可以更好揭示疾病與證候、證候與方劑之間的關(guān)系。本文提出了OA方證對(duì)應(yīng)研究新思路，即以O(shè)A的常見證候分型氣滯血瘀證、寒濕痹阻證、肝腎虧虛證、氣血虛弱證為切入點(diǎn)，以各分型對(duì)應(yīng)的代表方血府逐瘀湯、蠲痹湯、左歸丸和八珍湯為示范藥物，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，觀察OA各證候分型的差異蛋白，以及對(duì)應(yīng)方藥作用的靶標(biāo)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從微觀角度將方藥和證候有機(jī)地對(duì)應(yīng)起來，揭示不同方藥對(duì)OA各證候分型網(wǎng)絡(luò)的作用情況及方藥中組分間的相互作用規(guī)律，從而闡釋OA方證對(duì)應(yīng)模式的科學(xué)內(nèi)涵，使得OA的證候分型研究更具可操作性，促進(jìn)OA中醫(yī)精準(zhǔn)治療的發(fā)展，對(duì)中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究方法體系和中藥新藥的研發(fā)都具有重要的實(shí)際意義。

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［32］李德強(qiáng)，肖媛媛，戴榮源，等.靶分子親和－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥活性成分篩選中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31（21）：2164-2169.

R275.9

：A

：1000-338X（2016）06-0049-03

2019-09-15

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015J01338）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JA14152）

鄭春松（1982—），男，助理研究員，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合骨傷科研究。

劉獻(xiàn)祥（1963—），男，教授，博士生導(dǎo)師。

E-mail：liuxianxiang@163.com