徐綺嬪，王 寒，李計尚，周金偉，張 于，沈留紅，余樹民，彭廣能，曹隨忠

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130)

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牦牛SPAG11基因克隆與生物信息學分析

徐綺嬪，王 寒，李計尚，周金偉，張 于，沈留紅，余樹民，彭廣能，曹隨忠

(四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 奶牛疾病研究中心，四川 成都 611130)

【目的】 克隆牦牛(Bosgrunniens)精子相關抗原11(Sperm-Associated Antigen 11，SPAG11)基因，并了解其分子結構特征，為進一步研究牦牛SPAG11生物學功能奠定基礎。【方法】 從牦牛睪丸中提取總RNA，RT-PCR擴增并克隆SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因，測序后進行生物信息學分析。【結果】 克隆出牦牛SPAG11基因3個亞型：SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E，序列大小分別是351，408和261 bp，分別編碼117，129和80個氨基酸，其中SPAG11D和SPAG11E序列包含1個完整開放閱讀框(ORF)，SPAG11C序列包含部分ORF。牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列與黃牛(Bostaurus)相應序列相似性最高，而與黃牛β-防御素1相似性較低(<50%)。3個蛋白亞型均具有β-防御素家族基本特性，生物信息學分析顯示其均含有磷酸化位點?！窘Y論】 成功克隆牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因，明確了其編碼蛋白的分子結構特征。

牦牛；精子相關抗原11；β-防御素；生物信息學

精子相關抗原11(Sperm-Associated Antigen 11,SPAG11)，也稱為附睪蛋白 2(Epididymal protein 2，EP2)，是一種β-防御素。研究表明，SPAG11蛋白優(yōu)先表達于雄性生殖器官，不僅具有廣譜的抗微生物活性[1]，還在提高精子活力以及促進精子成熟、獲能和穿過透明帶中發(fā)揮著重要作用[2-3]。SPAG11的表達受啟動子選擇、通讀轉錄、外顯子招募機制和物種特異性的調控，在不同物種或同一物種的不同組織中存在多種蛋白亞型[4-5]。目前對SPAG11的研究主要集中在大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、靈長類動物以及牛等哺乳動物上，在牛體內發(fā)現(xiàn)SPAG11存在C、D、E、U、V和W等6種亞型[6]。小鼠，大鼠[7-8]，靈長類(人、獼猴)[4,9]和黃牛[6]SPAG11基因的cDNA序列均已成功克隆。牦牛(Bosgrunniens)，素有“高原之舟”之稱，是我國青藏高原特有的牛種，具有頑強的免疫防御能力，但其生長發(fā)育緩慢，繁育率較低[10]。除了營養(yǎng)因素外，牦牛繁育性能低下是否與其生殖系統(tǒng)抗感染能力弱有關目前尚不清楚。研究已表明，生殖道的感染嚴重威脅著雄性動物的生殖和內分泌功能[11-13]，而具有多種生物活性的防御素在動物先天性免疫(尤其在黏膜和上皮)中發(fā)揮著重要作用[14]。SPAG11作為一種在雄性生殖系統(tǒng)中特異性表達的具有抗感染功能和促生殖功能的重要蛋白，在牦牛生殖系統(tǒng)中的功能目前尚缺乏相關研究。為此，本研究以牦牛睪丸為材料，克隆了牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因，并對其進行生物信息學分析，以期為牦牛SPAG11基因的結構與生物學功能及其在生殖和生殖道免疫中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 組織樣品 睪丸組織取自3頭成年健康雄性麥洼牦牛(產于四川省阿壩州)，置于含有RNA樣品保存液的離心管中，4 ℃過夜，-70 ℃保存。

1.1.2 菌株與載體 克隆宿主菌為大腸桿菌(E.coli)DH5α(購于天根生化科技(北京)有限公司)，克隆載體質粒系統(tǒng)為pMD?19-T Simple Vector(購自寶生物工程(大連)有限公司)。

1.1.3 主要試劑與器材 RNA樣品保存液、RNA simple總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix及Greenview，均購自天根生化科技(北京)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自Fermentas公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit，購自美國OMEGA公司。S1000TM梯度PCR 儀及Universal HoodⅡ凝膠成像儀，均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計及合成 根據(jù)GenBank中收錄的黃牛SPAG11C(GenBank登錄號：DQ838981)、SPAG11D(GenBank登錄號：DQ838982)和SPAG11E(GenBank登錄號：DQ838983)基因序列，利用Primer 5.0軟件設計引物，在SPAG11D的上游(F)、下游(R)引物中分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點；在SPAG11E的F和R引物中分別引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點。引物由北京華大基因公司合成，其相關信息見表1。

表 1 牦牛SPAG11基因引物序列

注：SPAG11D的F和R引物中下劃線部分分別為BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點；SPAG11E的F和R引物中下劃線部分分別為EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點。

Note:The underlined parts ofSPAG11DF and R primers areBamHⅠ andHind Ⅲ restriction sites,respectively;The underlined parts ofSPAG11EF and R primers areEcoRⅠ andXbaⅠ restriction sites,respectively.

1.2.2 牦牛SPAG11基因的克隆 用RNA simple總RNA提取試劑盒提取牦牛睪丸組織的總RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成 cDNA第一鏈。以合成的cDNA第一鏈為模板，PCR擴增SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因。PCR反應體系如下：cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，RNase Free ddH2O 補足25 μL。反應條件均為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，按表1相應溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V電壓下電泳20 min)，Bio-Rad 凝膠成像儀記錄電泳圖像。

電泳完畢后，純化回收目的基因片段，分別與pMD?19-T Simple Vector載體連接，轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α 感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選，陽性克隆菌落進一步進行PCR鑒定后，送北京華大基因公司測序。

1.2.3 牦牛SPAG11基因生物信息學分析 將測序結果于NCBI中進行BLAST分析；利用在線工具ExPASy、SignalP 3.0、TMHMM 2.0、ProtScale、PSORT Ⅱ、NetNGlyc 1.0、NetOGlyc 4.0和NetPhos 2.0,分別預測SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白的理化性質、信號肽、跨膜區(qū)、疏水性、亞細胞定位、N-糖基化位點、O-糖基化位點和磷酸化位點；利用MegAlign軟件分析牦牛與部分物種SPAG11基因核苷酸序列的相似性；利用DNAMAN進行核苷酸和氨基酸序列比對分析；利用MEGA 6.0軟件構建NJ-系統(tǒng)發(fā)育樹(采用Kimura’s two-parameter模式和1000次的自舉檢驗)。

2 結果與分析

2.1 牦牛SPAG11基因的克隆

RT-PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。

M.DNA Marker；1.SPAG11D基因 SPAG11D gene；2.SPAG11E基因SPAG11E gene；3.SPAG11C基因 SPAG11C gene；圖 1 牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因PCR擴增

圖1顯示，在250～500 bp處出現(xiàn)與預期片段大小相近似的條帶(圖1)。對PCR擴增產物進行測序，將測序結果于NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，結果表明成功獲得牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E序列，長度分別為351，408和261 bp。

2.2 牦牛SPAG11基因編碼產物的基本理化性質

ExPASy分析顯示，SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白分子量分別約為13.2，14.8和9.24 ku；理論等電點分別為9.59，9.78和8.22；負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)分別為10，12和9，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)分別為20，22和11；平均親水性系數(shù)分別為-0.572，-0.730和-0.260，故三者均為親水性蛋白。綜合神經網絡法(neural network，NN)和隱馬可夫模型(hidden markov models，HMM)兩種算法分析顯示，SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E N-端均含有信號肽。對SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E氨基酸序列的N-端信號肽切割位點、跨膜區(qū)、疏水性、糖基化位點和磷酸化位點的預測結果如圖2所示。由圖2可見，牦牛SPAG11D蛋白是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)構成，SPAG11C和SPAG11E無跨膜區(qū)；N-端信號肽切割位點提示，SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E成熟肽分別始于第21位、第26位和第19位氨基酸；牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白均含有磷酸化位點，此外SPAG11C和SPAG11E蛋白均含有O-糖基化位點，而SPAG11C蛋白還含有N-糖基化位點。亞細胞定位的預測結果如表2所示。由表2可見，SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白均主要分布于細胞核和線粒體上。

2.3 牦牛SPAG11基因核苷酸序列分析

序列分析顯示，SPAG11C核苷酸序列包含部分開放閱讀框(Open reading frame,ORF)，SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列包含1個完整ORF，分別編碼117，129和80個氨基酸，氨基酸序列均含有β-防御素的特征性分子結構，即6個保守的半胱氨酸殘基(Cys,C)。牦牛與黃牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列比對分析結果顯示，牦牛SPAG11C發(fā)生了3個堿基突變，分別為第98位G→T、第128位G→A和第219位C→G，從而導致第33位Gly-Val、第43位Arg-Gln和第73位Phe-Leu氨基酸突變；SPAG11D發(fā)生1個堿基突變，即第137位A→G，引起第46位Asn-Ser氨基酸突變；而牦牛SPAG11E核苷酸序列與黃牛一致。將大鼠SPAG11C、小鼠SPAG11和SPAG11C、獼猴(Macacamulatta)SPAG11C和SPAG11E、犬(Canisfamiliaris)SPAG11C和SPAG11E、野豬(Susscrofa)SPAG11、牦牛與黃牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E、以及人類(Homosapiens)HE2(Human epididymisprotein2，HE2)的氨基酸序列進行多序列比對，結果(圖3)顯示，可見各氨基酸序列均包含與β-防御素活性域同源6個保守的半胱氨酸殘基(C)和1個保守的甘氨酸殘基(G)。

圖 2 牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E氨基酸序列的N-端信號肽切割位點、跨膜區(qū)、疏水性、糖基化位點和磷酸化位點

牦牛與其他物種SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列的相似性比對結果如表3所示。從表3可見，牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列與黃牛相應序列的相似性均最高(>99%)，而與黃牛β-防御素1核苷酸序列相似性均較低(<50%)。

圖 3 牦牛與其他物種SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E氨基酸序列多重比對

2.4 牦牛SPAG11基因的系統(tǒng)進化分析

基于編碼區(qū)(CDS區(qū))核苷酸序列計算不同物種的遺傳距離，利用MEGA 6.0軟件構建NJ-系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。由圖4可見，與SPAG11C相比，SPAG11D和SPAG11E間具有更近的遺傳距離；牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E基因均與黃牛相應基因遺傳距離最近，且各自形成一個分支，而與黃牛β-防御素1的遺傳距離最遠。

圖 4 牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列的NJ-系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

本研究成功克隆牦牛SPAG11基因3個亞型，即SPAG11C部分ORF、SPAG11D和SPAG11E基因的完整ORF。牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E核苷酸序列與黃牛相應序列相似性>99%，牦牛SPAG11C和SPAG11D分別發(fā)生3個和1個核苷酸位點突變，從而引起相應氨基酸突變，其中SPAG11D氨基酸序列第46位發(fā)生Asn-Ser突變，該氨基酸突變位點可能并未引起蛋白質空間構象的改變[15]。理化性質預測和氨基酸序列比對分析顯示，牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E的N-端均含有信號肽，C-端序列含有一個保守的甘氨酸殘基(G)及與β-防御素活性域同源的6個半胱氨酸殘基(C)，且其正電荷氨基酸殘基總數(shù)均大于負電荷氨基酸殘基總數(shù)。由C-端的6個C形成的3個二硫鍵，起穩(wěn)定蛋白結構的作用[16]，這是β-防御素家族基本特性[14]。保守的Gly殘基利于Loop區(qū)轉角結構的回折，保證了結構的穩(wěn)定性[17]。此外，防御素分子的凈電荷數(shù)影響其抗菌活性[18]，正電荷氨基酸殘基數(shù)目與抗菌活性呈正相關關系，負電荷則相反[19-22]，由此推測牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白具有抗菌活性。目前對SPAG11蛋白亞細胞定位研究較少，Pujianto等[23]研究顯示，SPAG11A是分泌型蛋白，免疫組化檢測證實其位于附睪頭主細胞細胞核與細胞質中。本研究的亞細胞定位結果表明，SPAG11C蛋白主要存在于細胞質(34.7%(包含線粒體))和細胞核(52.2%)，SPAG11D主要存在于細胞質(34.8%(包含線粒體))和細胞核(52.2%)，而SPAG11E主要存在于細胞核(34.8%)和細胞質(34.7%(包含線粒體))，結果與Pujianto等[23]的研究結果相似。翻譯后修飾是蛋白質調節(jié)功能的重要方式，而磷酸化是研究最廣泛以及體內最為常見的蛋白質翻譯后修飾，它與信號傳導、細胞周期、生長發(fā)育等諸多生物學問題有密切關系[24]。生物信息學預測顯示，牦牛SPAG11C、SPAG11D和SPAG11E蛋白均含有磷酸化位點，其中SPAG11C磷酸化位點與Avellar等[6]預測的牛SPAG11蛋白磷酸化位點相一致，因此推測這些磷酸化位點可能在SPAG11發(fā)揮其生物學功能中起著重要的調控作用。

研究表明，SPAG11C和SPAG11EmRNA在梅山豬生殖道組織廣泛表達，其中在睪丸組織中表達水平變化與性發(fā)育相一致[25]。大鼠SPAG11表達呈年齡依賴性，也與性發(fā)育相一致[7]。此外，荷斯坦公牛SPAG11基因單核苷酸多態(tài)性與精子質量特性相關，其中SNP-2對新鮮精子運動性和精子密度有顯著(P<0.05)影響，而SNP-3對冷凍精液快速解凍后精子的運動性、畸形率分別有顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)影響[26]。轉SPAG11E基因小鼠能夠抵抗細菌感染[27]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導大鼠雄性生殖道中防御素和SPAG11E蛋白的表達，并發(fā)揮抑菌活性[28-30]。Avellar等[6]發(fā)現(xiàn)，黃牛SPAG11D和SPAG11E在睪丸的精子細胞、支持細胞中相對高表達，在附睪上皮細胞、附睪管、管腔內精子及輸精管中高表達。牦牛SPAG11D相對高表達于睪丸和附睪頭，SPAG11E相對高表達于睪丸、附睪和輸精管[31]。本研究結果顯示，牦牛SPAG11D和SPAG11E序列與黃牛存在高度的相似性，由此提示在附睪等組織中，牦牛SPAG11D、SPAG11E很可能具有與黃牛相似的抗菌作用。綜上推測SPAG11在保持牦牛雄性的生殖能力、抗感染及疾病治療等方面具有極高的潛在價值。

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Cloning and bioinformatics analysis of SPAG11 gene in yak (Bosgrunniens)

XU Qipin,WANG Han,LI Jishang,ZHOU Jinwei,ZHANG Yu,SHEN Liuhong,YU Shumin,PENG Guangneng,CAO Suizhong

(Center of Dairy Cattle Disease,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

【Objective】This study aimed to clone Sperm-Associated Antigen 11 (SAPG11) gene of yak (Bosgrunniens) and explore its characteristics of molecular structure for further study on its biological function.【Method】 TheSPAG11C,SPAG11DandSPAG11Egenes from yak were amplified and tested by RT-PCR technology before being cloned into pMD?19-T Simple Vector for sequence and analyzed by bioinformatics tools.【Result】 Three subtypes of theSPAG11 gene of yak were cloned (namely,SPAG11C,SPAG11DandSPAG11E) with lengths of 351 bp,408 bp and 261 bp and numbers of encoded amino acids of 117,129 and 80,respectively.SPAG11DandSPAG11Esequences contained a complete opening reading frame (ORF),whileSPAG11Csequence contained partial ORF.Phylogenetic analysis showed thatSPAG11C,SPAG11DandSPAG11Egenes of yak had the highest similarity withBostaurus(>99%) but a lower similarity with the beta-defensin-1 gene ofBostaurus(<50%).All of them had the basic characteristics of beta-defensin family and contained phosphorylation sites.【Conclusion】SAPG11C,SPAG11DandSPAG11Egenes of yak were successfully cloned,and their molecular structure characteristics were defined.

yak (Bosgrunniens);Sperm-Associated Antigen 11( SPAG11);beta-defesin;bioinformatics

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.005

2015-06-07

教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”創(chuàng)新團隊項目(IRT0848)；國家自然科學基金項目(31172379)；四川農業(yè)大學學科建設雙支計劃項目(3570806)

徐綺嬪(1993-)，女，廣西玉林人，在讀碩士，主要從事奶牛繁殖障礙疾病研究。E-mail:qipinxu@126.com

曹隨忠(1971-)，男，甘肅岷縣人，教授，博士，碩士生導師，主要從事奶牛疾病研究。 E-mail:suizhongcao@126.com

S823.8+5;Q78

A

1671-9387(2016)12-0028-07

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