趙展，夏琳林，劉曉霞，楊杰，吳曉妹，張利娟，賈宇馳，王玉寶

布倫登盧普沙門菌耐藥性與毒力基因分析

趙展，夏琳林，劉曉霞，楊杰，吳曉妹，張利娟，賈宇馳，王玉寶△

目的研究臨床分離的非傷寒沙門菌布倫登盧普血清型（布倫登盧普沙門菌）對抗菌藥物的耐藥性及其攜帶的毒力基因特征。方法收集2012—2014年每年4—10月天津市兩家教學(xué)醫(yī)院腸道門診急性腹瀉患者的臨床資料，將急性腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行沙門菌分離培養(yǎng)、生化及PCR鑒定、血清學(xué)分型，對得到的布倫登盧普沙門菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性檢測、PCR擴(kuò)增沙門菌毒力島（SPI）1～5的代表性基因和SPI的調(diào)節(jié)基因。結(jié)果3年共檢測到非重復(fù)非傷寒沙門菌153株，其中8株（5.23%）為布倫登盧普沙門菌。8株invA-PCR鑒定均呈陽性，對萘啶酸耐藥率100%，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介耐藥率100%，對其余檢測的抗菌藥物敏感；8株均檢測到了SPI 1～5代表性基因和SPI調(diào)節(jié)基因（sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB和phoP）。結(jié)論天津地區(qū)布倫登盧普沙門菌臨床株對氟喹諾酮耐藥并攜帶SPI 1～5毒力基因與調(diào)節(jié)基因，對公眾健康構(gòu)成潛在威脅，應(yīng)持續(xù)開展相關(guān)監(jiān)測與研究。

腹瀉；抗藥性，微生物；喹諾酮類；氟喹諾酮；毒力；布倫登盧普沙門菌

在各種食源性病原體中，非傷寒沙門菌（Nontyphoidal Salmonella，NTS）造成的公共健康問題非常突出，在全球每年約導(dǎo)致9 380萬人患急性胃腸炎和15.5萬人死亡［1］。沙門菌毒力島（Salmonella Pathogenicity Islands，SPI）是沙門菌染色體上的大片段DNA，可攜帶多種毒力基因，幫助其侵入人體并在免疫細(xì)胞中存活和復(fù)制，與傷寒或NTS的致病能力密切相關(guān)［2］。NTS包括近3 000種血清型，引起感染和暴發(fā)最常見的血清型是腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌［3］。布倫登盧普沙門菌（S.Braenderup）在NTS中的分離比例雖然不高，但該血清型的大規(guī)模暴發(fā)感染在國內(nèi)外均有報(bào)道［4-5］。國外已發(fā)現(xiàn)S.Braenderup對氟喹諾酮和三代頭孢等抗菌藥物的耐藥株，但國內(nèi)鮮見S.Braenderup對抗菌藥物耐藥性及攜帶毒力基因的研究報(bào)道。本研究對2012—2014年每年4—10月連續(xù)3年臨床分離的S.Braenderup進(jìn)行了相關(guān)分析，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2012—2014年每年4—10月就診于天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腸道門診急性腹瀉患者的臨床資料。3年共153例NTS感染，其中8例為S.Braenderup；5例來自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，3例來自天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；包括男5例、女3例，年齡25～62歲，中位年齡（P25，P75）為40.50（28.75，60.75）歲。

1.2 主要試劑與儀器細(xì)菌生化鑒定試紙條API20E（法國梅里埃公司），沙門菌血清診斷試劑盒（丹麥國立血清研究所），氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、頭孢他啶、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方磺胺甲和氯霉素等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品或藥敏紙片（北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司），厄他培南藥敏紙片（上海賽默飛世爾科技有限公司），PCR儀（Mastercycler personal，德國eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離、培養(yǎng)及生化鑒定按照《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法微生物學(xué)部分》GB/4789-2010中腸道致病菌檢驗(yàn)方法對患者糞便標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)和菌株生化鑒定。

1.3.2 菌株的PCR鑒定煮沸法提取細(xì)菌DNA，以沙門菌屬特異性基因invA為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列和PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［6］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（下同）。PCR陰性質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽性質(zhì)控菌株腸炎沙門菌1311均為本研究所保存。

1.3.3 菌株的血清學(xué)鑒定按照沙門菌血清診斷試劑盒說明書步驟操作，根據(jù)診斷血清與菌株O抗原、H抗原和Vi抗原的凝集反應(yīng)結(jié)果比對Kauffmann-White抗原表確定沙門菌屬的血清型［7］。S.Braenderup的抗原式為6,7,14:e,h:e,n,z15。

1.3.4 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2014年提供的方法［8］，采用K-B紙片法和微量肉湯稀釋法檢測菌株對13種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果判讀參照CLSI 2014年抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1.3.5 菌株毒力基因檢測PCR擴(kuò)增檢測S.Braenderup SPI 1～5代表性基因sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB及調(diào)節(jié)基因phoP。PCR陰性質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽性質(zhì)控菌株腸炎沙門菌1311同1.3.2。煮沸法提取菌株DNA模板，引物和PCR反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［9］，引物序列及目的片段長度見表1。

2 結(jié)果

2.1 S.Braenderup的分離率2012—2014年自我市兩所教學(xué)醫(yī)院腸道門診共分離出8株（5.23%）S.Braenderup，每年均有檢出。該8株菌經(jīng)PCR鑒定，均能擴(kuò)增出符合預(yù)期大?。?83 bp）的invA基因片段，見圖1。

Tab.1Primer sequences of virulence genes表1 毒力基因引物序列

Fig.1Electrophoresis results of PCR products of invA genes圖1 invA基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 S.Braenderup藥敏結(jié)果該8株菌對萘啶酸耐藥率100%，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介耐藥率100%，對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、頭孢他啶、厄他培南、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲、氯霉素等抗菌藥物均敏感。

2.3 S.Braenderup毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果8株菌SPI代表性基因經(jīng)PCR擴(kuò)增均能得到符合預(yù)期大小的DNA片段，部分菌株P(guān)CR電泳結(jié)果見圖2。

Fig.2Electrophoresis results of PCR products of representative virulence genes of SPI 1-5圖2 SPI 1～5代表性毒力基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討論

3.1 S.Braenderup的臨床分離率S.Braenderup屬于NTS血清學(xué)分型中的C1群，因1937年在丹麥的布倫登盧普地區(qū)第1次被發(fā)現(xiàn)而得名，目前國內(nèi)外從人及動(dòng)物中均有分離出該沙門菌血清型的報(bào)道。S.Braenderup在不同國家和地區(qū)的流行程度不同。瑞士1989—1992年間NTS感染病例中僅有0.5%由S.Braenderup所致［10］；而馬來西亞北部對分離自患者的NTS研究中S.Braenderup所占比例高達(dá)11.25%［11］。我國福建省2006—2011年臨床患者采集到449株沙門菌，包括381株NTS，其中有2株為S.Braenderup（0.52%）［12］。本研究3年間共分離到S.Braenderup 8株（5.23%），高于福建省，說明S.Braenderup感染在本地區(qū)并非少見。

3.3 臨床株攜帶毒力基因的特征目前已經(jīng)鑒定出23種SPI，研究比較深入的是SPI 1～5，而phoP與phoQ基因一起構(gòu)成一個(gè)二元系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)SPI在沙門菌中的表達(dá)。本研究對S.Braenderup SPI 1～5的各自代表性基因和phoP基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增均得到陽性結(jié)果。提示這些臨床分離的S.Braenderup均攜帶SPI 1～5和SPI調(diào)節(jié)基因，因而具有很強(qiáng)的致病能力。食品來源的NTS攜帶SPI的情形與本研究中臨床分離的NTS有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，市售鮮雞蛋中NTS攜帶SPI 1～5中的一類或多類，只有部分菌株具有SPI-1+SPI-2+SPI-3+SPI-4+SPI-5的組合，與菌株的強(qiáng)致病性顯著相關(guān)［15］。國外研究顯示，分離自患者糞便和血液標(biāo)本的NTS攜帶的SPI種類并無明顯差別，這提示能引起人類胃腸炎的NTS均有導(dǎo)致血液感染的潛在能力［16］。

3.4 感染暴發(fā)的識(shí)別與監(jiān)測S.Braenderup在瑞士、日本等國家均造成過大規(guī)模感染暴發(fā)［4,10］。在我國引起的數(shù)十至上百例的集體食物中毒也時(shí)有發(fā)生［5］。本研究中的8例患者雖然分散在2012—2014年，但是菌株的藥敏譜完全一致，提示病例之間可能具有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。由公共衛(wèi)生部門主導(dǎo)的以菌株基因分型為基礎(chǔ)的監(jiān)測體系，例如國際食源性疾病分子分型網(wǎng)絡(luò)PulseNet，可以幫助早期識(shí)別NTS感染暴發(fā)。2014年，美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）通過PulseNet發(fā)現(xiàn)了6例S.Braenderup感染，雖然該6例分散在5個(gè)州、時(shí)間跨越4個(gè)月，但菌株P(guān)FGE基因分型完全一致，經(jīng)過詳細(xì)的流行病學(xué)調(diào)查后，最終確認(rèn)這是一起感染暴發(fā)，感染源是一家食品加工廠制作的被S.Braenderup污染的杏仁和花生醬，之后立即采取相應(yīng)措施及時(shí)避免了更多病例的出現(xiàn)［17］。目前，我國北京、上海、浙江等省市已加入了PulseNet China系統(tǒng)，為維護(hù)公眾健康，天津市很有必要加入該監(jiān)測系統(tǒng)。

綜上所述，自2012—2014年本地區(qū)持續(xù)分離到對喹諾酮耐藥并攜帶SPI 1～5毒力基因與調(diào)節(jié)基因的S.Braenderup，其對公眾健康構(gòu)成一定威脅。為有利于指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，早期識(shí)別并有效控制感染暴發(fā)，天津地區(qū)應(yīng)長期開展NTS的耐藥監(jiān)測，并建立以分子分型為基礎(chǔ)的食源性病原體監(jiān)測體系和溯源體系。

致謝：感謝中國疾病預(yù)防控制中心腹瀉病研究室和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院感染性疾病科對本研究提供的大力支持和幫助。

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（2016-07-08收稿2016-09-29修回）

（本文編輯李鵬）

Antimicrobial resistance and virulence gene profiling of Salmonella enterica serovars Braenderup

ZHAO Zhan,XIA Linlin,LIU Xiaoxia,YANG Jie,WU Xiaomei,ZHANG Lijuan,JIA Yuchi,WANG Yubao△
Institute of Infectious Diseases,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China△

ObjectiveTo investigate antimicrobial resistance and virulence gene profiles of clinically isolated nontyphoidal Salmonella enterica serovars Braenderup(S.Braenderup).MethodsClinical date of patients with acute diarrhea from two teaching hospitals in our city were collected from April to October of 2012 to 2014.Salmonella from stool samples was screened by culture,and identified by biochemical,PCR and serotype methods.Isolates of S.Braenderup were examined with antibiotic susceptibilities.PCR amplification was used for representative genes of Salmonella pathogenicity islands (SPI)1-5 and SPI regulator.ResultsAmong 153 non-repetitive NTS isolates in the three years,8 isolates(5.23%)of S.Breanderup were identified.All 8 isolates were positive with invA gene.The resistance rate to nalidixic acid was 100%, and the same with the intermediate resistance rate to ciprofloxacin and levofloxacin.But they were susceptible to other antimicrobial agents.The 8 isolates were positive with the representative genes of SPI 1-5 and regulators(sitC,hilA,sseL, sifA,mgtC,siiE,sopB and phoP).ConclusionClinical isolates of S.Braenderup in Tianjin are resistant to fluoroquinolones and harbored genes of SPI 1-5 and regulator,and which can threaten public health.Continuous surveillance and research should be carried out in our city.

diarrhea;drug resistance,microbial;quinolones;fluoroquinolones;virulence;Salmonella Breanderup

R378.22

A

10.11958/20160630

天津市衛(wèi)生局科研基金資助項(xiàng)目（2013KZ112）

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感染性疾病研究所（郵編300211）

趙展（1992），女，碩士在讀，主要從事細(xì)菌耐藥及致病機(jī)制研究

△通訊作者E-mail：wyb2046@163.com