安 樂，趙秋云，覃裴溪，翁茂洋，陳 蕾，柯金鵬，張為民，卿素珠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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太白蓼多糖的硫酸化修飾及其體外抑菌活性分析

安 樂，趙秋云，覃裴溪，翁茂洋，陳 蕾，柯金鵬，張為民，卿素珠

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

建立并優(yōu)選太白蓼多糖(PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide ,PTKP)硫酸化修飾的條件，探討硫酸化修飾對太白蓼多糖抑菌活性的影響。以硫酸根取代度為指標(biāo)，采用氯磺酸-吡啶法對太白蓼多糖進行修飾，以氯磺酸-吡啶比、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度為因素水平，采用L9(34)正交試驗對修飾條件進行優(yōu)選。用氯化鋇-明膠濁度法測定修飾產(chǎn)物的硫酸基取代度(DS)，傅里葉紅外變幻光譜法測其結(jié)構(gòu)，微量法測定硫酸化太白蓼多糖(sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,sPTKP)對大腸桿菌和志賀氏菌的最小殺菌濃度。太白蓼多糖硫酸化修飾的最佳條件為氯磺酸與吡啶體積比為1∶10，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為1 h，sPTKP的硫酸基取代度為1.57。紅外光譜檢測到S=O的伸縮振動峰。PTKP和sPTKP對大腸桿菌和志賀氏菌均有抑制作用，它們對志賀氏菌的抑制作用優(yōu)于大腸桿菌。 硫酸化修飾能提高太白蓼多糖對大腸桿菌和志賀氏菌的體外抑菌活性。

太白蓼多糖；硫酸化修飾； 正交試驗； 體外抑菌

中藥多糖具有重要的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗癌、抗糖化、抗炎等免疫藥理學(xué)作用，且毒副作用小、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性[1]。近年來的研究顯示，中藥多糖經(jīng)分子修飾后其藥理活性有所增強，而硫酸化修飾是中藥多糖分子修飾方法中應(yīng)用最廣泛的，也是最普遍的一種修飾方法。目前，一般采用氯磺酸-甲酰胺[2]、氯磺酸-吡啶法(Wolfrom法)[3]、濃硫酸法[4]、三氧化硫-吡啶法[5]、三氧化硫-三甲胺鹽[6]等對中藥多糖的支鏈殘基進行硫酯化修飾。研究表明，經(jīng)硫酸化分子修飾后，中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等生物活性明顯增強[7]。

太白蓼(PolygonumtaipaishaneaseKung)，又名大紅粉，為陜西特有中草藥資源之一，始載于“圖經(jīng)本草”，屬于太白“七藥”之一[8]，太白蓼的根莖具有清熱解毒、止血等功效，民間常用于治療瘧疾腹瀉、吐血、血崩、白帶、外傷出血等病癥。張為民等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，太白蓼乙酸乙酯部位(PTKE)及其分離物EB對雞新城疫病毒在雞胚成纖維細胞的增殖具有抑制作用，并對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、多殺性巴氏桿菌和無乳鏈球菌均有一定的體外抑制作用；進一步研究[10]證實，太白蓼乙酸乙酯提取物具有明顯的抗腹瀉和抗炎作用，促進雛雞免疫器官發(fā)育及淋巴細胞的增殖，具有一定的體外抑制大腸埃希菌和沙門氏菌的作用，并對新城疫病毒在雞胚內(nèi)增殖具有一定的抑制作用。體外試驗結(jié)果[11]證實，太白蓼提取物對豬傳染性胃腸炎病毒在豬睪丸細胞(ST)內(nèi)增殖具有顯著的體外抑制作用。梁波等[12]的研究表明，太白蓼揮發(fā)油對所選的大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等8種細菌具有一定的體外抑制作用。而有關(guān)太白蓼多糖的分子修飾及分子修飾后藥理作用等方面的研究尚未見報道。本試驗采用氯磺酸-吡啶法對太白蓼多糖(PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,PTKP)進行硫酸化修飾，正交試驗對修飾條件進行優(yōu)化，傅立葉紅外光譜測定修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并通過體外抑菌試驗觀察硫酸化太白蓼多糖(sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide,sPTKP)對大腸桿菌與志賀氏菌的抑制作用，為太白蓼資源的開發(fā)和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試中藥 太白蓼塊根由陜西省眉縣金渠藥材分公司太白山草藥研究所衛(wèi)拉船中藥師鑒定并提供。

1.1.2 供試細菌 大腸埃希菌(E.coli)和志賀氏菌(Shigellosis)由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)微生物實驗室從患乳房炎奶牛乳汁中分離、鑒定并保存。

1.1.3 主要儀器與試劑 試驗用儀器有循環(huán)水多用真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、自動平衡離心機、冷凍干燥機、紫外分光光度計、傅立葉紅外光譜儀。

所用藥劑有氯磺酸、葡萄糖、明膠、苯酚、吡啶、乙酸、氯化鋇、濃鹽酸、硫酸鉀、三氯乙酸、無水甲酰胺和氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 太白蓼多糖的制備 太白蓼多糖的提取(水煎醇沉法)：將太白蓼粉碎，稱取116.5 g，加蒸餾水煎煮2～3次，每次煎煮時間為20 min，趁熱用紗布過濾除去藥渣，合并濾液，減壓濃縮至145 mL；濃縮濾液經(jīng)5 000 r/min離心15 min，取上清液，加入無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)最終達到80%，靜置過夜后過濾，棄去濾液，所得沉淀物加熱烘干即得PTKP粗品。用下式計算PTKP的得率：PTKP得率=多糖質(zhì)量/太白蓼樣品質(zhì)量×100%

多糖濃度的檢測：得到的PTKP采用苯酚-硫酸法[13]檢測多糖的濃度。

1.2.2 正交試驗優(yōu)化氯磺酸-吡啶法制備硫酸化太白蓼多糖 硫酸化反應(yīng)各因素水平的確立 根據(jù)文獻[13]，反應(yīng)溫度、試劑比例、反應(yīng)時間對修飾的影響較大，因此選取反應(yīng)溫度(A)、氯磺酸與吡啶的配比(B)和反應(yīng)時間(C)為因素，確立3個水平，見表1。

sPTKP的制備：將帶有攪拌和冷凝裝置的三頸燒瓶置冰鹽浴中，按照表1設(shè)定的試劑配比加入預(yù)冷的無水吡啶50 mL，攪拌使之冷卻，再將氯磺酸40 min內(nèi)逐滴加入，共制得9種酯化試劑。稱取500 mg的PTKP置于100 mL的無水甲酰胺中攪拌均勻，加入酯化試劑，按表1設(shè)定的反應(yīng)時間和溫度在水浴中攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物加入到100 mL預(yù)冷的蒸餾水中，用質(zhì)量分數(shù)為0.5 %的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，用3倍體積的無水乙醇沉淀靜置24 h。取沉淀裝入透析袋，用自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析液經(jīng)冷凍干燥得sPTKP，共9種。

表1 正交試驗篩選制備sPTKP的條件

1.2.3 sPTKP的鑒定 硫酸基的定性：采用傅立葉變換紅外光譜法。PTKP硫酸化修飾后結(jié)構(gòu)上具有特殊的C-O-S和C-O-SO3基團，取多糖各3 mg，采用常規(guī)KBr 壓片法,在紅外光譜儀上測定4 000～400 cm-1的紅外光譜，分析光譜圖。

硫的定量(氯化鋇-明膠法)： 采用氯化鋇-明膠濁度法[13]測定樣品的硫酸根含量。硫酸基取代度(degree of sulfation,DS)是指多糖中每個糖單位上的活性羥基被硫酸根所取代的數(shù)量，按下式計算：DS= (1.62×S% ) / (32-1.02×S%)，其中S%為硫質(zhì)量分數(shù)。

1.2.4 PTKP和sPTKP的體外抑菌試驗 瓊脂擴散法抑菌試驗：將PTKP和sPTKP分別配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，并以滅菌生理鹽水作為空白對照。在無菌條件下，用滅菌L型玻璃棒將各種細菌均勻涂抹在直徑為90 mm的瓊脂平板上，用直徑為4 mm的打孔器打孔，分別在孔內(nèi)加入滅菌生理鹽水、PTKP和sPTKP，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測定不同供試液的抑菌圈直徑。重復(fù)3次，取平均值。

最小殺菌質(zhì)量濃度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)的測定：將PTKP和sPTKP分別配成質(zhì)量濃度為80 mg/mL的藥液。采用2倍稀釋法，在無菌條件下，取無菌試管11支(規(guī)格為15 mm × 100 mm)，每管加入肉湯1 mL，在第1管中加入藥液1 mL，連續(xù)倍比稀釋到第8管，并從第8管棄去1 mL。第9、10、11管分別為藥物對照組(不加細菌)、細菌生長對照組(不加藥液)和肉湯對照組(不加細菌和藥物)。除第9和11管外，其余每管均加入細菌懸液25 μL。接種完成后，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)3次。吸取各試管培養(yǎng)液各100 μL，用滅菌L型玻璃棒將細菌均勻涂抹到瓊脂平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，以菌落數(shù)不超過5個的最低提取物質(zhì)量濃度為該提取物的MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 太白蓼多糖濃度測定結(jié)果

用水煎醇沉法提取太白蓼，所用太白蓼為116.5 g，所提取得到的太白蓼多糖為15.3 g，多糖的得率為13.1%。在490 nm處測各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，回歸處理得直線方程為y=3.031 4x-0.011 9,R2= 0.970 8。0.06 g/L 的PTKP溶液在490 nm處的吸光度值為0.141。計算得PTKP的質(zhì)量分數(shù)為88.6%。

2.2 正交試驗結(jié)果

2.2.1 sPTKP硫酸基取代度的測定 在紫外可見分光光度計下，測定各硫酸鉀標(biāo)準(zhǔn)管在360 nm處的吸光度，以硫酸根質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度A為縱坐標(biāo)(y)，回歸處理0得直線方程為y=2.065 0x-0.015 4,R2=0.997 1。見圖1。 2.2.2 正交試驗優(yōu)化氯磺酸-吡啶法制備硫酸化太白蓼多糖的結(jié)果 以溫度、氯磺酸與吡啶比率、反應(yīng)時間為因素進行正交試驗，結(jié)果如表2所示。

圖1 硫酸根質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 正交試驗篩選制備sPTKP的結(jié)果

由表2可以看出，各因素的作用表現(xiàn)為C> A > B，即時間對硫酸基取代度影響最大，其次是反應(yīng)溫度和酯化試劑比率。由K值可知最佳組合為A2B3C1。因此，確定最佳的硫酸酯化工藝條件為：酯化試劑體積比為1∶10，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為1 h。

2.3 紅外光譜測定結(jié)果

PTKP和sPTKP的傅里葉紅外光譜掃描結(jié)果見圖2和圖3。由圖可知，在PTKP紅外光譜的3 600～3 200 cm-1處有1個OH的伸縮震動吸收峰，1 400～100 cm-1處有C-H震動吸收峰，證明樣品是多糖；在sPTKP的紅外光譜上，除了有多糖的吸收特征外，還有1個特征吸收峰，1個在1232.57 cm-1為不對稱S=O伸縮震動引起的，證明硫酸基已經(jīng)被酯化到太白蓼多糖上。

圖2 PTKP紅外光譜

2.4 體外抑菌試驗結(jié)果

通過瓊脂擴散法可知PTKP和sPTKP對大腸桿菌和志賀氏菌均有抑制作用，PTKP和sPTKP對志賀氏菌的抑制作用高于大腸桿菌，且sPTKP對受試菌株的抑制作用高于PTKP。最小殺菌質(zhì)量濃度測定結(jié)果如表3和表4所示，由表可知，PTKP對志賀氏菌和大腸埃希菌的最小殺菌質(zhì)量濃度分別為20 mg/mL和40 mg/mL；sPTKP對志賀氏菌和大腸埃希菌的最小殺菌質(zhì)量濃度分別為10 mg/mL和20 mg/mL。表明PTKP經(jīng)硫酸化修飾后提高了其抑菌活性。

圖3 sPTKP紅外光譜

表3 PTKP和sPTKP對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑

表4 PTKP和sPTKP對志賀氏菌抑菌環(huán)直徑

3 討 論

目前，常用的人工合成硫酸酯多糖的方法包括氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法等，其中氯磺酸-吡啶法因試劑簡單易得，反應(yīng)條件也相對簡單，取代度較高，產(chǎn)物回收方便，成為最常用的方法。不同的多糖，因其分子質(zhì)量以及多糖分子的空間結(jié)構(gòu)不同，所以硫酸化的最優(yōu)條件不同，最優(yōu)條件下的取代度也不同。Huang等[13]用氯磺酸-吡啶法制備硫酸化黃芪多糖，以氯磺酸∶吡啶配比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為因素水平設(shè)計正交試驗對黃芪多糖硫酸化修飾條件進行優(yōu)選，發(fā)現(xiàn)最佳條件為氯磺酸∶吡啶體積比為1∶6，反應(yīng)溫度95 ℃，反應(yīng)時間1 h，各因素對硫酸基取代度的影響程度依次為反應(yīng)溫度>試劑比例>反應(yīng)時間。Qian等[14]采用氯磺酸-吡啶法對霍山石斛多糖(Dendrobium huoshanense polysaccharides)進行了硫酸化修飾，并以響應(yīng)面優(yōu)化法探究出條件為60 ℃，160 min，氯磺酸∶吡啶體積比為1∶2時，霍山石斛多糖硫酸化取代度最好，為1.473。Zhang等[15]以正交試驗采用氯磺酸-吡啶法對麥冬多糖進行硫酸化修飾，確定硫酸化最優(yōu)條件為氯磺酸∶吡啶體積比為1∶4，80 ℃，3 h，硫酸取代度為1.62。張匯等[16]采用氯磺酸-吡啶法對黑靈芝水不溶性多糖進行硫酸化修飾，采用三因素三水平正交試驗確定最佳條件為氯磺酸∶吡啶體積比為1∶2，75 ℃，4 h，硫酸取代度為1.30，各因素對硫酸取代度的影響程度為試劑比例>溫度>反應(yīng)時間。本試驗采用磺酸-吡啶法對太白蓼多糖進行硫酸化修飾，并用單因素和正交試驗確定條件為酯化試劑體積比為1∶10，反應(yīng)溫度為80 ℃，反應(yīng)時間為1 h，太白蓼多糖硫酸取代度最好，為1.57，各因素對硫酸基取代度的影響程度依次為反應(yīng)時間>反應(yīng)溫度>試劑比例。

研究發(fā)現(xiàn)，多糖的生物活性與多糖的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，中藥多糖經(jīng)過分子修飾后，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，產(chǎn)生新的構(gòu)象，其物理化學(xué)性質(zhì)、生物活性隨之改變，可以增強或者賦予中藥多糖更多的藥理活性和減弱其藥物毒性[17]。李公斌[18]研究表明，硫酸化黑木耳多糖對金黃色葡糖球菌和大腸桿菌有不同程度的體外抑制作用，抑制時效可達16～20 h。申進文等[19]的研究表明，硫酸化秀珍菇發(fā)酵胞外多糖對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌活性。在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著秀珍菇發(fā)酵胞外多糖硫酸酯質(zhì)量濃度的增加(0～25 g/L)，其抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的能力迅速增強，其質(zhì)量濃度在25 g/L時，對3種細菌的抑制率均達到95%左右。而劉瑩等[20]的抗菌活性試驗顯示，硫酸化和乙酰化后的金針菇多糖衍生物抗菌活性較弱，對供試的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為25～50 g/L。本試驗結(jié)果表明，硫酸化太白蓼多糖對大腸桿菌和志賀氏菌具有體外抑制作用，與太白蓼多糖相比，硫酸化修飾后其抑菌活性明顯增強，究其原因，可能是由于磺酸基團的加入，導(dǎo)致PTKP的疏水性改變，對細菌的細胞膜和細胞壁造成破壞，引起蛋白質(zhì)的溶解和細菌中的重要分子的滲透，營養(yǎng)物質(zhì)吸收、ATP活性及核苷酸合成等功能性障礙，最終導(dǎo)致細胞死亡。

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(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Sulfate Modification ofPolygonumtaipaishaneaseKung Polysaccharide and Antibacterial Activity of Modified Products in Vitro

AN Le,ZHAO Qiuyun,QIN Peixi,WENG Maoyang,CHEN Lei,KE Jinpeng,QING Suzhu and ZHANG Weimin

(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To create the condition of sulfated modification ofPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide (PTKP) and explore the influence of sulfation on antibacterial activity of PTKP,based on index of sulfate substitution degree,PolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide was modified by chlorosulfonic acid pyridine method. The modification conditions were optimized with L9(34) orthogonal experiment by using the ratio of chlorosulfonic acid to pyridine,reaction time and reaction temperature as the factor levels. Barium sulfate - gelatin turbidity method was used to determine the degree of substitution (DS). Then,the structure of modified products were detected by Fourier infrared spectroscopy.The minimum bactericidal concentrations of sulfatedPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide( sPTKP) onE.coliand Shigellosis were also examined by micro broth dilution method. The best conditions of sulfated modification onPolygonumtaipaishaneaseKung polysaccharide were as followings: the volume ratio of chlorosulfonic acid to pyridine was 1∶10,reaction temperature was 80 ℃,reaction time was 1 h,and the degree of substitution was 1.57. S=O stretching vibration peaks were detected in the infrared spectrum. Both PTKP and sPTKP could inhibitE.coliand Shigellosis in vitro,and their inhibitory effects on Shigella was better than onE.coli.In conclusion,sulfated modification could improve the antibacterial activity ofPolygonumtaipaishaneaseKung in vitro.

PolygonumtaipaishaneaseKung; Sulfated modification; Orthogonal test; Antibacterial activity

AN Le,female,master student.Research area:developmental biology.E-mail:252395140@qq.com

QING Suzhu,female,Ph.D,professor.Research area: basic veterinary science.E-mail: suzhuqing@163.com

2015-12-01

2016-01-27 基金項目： 陜西省科技攻關(guān)項目(2013K01-61-01)；陜西省農(nóng)業(yè)財政項目(K332021402)；西北農(nóng)林科技大學(xué)2015年“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃”校重點項目(1201510712041)。

安 樂，女，碩士研究生，研究方向為發(fā)育生物學(xué)。E-mail：252395140@qq.com

卿素珠，女，博士，教授，研究方向為基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。E-mail：suzhuqing@163.com 張為民，男，副教授，研究方向為臨床獸醫(yī)學(xué)。E-mail：ylzhangwm@163.com

日期：2016-10-20

S859.3

A

1004-1389(2016)10-1541-07

ZHANG Weimin,male,associate professor.Research area:clinical veterinary medicine.E-mail:ylzhangwm@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1655.038.html

Received 2015-12-01 Returned 2016-01-27

Foundation item Scientific and Technological Project of Shaanxi Province (No. 2014K02-05-01); Agricultural Finance Project of Shaanxi Province (No. K332021402); 2015 Northwest A&F University “Students Innovation and Entrepreneurship Training Program” of School Key Project (No. 1201510712041).