張愛梅，姜曉霞，陳 鑫，官曉筠，萬慧娟，李 麗，馬克濤，司軍強(qiáng)

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·論著·

鈣激活氯通道TMEM16A在大鼠心房和心室中的表達(dá)差異

張愛梅，姜曉霞，陳 鑫，官曉筠，萬慧娟，李 麗，馬克濤，司軍強(qiáng)

目的 探究鈣激活氯通道(CaCCs)TMEM16A在大鼠心房和心室組織中的表達(dá)情況，為臨床治療心肌缺血、心律失常以及心力衰竭等疾病提供新的治療靶點。方法 2014年10月—2015年9月，將18只清潔級Sprague-Dawley大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后取心臟，分離心房和心室組織進(jìn)行實驗。采用Western blotting法和實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)法分別檢測大鼠心房和心室組織中TMEM16A及其mRNA水平。結(jié)果 大鼠心房和心室組織TMEM16A水平分別為(0.46±0.02)和(0.33±0.03)，心房和心室組織TMEM16A mRNA水平分別為(3.55±0.17)和(1.00±0.03)，大鼠心房組織中TMEM16A及其mRNA水平高于心室組織(P<0.01)。結(jié)論 CaCCs TMEM16A在大鼠心房和心室組織中均有表達(dá)，其在心房組織中的水平高于心室組織。

TMEM16A；鈣激活氯通道；心房；心室

張愛梅，姜曉霞，陳鑫，等.鈣激活氯通道TMEM16A在大鼠心房和心室中的表達(dá)差異[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4495-4498.[www.chinagp.net]

ZHANG A M,JIANG X X,CHEN X,et al.Differences in the expression of calcium-activated chloride channels TMEM16A in rat atria and ventricles[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4495-4498.

鈣激活氯通道(calcium-activated chloride channels,CaCCs)是一類具有重要生理功能的離子通道，參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞分泌、感覺傳導(dǎo)、神經(jīng)元和心肌細(xì)胞興奮性以及血管舒縮活動等多種生理過程[1]。盡管CaCCs在生理、病理中均發(fā)揮重要作用，但由于其缺乏特異性阻斷劑，使得無法對其分子機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。TMEM16A廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞上，其介導(dǎo)的鈣激活氯電流〔calcium-activated chloride currents,ICl(Ca)〕具有典型的Ca2+濃度依賴性和電壓依賴性，當(dāng)Ca2+濃度較低時，其表現(xiàn)出明顯的外向整流特性；當(dāng)Ca2+濃度較高時，沒有整流特性，I-V曲線呈線性。TMEM16A介導(dǎo)的ICl(Ca)的生物物理特征與經(jīng)典的ICl(Ca)相似，因此，TMEM16A被認(rèn)為是CaCCs蛋白基礎(chǔ)[2-4]。隨后的研究表明在腺泡細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、Cajal間質(zhì)細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞均能檢測到TMEM16A的表達(dá)，并且作為CaCCs的分子基礎(chǔ)，發(fā)揮重要作用[5]。

目前關(guān)于TMEM16A在心臟組織的表達(dá)與分布以及如何參與調(diào)節(jié)心肌組織正常生理過程及病理活動的報道較少，本研究旨在初步探討TMEM16A在正常大鼠心房和心室組織的表達(dá)與分布，為進(jìn)一步研究CaCCs在心臟中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley大鼠18只，8～10周齡，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g(新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供)，許可證編號SCXK新2003-0001。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol(美國Life-invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific Fermentas公司)，QuantiFastTMSYBR?Green PCR(德國Qiagen公司)，TMEM16A上下游引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，RIPA裂解液(北京索來寶科技有限公司)，兔多克隆TMEM16A抗體(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔二抗及β-actin一抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)和Western blotting操作中全套設(shè)備均來自Bio-Rad公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 心房和心室組織的取材與分離 2014年10月—2015年9月，將18只清潔級Sprague-Dawley大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用10%水合氯醛溶液0.3 mg/kg腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，迅速取下完整心臟，置于PBS中反復(fù)沖洗，待將殘留的血液清洗干凈后，剪去與心房和心室相連的動靜脈以及附著于其上的各種筋膜組織，充分暴露潔凈的心房、心室組織后，沿房室溝將心房與心室分離，并置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Western blotting法檢測TMEM16A水平 取分離好的心房、心室組織各100 mg，采用RIPA裂解液按試劑盒說明提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為40 μg/孔,β-actin作為內(nèi)參照蛋白。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)100 V，2 h)，用5%脫脂牛奶、TBST封閉2 h。加兔抗鼠多克隆抗體TMEM16A(1∶200)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜(5 min×3次)，加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶20 000)室溫震搖孵育2 h，洗膜后(5 min×3次)加ECL顯色曝光。將膠片掃描后用Image J圖像分析軟件進(jìn)行各條帶灰度值測定，與相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值相比得出蛋白的相對表達(dá)量，即TMEM16A水平。實驗獨立重復(fù)6次。

1.3.3 RT-qPCR法檢測TMEM16A mRNA水平 取分離好的心房、心室組織各100 mg，以Trizol試劑提取總RNA。經(jīng)Nanodrop分光光度計檢測RNA的濃度與純度。參照Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)QuantiFastTMSYBR?Green PCR試劑盒說明書配置25 μl反應(yīng)體系，使用ABI7300實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s,57 ℃退火30 s,40個循環(huán)；每次循環(huán)后收集熒光信號生成擴(kuò)增曲線，反應(yīng)結(jié)束后生成溶解曲線。采用2-ΔΔCt法計算TMEM16A mRNA水平。實驗獨立重復(fù)6次。目的基因為TMEM16A，管家基因為β-actin，引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 大鼠心房和心室組織TMEM16A水平比較 大鼠心房和心室組織TMEM16A水平分別為(0.46±0.02)和(0.33±0.03)，大鼠心房組織TMEM16A水平高于心室組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.834，P<0.01，見圖1)。

圖1 大鼠心房和心室組織TMEM16A水平的電泳圖

Figure1ExpressionofTMEM16Aproteininratatrialandventriculartissueshowninanelectrophorogram

2.2 大鼠心房和心室組織TMEM16A mRNA水平比較 大鼠心房和心室組織TMEM16A mRNA水平分別為(3.55±0.17)和(1.00±0.03)，大鼠心房組織TMEM16A mRNA水平高于心室組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-21.473，P<0.01)。

3 討論

CaCCs是心臟中最主要的氯通道之一，與心肌組織各種電生理學(xué)活動密切相關(guān)[6]。生理狀態(tài)下參與心肌細(xì)胞動作電位的早期復(fù)極過程，而CaCCs的異?；顒涌蓪?dǎo)致心律失常[7-8]。既往研究表明，在多種哺乳動物的心房、心室組織中均檢測出CaCCs介導(dǎo)的ICl(Ca)[9]。在正常的心臟組織中，由于靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣離子(intracellular Ca2+，[Ca2+]i)濃度低，ICl(Ca)對舒張期膜電位和動作電位時程(action potential duration，APD)沒有影響，當(dāng)[Ca2+]i濃度持續(xù)增加超過生理水平時，CaCCs產(chǎn)生顯著的瞬時外向電流，隨著[Ca2+]i濃度時間進(jìn)程逐漸衰減，ICl(Ca)能引起動作電位1期的早期去極化，從而縮短APD。當(dāng)心肌組織出現(xiàn)Ca2+超載時，CaCCs介導(dǎo)的ICl(Ca)能夠產(chǎn)生致心律失常的瞬時內(nèi)向電流(inward current，ITI)。ITI能夠誘導(dǎo)延遲后除極(delayed after depolarization，DAD)的發(fā)生，這是誘導(dǎo)激發(fā)異常電活動的重要機(jī)制。但也有學(xué)者認(rèn)為這種引起動作電位1期的早期去極化的瞬時外向電流不是ICl(Ca)，而是鈣激活的鉀電流(Ca2+-activated K+currents)[10]?？傊?，由于多數(shù)情況下CaCCs介導(dǎo)的氯離子電流常和其他鈣依賴性陽離子電流及非鈣依賴性氯離子電流同時存在，這使得迄今對其在相關(guān)生理過程中所起的具體作用仍然知之甚少。

TMEM16A作為CaCCs的分子基礎(chǔ)，成為近年來的研究熱點。研究表明TMEM16A在機(jī)體的各種組織中被廣泛表達(dá)，在人和其他動物的心臟、肺、肝臟、骨骼肌等部位均檢測到TMEM16A mRNA[11]，并參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理、病理過程，如傷害感受、上皮細(xì)胞分泌、神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、平滑肌收縮、宿主防御、細(xì)胞增殖等[12-13]。

TMEM16A與心血管系統(tǒng)的關(guān)系密切，該通道蛋白廣泛分布于人類和其他哺乳動物各級動脈中，在胸主動脈、頸動脈及腦動脈中均發(fā)現(xiàn)了TMEM16A的表達(dá)，隨后通過對不同部位的血管平滑肌細(xì)胞上的TMEM16A表達(dá)水平進(jìn)行測定比較，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平亦存在差異[14]。有研究表明，TMEM16A在大動脈的血管平滑肌細(xì)胞上表達(dá)水平較高，在中動脈血管及較大的小動脈平滑肌細(xì)胞上(如腸系膜動脈分支)低表達(dá)或不表達(dá)，其介導(dǎo)的ICl(Ca)很小甚至消失，但在小動脈的間質(zhì)細(xì)胞及周細(xì)胞上TMEM16A的表達(dá)水平很高，其介導(dǎo)的ICl(Ca)也異常增大[15]。另有研究顯示TMEM16A表達(dá)下調(diào)可以降低血管外周阻力，從而降低高血壓的發(fā)生率[16]。最新研究顯示，在小鼠左心室組織和左心室心肌細(xì)胞上均檢測到了TMEM16A的表達(dá)[17]。隨后在心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)TMEM16A介導(dǎo)的ICl(Ca)激活與進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度呈正相關(guān)[18]，這一點與CaCCs介導(dǎo)的ICl(Ca)動力學(xué)特性一致[19]。本研究發(fā)現(xiàn)TMEM16A在大鼠心室組織上亦有表達(dá)，且大鼠心房組織中TMEM16A及其mRNA水平均高于心室組織，這與GILES等[20]對兔心房、心室組織的研究得出的經(jīng)典的ICl(Ca)在心房中比心室中大的結(jié)論相一致，推測這種表達(dá)差異可能與心房肌細(xì)胞和心室肌細(xì)胞本身在心臟組織中的電生理活動及其產(chǎn)生機(jī)制不同有關(guān)。

綜上所述，大鼠心房組織CaCCs TMEM16A及其mRNA水平較心室組織高，這為進(jìn)一步研究TMEM16A激活后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及TMEM16A在心臟電生理活動的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為臨床治療心肌缺血、心律失常以及心力衰竭等疾病提供了新的治療靶點。

作者貢獻(xiàn)：張愛梅進(jìn)行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負(fù)責(zé)；姜曉霞、陳鑫、官曉筠、萬慧娟、李麗、馬克濤進(jìn)行實驗實施、評估、資料收集；司軍強(qiáng)進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

本研究不足之處：

未將心房組織和心室組織做進(jìn)一步的分組，無法判斷左右心房、左右心室之間TMEM16A是否存在表達(dá)差異。

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(本文編輯：毛亞敏)

Differences in the Expression of Calcium-activated Chloride Channels TMEM16A in Rat Atria and Ventricles

ZHANG Ai-mei,JIANG Xiao-xia,CHEN Xin,GUAN Xiao-jun,WAN Hui-juan,LI Li,MA Ke-tao,SI Jun-qiang.

Department of Physiology,Shihezi University School of Medicine；Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education;the First Affiliated Hospital of the Medical College,Shihezi University,Shihezi 832002,China

SI Jun-qiang,Department of Physiology,Shihezi University School of Medicine；Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education,Shihezi 832002,China；E-mail:sijunqiang@shzu.edu.cn

Objective To explore the expression of calcium activated chloride channel (CaCCs) TMEM16A in rat atrial and ventricular tissues,so as to provide a new therapeutic target for clinical treatment of myocardial ischemia,arrhythmia and heart failure.Methods From October 2014 to September 2015，18 clean grade Sprague-Dawley rats were given 1 week of adaptive feeding,then,the heart was taken out after intraperitoneal injection of 10% chloral hydrate,and the atrial and ventricular tissues were isolated.The expression of TMEM16A and its mRNA in atrial and ventricular tissues were detected by Western blotting methods and real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR),respectively.Results The expression levels of TMEM16A in the rat atrial tissues were higher than those in the ventricular tissues〔(0.46±0.02) vs. (0.33±0.03),P<0.01〕.The expression levels of TMEM16A mRNA in the rat atrial tissues were higher than those in the ventricular tissues〔(3.55±0.17) vs. (1.00±0.03),P<0.01〕.Conclusion TMEM16A CaCCs was expressed in both atrial and ventricular tissues of rats,and the expression level in the atrial tissue was higher than that in the ventricular tissue.

TMEM16A；Calcium-activated chloride channels； Heart atrial ；Heart ventricles

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃項目)(2012CB26600)

832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室(張愛梅，萬慧娟，李麗，馬克濤，司軍強(qiáng))；石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(張愛梅，姜曉霞，陳鑫，官曉筠)

司軍強(qiáng)，832002新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室 新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室；

E-mail:sijunqiang@shzu.edu.cn

R 331

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.018

2016-05-06；

2016-10-26)