劉 煒，劉 菊，黃義新（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的制備及其體外釋藥特性和抑菌作用研究

劉 煒＊，劉 菊，黃義新（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

目的：制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球，考察其體外釋藥特性和抑菌作用。方法：采用乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球，觀察微球的粒徑分布及形態(tài)；應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定微球藥物含量，計(jì)算載藥量及包封率；通過(guò)體外釋放試驗(yàn)，比較其與鹽酸萬(wàn)古霉素24 h內(nèi)的體外釋藥情況，考察其7 d內(nèi)的累積釋放度（Q）；通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)觀察其作用20 d對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響。結(jié)果：所制萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球呈圓球形，表面圓整，無(wú)明顯凹凸和孔隙，平均粒徑為（165.6±19.7）μm，平均載藥量為（32.6±3.2）%，平均包封率為（53.8±6.3）%，Q7d為82.7%；其與鹽酸萬(wàn)古霉素的Q2h分別為18.6%、91.3%；其作用1 d時(shí)的抑菌圈直徑＞3 cm，隨其作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑逐漸縮小。結(jié)論：成功制得萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球，其體外緩釋效果明顯，且具有良好的體外抑菌作用。

萬(wàn)古霉素；殼聚糖；微球；體外釋藥；體外抑菌

臨床修復(fù)骨損傷的過(guò)程中，常發(fā)生細(xì)菌感染難以控制的難題，常規(guī)靜脈滴注抗生素治療難以在局部產(chǎn)生高濃度的抗生素，無(wú)法達(dá)到理想的治療效果。因此，近年來(lái)抗生素局部緩釋系統(tǒng)在骨感染中的應(yīng)用逐漸發(fā)展，該系統(tǒng)可以控制藥物在局部釋放，又能發(fā)揮良好抗菌活性[1-2]。微球作為緩控釋藥物載體應(yīng)用廣泛，其制備方法簡(jiǎn)便，適用于不同部位的給藥，可用于注射、黏膜吸附或口服等不同給藥方式，因此被廣泛應(yīng)用于載藥緩釋系統(tǒng)[3-4]。萬(wàn)古霉素是骨科應(yīng)用較廣的抗生素，細(xì)胞毒性較低，主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑制效果顯著[5]。本研究應(yīng)用殼聚糖微球良好的緩控釋載體性能，制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球，并探討其載藥性能、體外釋放性能和體外抑菌性能，旨在為骨修復(fù)過(guò)程中的局部載藥緩釋系統(tǒng)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

JEM-200CX透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Lambda 650紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)鉑金埃爾默）；Zetasizer-3000激光粒度分布測(cè)量?jī)x（英國(guó)Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸萬(wàn)古霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：150607，規(guī)格：每支500 mg）；殼聚糖（上海銳谷生物科技有限公司，分析純）；25%戊二醛、三氯甲烷、乙醇、NaOH等均為分析純。

1.3 細(xì)菌

金黃色葡萄球菌（ATCC 25923），購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的制備

采用水/油乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球。將殼聚糖分散于稀乙酸水溶液中，溶脹12 h后制成0.2%的殼聚糖溶液，取適量鹽酸萬(wàn)古霉素溶入殼聚糖溶液，邊攪拌邊將0.4%戊二醛稀溶液5 ml緩慢加入殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10 min；加入液體石蠟和乳化劑油酸山梨坦，攪拌1 h后緩慢加入交聯(lián)劑25%戊二醛溶液4 ml，40℃攪拌；加適量的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至微堿性，過(guò)濾后依次用三氯甲烷、乙醇溶液洗滌脫水，真空干燥器中干燥，制得萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球。

2.2 微球的粒徑分布與形態(tài)觀察

將萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球粉末均勻分散地黏附于導(dǎo)電膠上，觀測(cè)前噴金，在透射電子顯微鏡下觀察微球的形態(tài)結(jié)構(gòu)。取2 ml萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球混懸液，置于激光粒度分布測(cè)量?jī)x中分析微球的粒徑分布。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球形貌較好，大致呈圓球形，表面光滑圓整，無(wú)凹凸和孔隙，粒徑分布均勻，粒徑分布在200 nm左右，平均粒徑為（165.6±19.7）nm（n＝3）。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球電鏡掃描圖見圖1。

圖1 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的電鏡掃描圖（×200）Fig 1 TEM of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres（×200）

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

稱取鹽酸萬(wàn)古霉素和空白殼聚糖緩釋微球在200～800 nm全波段行紫外掃描。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，且空白殼聚糖緩釋微球在此波長(zhǎng)下不干擾測(cè)定，故選用280 nm作為萬(wàn)古霉素的檢測(cè)波長(zhǎng)，光譜圖見圖2。

圖2 紫外吸收光譜圖Fig 2 UV spectrums

2.4 微球中萬(wàn)古霉素的含量測(cè)定

精密稱取鹽酸萬(wàn)古霉素100 mg溶解于HCl溶液中，置于100 ml量瓶中定容，制成1 mg/ml的對(duì)照品溶液；然后將對(duì)照品溶液稀釋制成系列梯度濃度的萬(wàn)古霉素溶液，于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各濃度溶液的吸光度（A）。以A值對(duì)質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A＝2.967 2c+0.003 2（r2＝0.999 6）。萬(wàn)古霉素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為10～500 μg/ml。

2.5 微球載藥量和包封率的測(cè)定

將萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球溶解于HCl溶液中，于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定萬(wàn)古霉素的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算萬(wàn)古霉素的含量。按公式計(jì)算包封率與載藥量，包封率（%）＝微球中藥物質(zhì)量/藥物的投藥量×100%；載藥量（%）＝微球中藥物質(zhì)量/微球的質(zhì)量×100%。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的載藥量為（32.6±3.2）%，包封率為（53.8±6.3）%（n＝3）。

2.6 體外釋放試驗(yàn)

稱取定量的萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬(wàn)古霉素對(duì)照品，置于截留分子質(zhì)量為8 000～10 000 Da的透析袋內(nèi)，以釋放介質(zhì)為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液、轉(zhuǎn)速為100 r/min，于37℃恒溫水浴中振搖。分別于1、2、4、6、8、12、16、24 h取樣1 ml，并立即補(bǔ)加等量的釋放介質(zhì)1 ml，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定取樣液的吸光度。根據(jù)回歸方程計(jì)算萬(wàn)古霉素的濃度，再計(jì)算累積釋放度（Q），繪制釋放曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬(wàn)古霉素24 h內(nèi)的累積釋藥曲線Fig 3 Accumulative release curves of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h

由圖3顯示，萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球的Q1h為13.2%，Q2h為18.6%，Q4h為29.5%，Q12h為42.3%，Q24h為47.6%；鹽酸萬(wàn)古霉素的Q1h為82.1%，Q2h為91.3%，Q4h為98.7%。通過(guò)對(duì)二者的體外累積釋放度的比較，發(fā)現(xiàn)萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球能減緩萬(wàn)古霉素的體外釋放。同法測(cè)定萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的體外釋放情況，結(jié)果顯示，其Q7d為82.7%，表明萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球具有較好的緩釋作用。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的累積釋藥曲線見圖4。

圖4 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內(nèi)的累積釋藥曲線Fig 4 Accumulative release curve of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres within 7 d

2.7 體外抑菌試驗(yàn)

將平行3組萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球材料滴入含金黃色葡萄球菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。將微球材料置于新的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24 h重復(fù)此操作，共測(cè)量抑菌圈20 d，繪制抑菌圈直徑-時(shí)間曲線。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌具有持續(xù)抑菌作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈逐漸縮小。萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時(shí)間曲線見圖5。

圖5 萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球?qū)瘘S色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時(shí)間曲線Fig 5 The diameter of inhibition zone-time curve in vitro of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspher-es to S.aureus

3 討論

開放性骨折或感染性骨缺損，常因?yàn)榇嬖诟腥疽蛩?，加大了治療難度[6]。常規(guī)口服或靜脈給予抗生素治療，由于藥物劑量大，易引發(fā)不良反應(yīng)，且局部治療效果較差。而采用藥物緩控釋技術(shù)可以降低藥物的毒副作用，減少用藥次數(shù)，避免耐藥性的產(chǎn)生。

理想的抗生素緩釋載體材料，應(yīng)具有一定的載藥量，釋藥速度平穩(wěn)；不但能夠有效釋放抗生素以控制感染，且能實(shí)現(xiàn)局部給藥增強(qiáng)藥物的療效，有效避免全身給藥產(chǎn)生的不利影響[7-10]。殼聚糖是一種天然高分子生物材料，以其良好的生物相容性和可降解特性，被廣泛應(yīng)用于基因、藥物載體載體[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)以殼聚糖作為緩釋載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用乳化交聯(lián)法制備萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球，經(jīng)測(cè)量載藥量為（32.6±3.2）%，包封率為（53.8±6.3）%。推測(cè)萬(wàn)古霉素在微球中的載藥機(jī)制為：萬(wàn)古霉素與殼聚糖分子中均含有氨基，戊二醛作為交聯(lián)劑可以和氨基發(fā)生反應(yīng)。在微球制備初期殼聚糖形成少量交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將萬(wàn)古霉素分子包裹其中。當(dāng)水相和油相混合之后能有效減少萬(wàn)古霉素的分散，從而提高微球交聯(lián)度和萬(wàn)古霉素的交聯(lián)密度，增加復(fù)合微球的載藥性能[11-12]。

萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球在釋放介質(zhì)中開始時(shí)釋放較快，Q4h為29.5%，之后釋放平穩(wěn)。其機(jī)制在于鹽酸萬(wàn)古霉素分子中含有親水性羥基，呈水溶性，可以與水分子以氧鍵結(jié)合，能很快地?cái)U(kuò)散在溶液中[13]。由緩釋微球和單藥萬(wàn)古霉素的釋放對(duì)比曲線可以看出，載藥微球能顯著抑制萬(wàn)古霉素的突釋，避免瞬間局部產(chǎn)生高藥物濃度。綜上所述，萬(wàn)古霉素殼聚糖緩釋微球在體外顯示了良好的緩釋作用和抑菌活性，可為其在骨感染治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

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（編輯：鄒麗娟）

Preparation of Vancomycin-loaded Chitosan Sustained-release Microspheres and Its Drug Release in vitro and Antibacterial Effect

LIU Wei，LIU Ju，HUANG Yixin（Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

OBJECTIVE：To prepare vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and to study its drug release and antibacterial effects in vitro.METHODS：The emulsion cross-linking was used to prepare vancomycin-loaded chitosan sustainedrelease microspheres，and the particle size and morphology of microspheres were observed.The contents of vancomycin in microspheres was determined by UV spectrophotometry，and drug-loading amount of entrapment efficiency were calculated.Drug release of prepared microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h were compared by release trial in vitro，and then its accumulative release rate（Q）within 7 d was investigated.The effects of prepared microspheres on the diameter of inhibition zone to Staphylococcus aureus after treated for 20 d were observed through in vitro antibacterial test.RESULTS：The microspheres were spherical and complete round without obvious bump and pore.The average particle size of the microspheres was（165.6±19.7） μm；average drug-loading amount was（32.6±3.2）%；average encapsulation efficiency was（53.8±6.3）%；Q7dwas 82.7%.Q2hof prepared microspheres and vancomycin hydrochloride were 18.6%and 91.3%.The diameter of inhibition zone was higher than 3 cm after treated for 1 d，and then decreased gradually as time.CONCLUSIONS：Vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres can be prepared successfully，and show obvious in vitro sustained-release effect and antibacterial effects.

Vancomycin；Chitosan；Microsphere；Release in vitro；Antibacterial effect in vitro

R943

A

1001-0408（2016）31-4443-03

2016-03-21

2016-06-20）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥物制劑、臨床藥學(xué)。電話：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.36