田岳強(qiáng), 郭建麗, 黃智慧, 3, 馬愛(ài)軍, 3, 王新安, 3, 楊 志, 曲江波

?

大菱鲆家系選育二代7種免疫因子的分析

田岳強(qiáng)1, 2, 郭建麗1, 黃智慧1, 3, 馬愛(ài)軍1, 3, 王新安1, 3, 楊 志4, 曲江波4

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青島市海水魚(yú)類(lèi)種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東青島266071; 2. 上海海洋大學(xué), 上海201306; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東青島 266071; 4. 煙臺(tái)開(kāi)發(fā)區(qū)天源水產(chǎn)有限公司, 山東煙臺(tái) 264003)

為選育高成活率的大菱鲆()抗鰻弧菌()群體, 對(duì)30個(gè)大菱鲆選育二代家系(F2)和1個(gè)普通養(yǎng)殖群體進(jìn)行鰻弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)(周期為14 d), 統(tǒng)計(jì)分析死亡率。選取死亡率不同的6個(gè)選育家系和普通養(yǎng)殖群體構(gòu)成7個(gè)實(shí)驗(yàn)組, 采用半定量-聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative polymerase Chain reaction , RT-PCR) 技術(shù)對(duì)它們肝臟、脾臟、頭腎的相關(guān)免疫因子——溶菌酶(Lysozyme)、抗菌肽(Hepcidin)、熱激蛋白70(HSP70)、熱激蛋白90(HSP90)、免疫球蛋白(IgM)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin) 的表達(dá)量開(kāi)展研究, 并應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)攻毒前后各免疫因子的表達(dá)量與攻毒后存活率之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明: 攻毒前后選育家系幼魚(yú)肝臟、脾臟、頭腎中7個(gè)免疫因子的表達(dá)量普遍高于普通養(yǎng)殖幼魚(yú), 且在7個(gè)實(shí)驗(yàn)組中, 攻毒后的表達(dá)量相較攻毒前均呈現(xiàn)下降趨勢(shì); 攻毒前, 肝臟中l(wèi)ysozyme、IgM的表達(dá)量與存活率為極顯著性正相關(guān)(<0.01), HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表達(dá)量與存活率為顯著性正相關(guān)(<0.05); 脾臟中, Hepcidin、HSP70和HSP90的表達(dá)量與存活率為極顯著性正相關(guān)(<0.01); 頭腎中, HSP70的表達(dá)量與存活率為顯著正相關(guān)(<0.05)。綜上, 可以推斷選育家系相對(duì)于普通養(yǎng)殖群體大菱鲆抗鰻弧菌性能更強(qiáng), 且7種免疫因子在鰻弧菌感染魚(yú)體的過(guò)程中發(fā)揮重要的抗感染作用; 從F2中獲得一個(gè)抗鰻弧菌性能較強(qiáng)的家系(23號(hào)), 可用于今后大菱鲆抗鰻弧菌品系的選育指導(dǎo)工作, 為大菱鲆高成活率群體的選育提供參考資料和理論依據(jù)。

大菱鲆(); 鰻弧菌(); 選育家系; 免疫因子; RT-PCR

大菱鲆(), 隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、菱鲆科(Bothidae)、菱鰈屬(), 為原產(chǎn)于北歐的底棲冷水性魚(yú)類(lèi)[1]。1992年中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所率先將其引進(jìn)中國(guó), 目前大菱鲆養(yǎng)殖已發(fā)展為年產(chǎn)量超過(guò)60 000t的海水養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)[2]。但是中國(guó)進(jìn)口大菱鲆群體種質(zhì)較單一, 加之累代養(yǎng)殖和近親交配, 其種質(zhì)退化日趨明顯, 并且伴隨著大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展和集約化程度的不斷提高, 病害問(wèn)題日漸突出[3-5], 嚴(yán)重制約了大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

自“十一五”開(kāi)始, 中國(guó)陸續(xù)立項(xiàng)支持大菱鲆良種選育的相關(guān)研究, 旨在選育出生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)的新品種[2]。從2007年起, 本課題組采用電子標(biāo)記輔助的大規(guī)模家系選育技術(shù)和分子輔助育種技術(shù), 開(kāi)始了大菱鲆的良種選育工作[6-10]。目前已成功選育出生長(zhǎng)快、成活率高的新品種“多寶一號(hào)”以及耐高溫[9-10]的新品系。然而, 大菱鲆高成活率品系的選育及相關(guān)抗病的詳細(xì)機(jī)制國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道, 為了指導(dǎo)本課題組高成活率品系的選育, 開(kāi)展此研究。眾所周知, 溶菌酶、抗菌肽、熱激蛋白、免疫球蛋白和凝集素等均是魚(yú)類(lèi)重要的免疫因子,國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家對(duì)它們?cè)诘挚垢腥拘灾虏【姆烙鶛C(jī)制中起到的作用進(jìn)行研究。如周麗等[11]對(duì)引起牙鲆體表潰爛的病原纖毛蟲(chóng)——指狀擬舟蟲(chóng)()誘導(dǎo)牙鲆免疫反應(yīng)產(chǎn)生的免疫球蛋白進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)病原纖毛蟲(chóng)免疫注射牙鲆, 可誘導(dǎo)牙鲆發(fā)生特異性免疫反應(yīng), 產(chǎn)生抗體; Shike等[12-13]報(bào)道抗菌肽mRNA表達(dá)量變化受外界病原微生物的正調(diào)控; 林天勢(shì)等[14]用病原菌感染大黃魚(yú)(), 感染48 h后, 各組織HSP90表達(dá)量明顯上升等。

本研究對(duì)以高成活率為選育目標(biāo)的大菱鲆家系選育二代和普通養(yǎng)殖群體幼魚(yú)進(jìn)行鰻弧菌()攻毒實(shí)驗(yàn), 檢驗(yàn)選育家系抗鰻弧菌性能, 并分析了肝臟、脾臟和腎臟中的多種免疫因子的表達(dá)水平及其與存活率的關(guān)系, 為大菱鲆高成活率性狀選育提供參考資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)家系用魚(yú)來(lái)源于本課題組于2010年5月在煙臺(tái)天源水產(chǎn)國(guó)家級(jí)良種場(chǎng)所構(gòu)建的同批次選育家系[8]。于2011年5月開(kāi)展攻毒實(shí)驗(yàn), 即從30個(gè)家系中分別挑取40尾幼魚(yú), 從購(gòu)自日照養(yǎng)殖場(chǎng)的普通群體中挑取40尾幼魚(yú), 同時(shí)從選育家系與普通養(yǎng)殖群體中共挑選40尾組成1個(gè)混合組, 共計(jì)32組, 分別養(yǎng)殖于32個(gè)直徑110 cm、高68 cm的圓柱形玻璃鋼桶內(nèi)。養(yǎng)殖海水為過(guò)濾深井海水, 循環(huán)流水, 桶內(nèi)海水高度控制在50 cm, 水溫為(13±1)℃, 氧氣泵連續(xù)通氧, DO≥7.3 mg/L, 鹽度為28‰, 早晚各喂1次, 暫養(yǎng)14 d。為保證后續(xù)攻毒實(shí)驗(yàn)用菌量在各組之間無(wú)顯著差異, 挑選的所有用魚(yú)規(guī)格均勻[體長(zhǎng)均值為(17.79±2.8) cm, 體質(zhì)量均值為(275.98±21.36)g, 均值±標(biāo)準(zhǔn)差]。后期免疫分析所用的6個(gè)家系是根據(jù)攻毒后死亡率的高低, 從30個(gè)家系中挑選獲得。

1.1.2 鰻弧菌

攻毒實(shí)驗(yàn)所用的鰻弧菌為本實(shí)驗(yàn)室保存并經(jīng)過(guò)鑒定的鰻弧菌菌株。菌株接種于滅菌的TSB培養(yǎng)基(TSB 30g, NaCl 15g, 蒸餾水1 000 mL溶解), 28℃, 200 r /min培養(yǎng)約24 h, 測(cè)定OD600值, 并用0.9%生理鹽水稀釋至已測(cè)定的半致死濃度106cfu/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 攻毒實(shí)驗(yàn)

暫養(yǎng)結(jié)束后, 參照文獻(xiàn)[15-16]的方法, 對(duì)選育家系及普通養(yǎng)殖群體幼魚(yú)腹腔注射1μL/g[17]經(jīng)過(guò)稀釋的鰻弧菌菌液, 同時(shí)對(duì)混合組腹腔注射1 μL/g 0.9%生理鹽水作為對(duì)照。感染期間水溫控制在(14±1)℃,實(shí)驗(yàn)持續(xù)14 d, 統(tǒng)計(jì)死亡情況并及時(shí)撈出死魚(yú)。對(duì)每組死魚(yú)隨機(jī)抽取3尾進(jìn)行涂片鏡檢, 均發(fā)現(xiàn)鰻弧菌。

1.2.2 樣品采集

在注射前和注射后第15天分別從各組隨機(jī)取5尾大菱鲆幼魚(yú), 剪取幼魚(yú)肝臟、脾臟、頭腎, 置于加入組織保護(hù)液的無(wú)RNA酶離心管中, 即為肝臟、脾臟、頭腎的樣品。樣品放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫因子的測(cè)定和分析

1.2.3.1 RNA提取

利用TIANGEN動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取肝臟、脾臟和頭腎樣品的RNA。將5個(gè)樣本按照等同的RNA含量進(jìn)行混合, 分裝并用封口膜封存, –80℃儲(chǔ)存。

1.2.3.2 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA

在RNase-free離心管中加入1 μg混勻后的RNA以及1 μL random hexamer primer(隨機(jī)引物), 加入RNase-free ddH2O至12 ++μL, 65℃反應(yīng)5 min。向上述反應(yīng)體系中加入4 μL 5×Reaction Buffer、1 μL (20 U/μL)RIboLock RNase Inhibitor、2 μL 10 mmol/L dNTP Mix以及1 μL(200 U/μL)RevertAid M-MuLV R反轉(zhuǎn)錄酶, 反應(yīng)體系總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)條件為: 25℃ 5min, 42℃ 60 min, 75℃ 5 min。

1.2.3.3 免疫因子的PCR擴(kuò)增與分析

對(duì)7種免疫因子的特異引物(表1), 在Taq polymerase的作用下進(jìn)行特異性擴(kuò)增, 并用β-actin作為內(nèi)參對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系20 μL: cDNA 1 μL, 10×buffer 1.5 μL, 上、下游引物各0.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.3 μL, Taq DNA聚合酶0.2 μL, 無(wú)RNA水15 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 退火45 s, 72℃延伸45 s, 按表1設(shè)置循環(huán)數(shù); 72℃延伸5 min, 反應(yīng)結(jié)束。利用1.7%瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè), 利用凝膠成像軟件(UV-systems)對(duì)條帶強(qiáng)度進(jìn)行分析。每個(gè)樣品的凝膠電泳進(jìn)行3次重復(fù), 灰度值以[均值±標(biāo)準(zhǔn)差]表示。

表1 PCR反應(yīng)中特異性引物的核苷酸序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 用Duncan法進(jìn)行多重比較,<0.05為差異顯著。

進(jìn)行皮爾遜檢驗(yàn)(Pearson correlation), 對(duì)攻毒前各免疫因子的相對(duì)表達(dá)量與大菱鲆攻毒后的死亡率進(jìn)行相關(guān)性分析。Pearson相關(guān)系數(shù)公式為:

2 結(jié)果

2.1 攻毒后大菱鲆的累積死亡情況

注射生理鹽水的混合組在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡, 可排除養(yǎng)殖環(huán)境和注射對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。攻毒后, 30個(gè)家系的累積死亡率在(23.34±4.72)%~(75.00±2.36)%, 普通養(yǎng)殖群體的累積死亡率為(81.67±2.35)%, 各家系的死亡率均低于普通養(yǎng)殖群體(編號(hào)31)(圖1); Duncan多重比較結(jié)果表明, 30個(gè)家系中有27個(gè)的累積死亡率顯著低于普通養(yǎng)殖群體(<0.05)。選取死亡率由低到高具有代表性的6個(gè)家系作為家系組, 分別命名為家系組1~6, 死亡率平均值分別為25.00%、33.33%、41.65%、56.66%、66.66%、75.00%, 對(duì)應(yīng)家系號(hào)為23號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、7號(hào)、15號(hào)、5號(hào), 普通選育群體命名為普通組, 共7個(gè)實(shí)驗(yàn)組用于免疫因子分析。

2.2 肝臟攻毒前后各免疫因子的表達(dá)分析

應(yīng)用7種免疫因子的特異性引物對(duì)肝臟cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物利用1.7%瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè), 利用凝膠成像軟件(UV-systems)分析條帶強(qiáng)度, 由此得出攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)大菱鲆肝臟7種免疫因子表達(dá)水平的影響, 如圖2。應(yīng)用SPSS16.0分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組肝臟之間免疫因子的表達(dá)量進(jìn)行方差分析及多重比較, 并用檢驗(yàn)分析7種免疫因子攻毒前后的差異性, 結(jié)果見(jiàn)表2。肝臟中各免疫因子的表達(dá)量在攻毒后普遍呈現(xiàn)下降趨勢(shì); 攻毒前, 6個(gè)家系組的各免疫因子表達(dá)量全部高于普通組(<0.05), 7個(gè)實(shí)驗(yàn)組的免疫因子表達(dá)量的高低與其存活率呈一定的正相關(guān)關(guān)系; 攻毒后, 大多數(shù)家系組的免疫因子表達(dá)量高于普通組(<0.05)。

2.3 脾臟攻毒前后各免疫因子的表達(dá)分析

應(yīng)用7種免疫因子的特異性引物對(duì)脾臟cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 結(jié)果見(jiàn)圖3。應(yīng)用SPSS16.0分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組脾臟之間免疫因子的表達(dá)量進(jìn)行方差分析及多重比較, 并用檢驗(yàn)分析免疫因子攻毒前后的差異性, 結(jié)果見(jiàn)表3。脾臟中各免疫因子的表達(dá)量在攻毒后普遍呈現(xiàn)下降趨勢(shì); 無(wú)論攻毒前后, 6個(gè)家系組的各免疫因子表達(dá)量普遍高于普通組(<0.05); 攻毒前, 7個(gè)實(shí)驗(yàn)組的免疫因子表達(dá)量的高低與其存活率呈一定的正相關(guān)關(guān)系。

B. 攻毒前; A. 攻毒后(圖3、圖4同)

B. before the challenge; A. after the challenge (same as in Fig. 3 and Fig. 4)

表2 大菱鲆肝臟7種免疫因子灰度值測(cè)定結(jié)果

注: B. 攻毒前, A. 攻毒后。同行中, 標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示同種免疫因子相同實(shí)驗(yàn)階段下不同組間差異顯著(<0.05), 標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(>0.05); 標(biāo)有“*”者表示該組在不同實(shí)驗(yàn)階段下差異顯著(<0.05), 沒(méi)標(biāo)“*”者表示該組在不同實(shí)驗(yàn)階段下差異不顯著(>0.05)(表3, 表4同)

表3 大菱鲆幼魚(yú)脾臟7種免疫因子灰度值測(cè)定結(jié)果

2.4 頭腎攻毒前后各免疫因子的表達(dá)分析

應(yīng)用7種免疫因子的特異性引物對(duì)頭腎cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 結(jié)果見(jiàn)圖4。應(yīng)用SPSS16.0分別對(duì)各實(shí)驗(yàn)組頭腎免疫因子攻毒前后的表達(dá)量進(jìn)行方差分析及多重比較, 并用檢驗(yàn)分析免疫因子攻毒前后的差異性, 結(jié)果見(jiàn)表4。頭腎中各免疫因子的表達(dá)量在攻毒后普遍呈現(xiàn)下降趨勢(shì); 無(wú)論攻毒前后, 6個(gè)家系組的免疫因子表達(dá)量普遍高于普通組(<0.05); 攻毒前, 7個(gè)實(shí)驗(yàn)組免疫因子的表達(dá)量與其存活率相關(guān)關(guān)系不如肝臟與脾臟中明顯。

表4 大菱鲆幼魚(yú)頭腎7種免疫因子灰度值測(cè)定結(jié)果

2.5 攻毒前7種免疫因子表達(dá)量與存活率的相關(guān)性分析

將各實(shí)驗(yàn)組肝臟、脾臟和頭腎中7種免疫因子攻毒前的表達(dá)量與攻毒后的存活率(存活率=1–死亡率)進(jìn)行相關(guān)性分析, 如表5所示。肝臟中, 溶菌酶(Lysozyme)、免疫球蛋白M(IgM)的表達(dá)量與存活率為極顯著性正相關(guān)(<0.01), 熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、C-型凝集素(C-type lectin)、Lily-型凝集素(Lily-type lectin)的表達(dá)量與其為顯著性正相關(guān)(<0.05); 脾臟中, 抗菌肽(Hepcidin)、熱激蛋白70(HSP70)和熱激蛋白90(HSP90) 的表達(dá)量與存活率為極顯著正相關(guān)(<0.01); 頭腎中熱休克蛋白70(HSP90)的表達(dá)量與存活率為顯著正相關(guān)(<0.05)。

表5 大菱鲆肝臟、脾臟和頭腎的7種免疫因子攻毒前的表達(dá)量與存活率的相關(guān)性分析

注: 顯著相關(guān)(<0.05); **. 極顯著相關(guān)(<0.01)

3 討論與小結(jié)

非特異性免疫系統(tǒng)是動(dòng)物抵御外界病原體侵染的重要防線, 魚(yú)類(lèi)作為較低等的脊椎動(dòng)物, 相對(duì)于哺乳動(dòng)物而言, 其特異性免疫系統(tǒng)機(jī)制還處于較原始的狀態(tài), 因此在抵抗入侵病原微生物生理反應(yīng)中, 魚(yú)類(lèi)的非特異性免疫防御系統(tǒng)所承擔(dān)的角色顯得更為關(guān)鍵[18-19]。魚(yú)類(lèi)的肝臟、脾臟和頭腎都是合成免疫因子的重要器官, 加之溶菌酶、抗菌肽、熱激蛋白70、熱激蛋白90、IgM、C-型凝集素、Lily-型凝集素7種重要的免疫因子在魚(yú)體抵抗感染性致病菌的最前沿防御機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。因此, 分析各重要免疫因子在肝臟、脾臟和頭腎組織中的表達(dá)情況, 可以在一定程度上對(duì)機(jī)體的抗病力進(jìn)行判斷。

本研究立足于前人經(jīng)驗(yàn), 應(yīng)用Duncan多重比較死亡率, 選取6個(gè)F2家系和1個(gè)普通群體, 采用RT-PCR手段對(duì)它們肝臟、脾臟和頭腎的7種免疫因子展開(kāi)研究, 分析攻毒前肝臟、脾臟和頭腎中相關(guān)免疫因子的表達(dá)量與攻毒后存活率之間的相關(guān)性, 分析結(jié)果討論如下:

攻毒后, 各家系的死亡率均低于普通養(yǎng)殖群體, 30個(gè)家系中有27個(gè)家系的累積死亡率顯著低于非選育群體(<0.05)。說(shuō)明F2選育家系在抗鰻弧菌方面優(yōu)于普通養(yǎng)殖群體。

肝臟、脾臟與頭腎中, 無(wú)論攻毒前后, 6個(gè)家系組肝臟、脾臟、頭腎中7個(gè)免疫因子的表達(dá)量普遍高于普通組, 見(jiàn)表2、表3、表4。這表明, 免疫因子在家系組的重要免疫器官中的表達(dá)能力優(yōu)于普通組, 初步判定選育家系F2的抗鰻弧菌性能優(yōu)于普通養(yǎng)殖群體。

在肝臟、脾臟和頭腎中, 對(duì)比攻毒前后多組免疫因子的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著差異, 作者推測(cè)這些免疫因子在鰻弧菌感染魚(yú)體的過(guò)程中, 發(fā)揮了重要的抗感染作用。然而, 各免疫因子在攻毒后, 表達(dá)量出現(xiàn)下降趨勢(shì), 與之前部分學(xué)者得出的上升趨勢(shì)的結(jié)論不完全一致[20-24]。如強(qiáng)俊等[20]對(duì)“吉富”、“新吉富”、“埃及尼羅”3種不同品系的尼羅羅非魚(yú)()進(jìn)行高密度脅迫發(fā)現(xiàn), 應(yīng)激48 h內(nèi), 吉富羅非魚(yú)(Jifu)與新吉富羅非魚(yú)(New Jifu)溶菌酶活力水平以及肝臟HSP70 mRNA水平呈先上升后下降的變化, 埃及尼羅羅非魚(yú)(Egypt)血清溶菌酶活力與肝臟HSP70 mRNA水平在應(yīng)激后48 h內(nèi)始終高于應(yīng)激前(<0.05)。作者認(rèn)為是由于取樣時(shí)間不同造成的。之前的研究均在攻毒實(shí)驗(yàn)后的第24、48小時(shí)等時(shí)間點(diǎn)取樣, 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍?duì)各家系的抗性性能進(jìn)行分析, 篩選出抗鰻弧菌性能較強(qiáng)的家系, 為今后的抗性選育工作提供理論依據(jù), 因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中, 模擬養(yǎng)殖環(huán)境, 避免取樣后魚(yú)缸中密度變化造成實(shí)驗(yàn)誤差, 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束即攻毒后第15天取樣, 該時(shí)間點(diǎn)可能不在各免疫因子表達(dá)量增加的階段, 而正好處于免疫因子表達(dá)下降階段。

對(duì)比表2、表3、表4, 肝臟、脾臟和頭腎中, 相同實(shí)驗(yàn)組在攻毒前后, 表達(dá)量出現(xiàn)顯著性差異的免疫因子并不一致。作者推測(cè), 這3種不同的免疫器官, 在抗鰻弧菌時(shí), 其免疫應(yīng)答機(jī)理不同, 當(dāng)外源病毒侵染魚(yú)體時(shí), 3個(gè)器官起免疫主導(dǎo)作用的免疫因子不同。

分析免疫因子攻毒前表達(dá)量與存活率之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn), 肝臟中, Lysozyme、IgM的表達(dá)量與存活率為極顯著性正相關(guān)(<0.01), HSP70、HSP90、C-type lectin、Lily-type lectin的表達(dá)量與其為顯著性正相關(guān)(<0.05); 脾臟中, Hepcidin、HSP70和HSP90 的表達(dá)量與存活率為極顯著正相關(guān)(<0.01); 頭腎中HSP70的表達(dá)量與存活率為顯著正相關(guān)(<0.05)。作者將得出的與存活率成顯著或者極顯著正相關(guān)的免疫因子作為可靠的免疫指標(biāo), 對(duì)今后大菱鲆高成活率育種工作提供指導(dǎo)。以這些指標(biāo)為依據(jù), 作者對(duì)6個(gè)家系組攻毒前各免疫因子的表達(dá)量進(jìn)行分析, 如表2、表3、表4。攻毒前, 家系組1的肝臟、脾臟、頭腎中, 與存活率顯著相關(guān)的免疫因子表達(dá)量均最高, 其對(duì)應(yīng)的存活率為75.00%, 從而可以判斷該家系組在抗鰻弧菌方面相對(duì)于其他選育家系有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì), 其對(duì)應(yīng)的家系號(hào)為23。今后在抗鰻弧菌品種的選育過(guò)程中, 可以選取此家系為親本繼續(xù)構(gòu)建, 也可取其存活個(gè)體進(jìn)行抗鰻弧菌分子標(biāo)記的篩選工作等。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn), 可以推測(cè)F2相對(duì)于普通養(yǎng)殖群體大菱鲆, 在抗鰻弧菌方面具有一定的優(yōu)勢(shì), 得到一個(gè)抗鰻弧菌性能較好的家系23號(hào), 而且以上7種非特異免疫因子在鰻弧菌感染魚(yú)體的過(guò)程中, 發(fā)揮重要的抗感染作用。得出了一些與存活率成顯著或者極顯著正相關(guān)的免疫因子, 可作為可靠的免疫指標(biāo), 指導(dǎo)大菱鲆高成活率育種工作。

參考文獻(xiàn)：

[1] Blanquer A, Alayse J P. Allozyme variation in turbot() and brill() (Osteichthyes, Pleuronectiformes, ScoPhthalmidae) throughout their range in Europe[J]. Fish Biology, 1992, 41(5): 725-736.

[2] 雷霽霖, 劉新富, 關(guān)長(zhǎng)濤. 中國(guó)大菱鲆養(yǎng)殖20年成就和展望——慶祝大菱鲆引進(jìn)中國(guó)20周年[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(4): 123-130.Lei Jilin, Liu Xinfu, Guan Changtao. Turbot culture in China for two decades: Achievements and prospect[J]. Progress in Fishery Sciences, 2012, 33(4): 123-130.

[3] 申雪艷, 宮慶禮, 雷霽霖, 等.進(jìn)口大菱鲆L苗種的遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 海洋與湖沼, 2004, 35(4): 332-341. Shen Xueyan, Gong Qingli, Lei Jilin, et al. Population genetic structure analysis of the imported turbot seedlingsL. using RAPD and microsatellite technique[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2004, 35(4): 332-341.

[4] 雷霽霖, 馬愛(ài)軍, 陳超, 等. 大菱鲆(L.)養(yǎng)殖現(xiàn)狀與可持續(xù)發(fā)展[J]. 中國(guó)工程科學(xué), 2005, 7(5): 30-34. Lei Jilin, Ma Aijun, Chen Chao, et al. The present status and sustainable development of turbot (L.) culture in China[J]. Engineering Science, 2005, 7(5): 30-34.

[5] 秦蕾, 王印庚, 閻斌倫. 大菱鲆微生物性疾病研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2008, 27(11): 598-602. Qin Lei, Wang Yingeng, Yan Binlun. Advances in research on diseases of turbotaffected by microorganisms[J]. Fisheries Science, 2008, 27(11): 598-602.

[6] 馬愛(ài)軍, 王新安, 雷霽霖. 大菱鲆()不同生長(zhǎng)階段體重的遺傳參數(shù)和育種值估計(jì)[J]. 海洋與湖沼, 2010, 40(2): 187-194. Ma Aijun, Wang Xin’an, Lei Jilin. Genetic parameterization for turbot: implication to breeding strategy[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2009, 40(2): 187-194.

[7] 馬愛(ài)軍, 王新安, 薛寶貴, 等. 大菱鲆()選育家系的構(gòu)建和培育技術(shù)研究[J]. 海洋與湖沼, 2010, 41(3): 301-306. Ma Aijun, Wang Xin′an, Xue Baogui, et al. Investigation on family construction and rearing techniques for turbot (l.) family selection[J]. Ocea-n-o-logia Et Limnologia Sinica, 2010, 41(3): 301-306.

[8] 馬愛(ài)軍, 王新安, 黃智慧, 等. 大菱鲆()家系選育F2早期選擇反應(yīng)和現(xiàn)實(shí)遺傳力估計(jì)[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(1): 57-61. Ma Aijun, Wang Xin′an, Huang Zhihui, et al. Response to selection and realized heritability for early growth in the second-generation breeded line of turbot (L)[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2012, 43(1): 57-61.

[9] Liang X M, Ma A J, Wang X A, et al.Morphological comparison between a selected fast-growing strain and the common cultured strain of turbot[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2012, 30(4): 563-568.

[10] 馬愛(ài)軍, 黃智慧, 王新安, 等. 大菱鲆耐高溫品系選育及耐溫性能評(píng)估[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(4): 797-804. Ma Aijun, Huang Zhihui, Wang Xin'an, et al. The selective breeding of thermal tolerance family and appraisal of performance in turbot[J]. Oceanologia Et Limnologia Sinica, 2012, 43(4): 797-804.

[11] 周麗, 戰(zhàn)文斌, 宋微波, 等. 指狀擬舟蟲(chóng)誘導(dǎo)牙鲆抗血清免疫球蛋白分析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2000, 7(2): 28-31. Zhou Li, Zhan Wenbin, Song Weibo, et al. Analysis of immunogloblin M (IgM) in serum of Japanese flounder,[J]. Journal of Fisheryences of China, 2000, 7(2): 28-31.

[12] Shike H, Lauth X, Westerman M E, et al. Bass hepcidin is a novel antimicrobial peptide induced by bacterial challenge[J]. European Journal of Biochemistry, 2002, 269(8): 2232-2237.

[13] Shike H, Shimizu C, Lauth X, et al. Organization and expression analysis of the zebrafish hepcidin gene, an antimicrobial peptide gene conserved among vertebrates[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2004, 28(7-8): 747-754.

[14] 林天勢(shì), 薛良義, 孫愛(ài)飛, 等. 溫度和病原菌感染對(duì)大黃魚(yú)熱激蛋白90基因表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 34(6): 555-564. Lin Tianshi, Xue Liangyi, Sun Aifei, et al. Effect of temperature and pathogen on HSP90 expression in[J]. Chinese Journal of Cell Biology, 2012, 34(6): 555-564.

[15] 陳松林, 田永勝, 徐田軍, 等. 牙鲆抗病群體和家系的建立及其生長(zhǎng)和抗病性能初步測(cè)定[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2008, 32(5): 665-673. Chen Songlin, Tian Yongsheng, Xu Tianjun, et al. Development and characterization for growth rate and disease resistance of disease-resistance population and family in Japanese flounder()[J]. Journal of Fisheries of China, 2008, 32(5): 665-673.

[16] 莫照蘭, 徐永立, 張培軍. 養(yǎng)殖牙鲆鰻弧菌疫苗的研究[J]. 海洋科學(xué), 2002, 26(4): 63-66. Mo Zhaolan, Xu Yongli, Zhang Peijun. Vaccination againston cultured flounder,[J]. Marine Sciences, 2002, 26(4): 63-66.

[17] 馬愛(ài)軍, 郭建麗, 王新安, 等. 大菱鲆選育家系抗鰻弧菌性能[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(3): 484-493. Ma Aijun, Guo Jianli, Wang Xin'an, et al. Family selection and estimation of disease resistance in turbot,[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(3): 484-493.

[18] Bergljót M. Innate immunity of fish (overview)[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2006, 20(2): 137-151.

[19] 佟雪紅, 徐世宏, 劉清華, 等. 大菱鲆早期發(fā)育過(guò)程中免疫器官的發(fā)生[J]. 海洋科學(xué), 2011, 35(6): 62-67. Tong Xuehong, Xu Shihong, Liu Qinghua, et al. Ontogeny of immune organs during early developmental stages of turbot[J]. Marine Sciences, 2011, 35(6): 62-67.

[20] 強(qiáng)俊, 楊弘, 何杰, 等. 3種品系尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)及高密度脅迫后生理響應(yīng)變化的比較[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(1): 142-152. Qiang Jun, Yang Hong, He Jie, et al. Comparison on growth performance in three different strains ofand physiological responses after short-term high stocking density stress[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(1): 142-152.

[21] 萬(wàn)文菊, 王紀(jì)亭, 石存斌, 等. 溶藻弧菌感染對(duì)劍尾魚(yú)HSP70基因表達(dá)的影響[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 22(5): 330-334. Wan Wenju, Wang Jiting, Shi Cunbin, et al. Gene expression of HSP70 in green swordtailexposed to[J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2007, 22(5): 330-334.

[22] 魏然, 張士璀, 王長(zhǎng)法, 等. 鹽度多牙鲆非特異性免疫功能的影響[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2003, 21(2): 209-213. Wei Ran, Zhang Shicui, Wang Changfa, et al. Effects of changes in salinity on nonspecific immune function of Japanese flounder[J]. Advances in Marine Science, 2003, 21(2): 209-213.

[23] 劉波, 王美垚, 謝駿, 等. 低溫應(yīng)激對(duì)吉富羅非魚(yú)血清生化指標(biāo)及肝臟HSP70基因表達(dá)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(17): 4866-4873. Liu Bo, Wang Meiyao, Xie Jun, et al. Effects of acute cold stress onserum biochemical and immune parameters and liver HSP70 gene expression in GIFT strain of Nile tilapia()[J]. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(17): 4866-4873.

[24] 劉洪展, 鄭風(fēng)榮, 孫修勤, 等. 氨氮脅迫對(duì)刺參幾種免疫酶活性的影響[J]. 海洋科學(xué), 2012, 36(8): 47-52. Liu Hongzhan, Zheng Fengrong, Sun Xiuqin, et al. Effect of exposure to ammonia nitrogen stress on immune enzyme of holothurian[J]. Marine Sciences, 2012, 36(8): 47-52.

(本文編輯: 譚雪靜)

Analysis of seven immune-related genes in selective second filial families (F2) of turbot ()

TIAN Yue-qiang1, 2, GUO Jian-li1, HUANG Zhi-hui1, 3, MA Ai-jun1, 3, WANG Xin-an1, 3, YANG Zhi4, QU Jiang-bo4

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 2. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China; 4. Yantai Tianyuan Aquatic Limited Corporation, Yantai 264003, China)

For breeding turbot group with high survival rates and resistance to, 30 selective second filial families (F2) with a high survival rate and one common culture group of turbot (L.) were infected with. Six F2and one control groups were picked out as samples for detecting the following immune responses. Gene expressions of seven immune-related factors (lysozyme, HSP90, HSP70, IgM, hepcidin, C-type lectin, and lily-type lectin) were analyzed in turbot livers, spleens, and head kidneys using RT-PCR. Correlation analysis between the expression of these immune genes before infection and survival rate after challenge assays (period of 14 days) was carried out using SPSS 16.0 software. Results showed that regardless of samples infected with, the expression of immune-related genes in the six F2populations was generally stronger than that in the control and the expression status of most immune genes was higher in the seven experimental groups withoutstress thanin the injected groups. The expression of the remaining six immune genes, except hepcidin, beforeinfection showed a significantly positive correlation with survival rate in livers (< 0.05) and the gene expression of lysozyme and IgM exhibited a highly significant positive correlation (< 0.01). Gene expressions of hepcidin, HSP70, and HSP90 showed a highly significant positive correlation with survival rate in spleens (< 0.01); the expression of HSP70 exhibited a significant positive correlation with survival rate in head kidneys (< 0.05). Therefore, F2selective families with a high survival rate could possess an outstanding resistance againstand the seven immune-related genes could play important roles in bacterial resistance of turbot. We obtained a selective family (No. 23) with a strong resistance against, which could guide selection of turbot strains with disease-resistance trait in the future and provide a reference and theoretical basis for turbot breeding.

;; selective second filial families; immune-related gene; RT-PCR

Mar. 5, 2015

S941

A

1000-3096(2016)09-0009-09

10.11759/hykx20150305002

2015-03-05;

2015-05-07

國(guó)家863 計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A408-8); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)基金共同資助(CARS-50-G01); 中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2015M572096); 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CP001)

田岳強(qiáng)(1988-), 男, 山東省泰安人, 碩士, 主要從事魚(yú)類(lèi)遺傳育種研究, 電話: 15865385685, E-mail: tyqiang1988@163.com; 馬愛(ài)軍, 通信作者, 電話: 0532-85835103, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn

[Foundation: National 863 Program (2012AA10A408-8); Modern Agro-Industry Technology Research System (CARS-50-G01); China Postdoctoral Science Foundation(2015M572096); the Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2014CP001)]