李增清，楊東新，周 真，趙小琴，趙 慧，謝丹宇，郭素華，胡兢晶，王 波

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·論著·

白介素6受體基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關(guān)聯(lián)研究

李增清，楊東新，周 真，趙小琴，趙 慧，謝丹宇，郭素華，胡兢晶，王 波

背景 有研究證實(shí)，白介素6受體(IL-6R)基因中的rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘易患性顯著相關(guān)，但尚無評(píng)估rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性在漢族兒童中分布情況及其與血清IgE水平相關(guān)性的研究。目的 研究IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關(guān)系。方法 選取2013—2014年于廣東省婦幼保健院兒科就診的哮喘患兒410例為哮喘組，同期選取廣東省婦幼保健院住院的非哮喘患兒513例為對(duì)照組。提取兩組患兒基因組DNA，采用SNaPshot法對(duì)IL-6R基因rs4129267、rs527236128位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)兩組患兒血清總IgE水平。結(jié)果 兩組患兒rs4129267位點(diǎn)和rs527236128位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.264、2.135，P>0.05)。兩組患兒rs4129267位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患兒rs527236128位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素(P<0.05)。對(duì)照組患兒血清總IgE水平低于哮喘組(P<0.05)。對(duì)照組、哮喘組組內(nèi)不同基因型患兒血清總IgE水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組(P<0.05)。結(jié)論 IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性有關(guān)，而與哮喘患兒血清IgE水平無關(guān)。

哮喘；疾病易感性；兒童；漢族；免疫球蛋白E；受體,白細(xì)胞介素6；多態(tài)性,單核苷酸

李增清，楊東新，周真，等.白介素6受體基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性及血清IgE水平的關(guān)聯(lián)研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4474-4477.[www.chinagp.net]

LI Z Q,YANG D X,ZHOU Z,et al.Correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma susceptibility and serum IgE level of Han Chinese children[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4474-4477.

支氣管哮喘(bronchial asthma)是兒科常見的呼吸道疾病之一，其主要病理生理過程包括慢性可逆性氣道阻塞、氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。近年來，哮喘在兒童中的發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢(shì)，此外，兒童哮喘也給患兒家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，其帶來的直接、間接醫(yī)療費(fèi)用超過了艾滋病和結(jié)核病的總和[1]。因此，加強(qiáng)兒童哮喘的防治工作是當(dāng)前臨床工作的重點(diǎn)。目前，隨著人類基因組研究的深入，研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)白介素6受體(IL-6R)、白介素13(IL-13)等基因多態(tài)性與兒童哮喘易患性相關(guān)[2]。IL-6R是一種在哮喘發(fā)病過程中扮演重要角色的細(xì)胞因子，可以通過促進(jìn)輔助性T細(xì)胞(Th)17分化與增殖，參與炎性損傷過程，并產(chǎn)生多方面的生物學(xué)作用。有報(bào)道顯示，IL-6R基因中的rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘易患性有關(guān)[3]，但迄今未見針對(duì)IL-6R基因多態(tài)性在漢族兒童中分布的臨床報(bào)道，也未見其與哮喘相關(guān)血清IgE水平的相關(guān)性研究。本研究擬納入漢族哮喘患兒和非哮喘患兒作為研究對(duì)象，探討IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性在漢族兒童分布及其與漢族兒童哮喘發(fā)病及血清總IgE水平之間的可能關(guān)系，從遺傳學(xué)方面揭示兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013—2014年于廣東省婦幼保健院兒科門診和住院的哮喘患兒410例為哮喘組，其中男287例，女123例；年齡3～12歲，平均年齡(6.5±1.8)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2008年兒童哮喘診治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)漢族；(3)存在哮喘家族史；(4)變應(yīng)原皮試點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)至少1項(xiàng)陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>14歲；(2)臨床資料不齊全。同期選取廣東省婦幼保健院住院的非哮喘患兒513例為對(duì)照組，其中男362例，女151例；年齡3～12歲，平均年齡(6.7±1.7)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床診斷排除兒童支氣管哮喘；(2)無個(gè)人及家族哮喘史；(3)無濕疹、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等反復(fù)發(fā)作的過敏性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)罹患反復(fù)發(fā)作的過敏性疾??；(2)罹患慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)病、支氣管擴(kuò)張等肺部疾?。?3)臨床資料不齊全。兩組患兒性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.256，P=0.106；t=1.203，P=0.094)?；純壕鶠闈h族，相互間無血緣關(guān)系，患兒和/或其監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情，并自愿簽署知情同意書。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA 抽取兩組患兒空腹靜脈血3 ml，并用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2K)抗凝。采用Qiagen Blood試劑盒(購自德國QIAGEN公司)提取基因組DNA；檢測(cè)DNA純度和濃度，若OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2.0，則DNA純度合格，可以進(jìn)行后續(xù)研究，否則需重新提取基因組DNA。提取DNA樣本后將其置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 檢測(cè)目的基因分型 采用SNaPshot法對(duì)IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)(位置1:154453788)進(jìn)行基因分型，同時(shí)選擇同一條染色體上rs527236128位點(diǎn)(位置1:94001851)進(jìn)行對(duì)照。采用在線技術(shù)多重引物設(shè)計(jì)軟件MALDI-TOF MS和MassARRAY Assay Designer 3.1軟件包設(shè)計(jì)PCR引物序列，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，rs4129267位點(diǎn)上游引物為5′-CCAGTCTATCGAAGAAATC-3′，下游引物為5′-GATTTCGCTATCTAGACGGA-3′；rs527236128位點(diǎn)上游引物為5′-TCGGCCCACTAAACGGTTAT-3′，下游引物為5′-GCCACGCTACTGCGTGTTTGA-3′。反應(yīng)體系為40 μl，其中10×PCR Buffer 4 μl、MgCl2(50 mmol/L)1.5 μl、dNTP(10 mmol/L)1.0 μl、上下游引物各1.0 μl、模板DNA 2 μl、Taq酶(5 U)0.4 μl、雙蒸水(ddH2O)29.0 μl；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。采用SNaPshot法處理擴(kuò)增產(chǎn)物，再利用ABI公司的ABI3730測(cè)序儀和GeneMapper 4.0軟件對(duì)上述2個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。主要/次要等位基因?yàn)镃/T，風(fēng)險(xiǎn)等位基因?yàn)門，基因分型檢出率為99.5%。

1.2.3 檢測(cè)血清總IgE水平 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)兩組患兒血清總IgE水平，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 基因型頻率和等位基因頻率比較 兩組患兒rs4129267位點(diǎn)和rs527236128位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=3.264、2.135，P>0.05)。兩組患兒rs4129267位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。兩組患兒rs527236128位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表1 兩組患兒rs4129267位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table1Comparisonofgenotypefrequencyandallelefrequencyofrs4129267betweenthetwogroups

組別例數(shù)基因型TT CT CC等位基因C T對(duì)照組51357(111)210(409)246(480)702(684)324(316)哮喘組41059(144)170(415)181(441)532(649)288(351)χ2值834510241P值00430010

表2 兩組患兒rs527236128位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table 2 Comparison of genotype frequency and allele frequency of rs4129267 between the two groups

組別例數(shù)基因型TT CT CC等位基因C T對(duì)照組513110(214)205(400)198(386)601(586)425(414)哮喘組41087(212)163(398)160(390)483(589)337(411)χ2值28742556P值02680376

2.2 兒童哮喘危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 以組別為因變量(賦值：對(duì)照組=0，哮喘組=1)，rs4129267位點(diǎn)基因型(賦值：CC=0，CT=1，TT=2)、等位基因(賦值：C=0，T=1)為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素(P<0.05，見表3)。

2.3 血清總IgE水平比較

2.3.1 兩組患兒血清總IgE水平比較 對(duì)照組患兒血清總IgE水平為(12.1±7.7)mg/L，低于哮喘組〔(17.4±7.2)mg/L〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.892，P=0.012)。

2.3.2 兩組不同基因型患兒血清總IgE水平比較 對(duì)照組、哮喘組組內(nèi)不同基因型患兒血清總IgE水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表4)。

表3 兒童哮喘危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

Table 3 Results of Logistic regression analysis of risk factors of pediatric asthma

變量BSEWaldχ2值P值OR值95%CI常數(shù)項(xiàng)-00022674123710865--基因型 TT10640356903600212898(1967，3589) CT02370814700400661268(0897，1625)等位基因 T02780641857100641321(0921，1754)

注：-為無此項(xiàng)

Table4ComparisonoftotalserumIgElevelinpatientswithdifferentgenotypesbetweenthetwogroups

組別例數(shù)基因型TT CT CCF值P值對(duì)照組513131±83125±52101±3200500245哮喘組410183±74174±53176±4807500156t值317822342412P值000300340046

3 討論

近年來，兒童哮喘的發(fā)病率逐漸增高[2,4]，統(tǒng)計(jì)顯示，美國兒童哮喘的患病率每10年上升50%[1,5]，因此，進(jìn)一步探索發(fā)病機(jī)制是兒童哮喘研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。遺傳和環(huán)境因素共同導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，而變應(yīng)性呼吸道慢性炎癥是哮喘發(fā)生時(shí)最基本的病理特征[4]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，Th1/Th2平衡被打破，具體表現(xiàn)為Th2亞群數(shù)目增加或功能亢進(jìn)，伴或不伴Th1亞群數(shù)目減少或功能低下，而在這一過程中，包括IL-6在內(nèi)的多種細(xì)胞因子在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[6]。研究證實(shí)，IL-6能夠活化B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞，在哮喘急性期時(shí)調(diào)控前列腺素等炎性遞質(zhì)的合成和分泌，并誘導(dǎo)血清中抗體水平升高，激活I(lǐng)L-4對(duì)IgE的誘導(dǎo)作用，而IL-6的生物學(xué)作用的發(fā)揮主要依靠IL-6R[6-7]。近年來臨床研究證實(shí)，IL-6R基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是位于IL-6R基因2號(hào)內(nèi)含子的rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘相關(guān)性更強(qiáng)[7]。但是目前臨床研究仍集中在IL-4R、IL-18等基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與哮喘發(fā)病的相關(guān)性[6]，而IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘發(fā)病及易患性之間的關(guān)聯(lián)性未見報(bào)道，因此本研究對(duì)此進(jìn)行探討。

鑒于已有一些研究指出，SNP與不同地域兒童哮喘易患性的關(guān)聯(lián)性并不一致，如IL-13上rs1295686位點(diǎn)與東北、武漢、包頭等地區(qū)漢族兒童哮喘發(fā)作有關(guān)，但與上海地區(qū)漢族兒童哮喘發(fā)作無關(guān)[8-9]。筆者推測(cè)，造成這種結(jié)果差異的原因可能與研究人群的遺傳結(jié)構(gòu)、研究人群樣本體積、疾病臨床診斷異質(zhì)性、研究地點(diǎn)人群分層等混雜因素有關(guān)。因此本研究選擇染色體定位與IL-6R基因距離較遠(yuǎn)且與哮喘無關(guān)的rs527236128位點(diǎn)作為對(duì)照位點(diǎn)進(jìn)行分析。本研究結(jié)果顯示，兩組患兒rs4129267位點(diǎn)和rs527236128位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，表明此兩個(gè)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率處于遺傳平衡穩(wěn)定狀態(tài)，提示研究結(jié)果較為可靠；兩組患兒rs4129267位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率有明顯差異，兩組患兒rs527236128位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率無明顯差異，表明IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性有關(guān)，其T等位基因能夠增加哮喘發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，且可以初步排除研究樣本人群分層對(duì)本研究結(jié)果的影響。FERREIRA等[3]對(duì)2 669例哮喘患者及4 528例對(duì)照者進(jìn)行的一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)結(jié)果顯示，IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)是誘發(fā)哮喘的危險(xiǎn)位點(diǎn)，認(rèn)為其是哮喘發(fā)作的危險(xiǎn)因素之一，本研究結(jié)果與其一致。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，TT基因型是兒童哮喘的影響因素，提示攜帶 rs4129267位點(diǎn)T等位基因純合子的兒童出現(xiàn)哮喘的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。此外，本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組患兒血清總IgE水平低于哮喘組，對(duì)照組、哮喘組不同基因型患兒組內(nèi)血清總IgE水平無差異，對(duì)照組各基因型患兒血清總IgE水平均低于哮喘組，提示突變T等位基因可能與哮喘患者高血清總IgE水平無關(guān)。這一結(jié)果也與IL-4基因SNP等其他基因多態(tài)性研究的結(jié)論是極為相似的[10]。

由于本研究選擇的研究人群為漢族兒童，因此本研究結(jié)果僅適應(yīng)于中國漢族哮喘患兒。同時(shí)本研究?jī)H檢測(cè)了IL-6R基因編碼區(qū)一個(gè)rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)聯(lián)性，并不能簡(jiǎn)單地認(rèn)為rs4129267位點(diǎn)是真正的兒童哮喘致病位點(diǎn)之一，今后應(yīng)進(jìn)一步增加基因位點(diǎn)的研究數(shù)量，并擴(kuò)大樣本量，以進(jìn)一步深入探討；而且IL-6R基因編碼區(qū)是否存在其他多態(tài)性位點(diǎn)與漢族兒童哮喘或其他類型變態(tài)反應(yīng)性疾病有關(guān)也有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，IL-6R基因rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與漢族兒童哮喘易患性具有關(guān)，而與哮喘患兒高血清總IgE水平無關(guān)。本研究也為進(jìn)一步分析rs4129267位點(diǎn)多態(tài)性與兒童哮喘的具體發(fā)病機(jī)制提供循證依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：李增清進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；楊東新、趙小琴、趙慧、謝丹宇、郭素華、胡兢晶、王波進(jìn)行試驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；周真進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Correlation between rs4129267 Polymorphism on IL-6R Gene and Pediatric Asthma Susceptibility and Serum IgE Level of Han Chinese Children

LI Zeng-qing,YANG Dong-xin,ZHOU Zhen,ZHAO Xiao-qin,ZHAO Hui,XIE Dan-yu,GUO Su-hua,HU Jing-jing,WANG Bo.

Department of Pediatrics,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,China

ZHOU Zhen,Department of Pediatrics,Guangdong Women and Children Hospital,Guangzhou 511400,China:E-mail:zhouzhen527@163.com

Background Research has confirmed the significant correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma suseptibility,but currently,the distribution of rs4129267 polymorphism among Han Chinese children and its correlation with serum IgE level have not been studied.Objective To investigate the correlation between rs4129267 polymorphism on IL-6R gene and pediatric asthma susceptibility and serum IgE level of Han Chinese children.Methods 410 asthma children from Department of Pediatrics of Guangdong Women and Children Hospital were selected as asthma group from 2013 to 2014.513 non asthma children in the same hospital were selected as control group during the same period.The DNA samples of two groups were extracted.Then the sites of rs4129267 and rs527236128 at IL-6R gene were genotyped by SNaPshot method.The total serum IgE level of two groups was determined by ELISA.Results The genetic distributions of rs4129267 and rs527236128 were accorded with Hardy-Weinberg equilibrium (χ2=3.264,2.135,P>0.05).The genotype frequency and allele frequency of rs4129267 were significantly different between the two groups (P<0.05).The genotype frequency and allele frequency of SNP rs527236128 were not significantly different between the two groups (P>0.05).The Logistic regression result showed that TT genotype was the risk factor to pediatric asthma (P<0.05).The total serum IgE level of control group was lower than that of asthma group (P<0.05).There was no significant difference in the total serum IgE level among different genotypes in two groups (P>0.05).The total serum IgE levels at all kinds of genotypes of control group were lower than those of asthma group (P<0.05).Conclusion rs4129267 polymorphisms on IL-6R gene is related to pediatric asthma suseptibility in Han Chinese children,but is not related to their serum IgE levels.

Asthma；Disease susceptibility；Child；Han nationality；Immunoglobulin E；Receptors,interleukin-6；Polymorphism,single nucleotide

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(s2013010012670)

511400 廣東省廣州市，廣東省婦幼保健院 廣東省兒童醫(yī)院 廣東省婦產(chǎn)醫(yī)院兒科

周真，511400 廣東省廣州市，廣東省婦幼保健院 廣東省兒童醫(yī)院 廣東省婦產(chǎn)醫(yī)院兒科;E-mail：zhouzhen527@163.com

R 562.25

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.014

2016-02-16；

2016-07-08)