劉慧 趙俊云 楊向竹 薛慧清 李彩彩 馬鑫 張娜 周然

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黃芪糖蛋白對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的影響

劉慧 趙俊云 楊向竹 薛慧清 李彩彩 馬鑫 張娜 周然

目的 研究16kD黃芪糖蛋白對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡的影響，探討黃芪糖蛋白治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的免疫作用機(jī)理。方法 采用雄性Balb/c小鼠建立牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型，將造模成功的小鼠隨機(jī)分為CIA模型組、氫化可的松陽性對照組、黃芪糖蛋白高、中、低劑量組，另設(shè)空白對照組；各治療組腹腔注射藥物14天，對照組與模型組注射等體積生理鹽水。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠外周血CD3+CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例；Western blot法檢測各組小鼠脾組織中維甲酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 流式檢測結(jié)果顯示,黃芪糖蛋白可顯著降低模型組小鼠外周血中CD3+CD4+IL-17A+Th17細(xì)胞比例(P<0.01)，提高CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示黃芪糖蛋白可顯著降低模型組小鼠脾組織中RORγt的表達(dá)(P<0.01),提高Foxp3的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 黃芪糖蛋白提高Foxp3的表達(dá)水平，降低RORγt的表達(dá)水平，恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞之間的平衡，可能是黃芪糖蛋白治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠的機(jī)制之一。

黃芪糖蛋白； RORγt； Foxp3； 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以多關(guān)節(jié)滑膜炎、骨及軟骨破壞為主要特征的慢性自身免疫性疾病，致殘率極高[1]。到目前為止，雖然RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，但T細(xì)胞功能紊亂，尤其是CD4+T細(xì)胞異?；罨赗A的發(fā)生發(fā)展中處于中心環(huán)節(jié)[2]。黃芪為傳統(tǒng)補中益氣中藥，具有補氣升陽、固表止汗等多種功效。本課題組通過水浸提法自膜莢黃芪的干燥根中分離出一種糖蛋白均一組分，即黃芪糖蛋白，進(jìn)而從黃芪糖蛋白中分離純化出一種16kD組分，命名為AmRP10-16[3]。筆者團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪糖蛋白具有一定免疫抑制作用，且可改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)炎癥[4-5]。本實驗以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型小鼠為研究對象，予16kD AmGP腹腔注射給藥，以Th17/Treg細(xì)胞平衡為切入點研究16kD黃芪糖蛋白(astragalus membranaceus glycoprotein,AmGP)對CIA小鼠Th17、Treg細(xì)胞比例及其特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨受體γt(retinoid-related orphan receptor γt, RORγt)和叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3 (forkhead box protein 3,Foxp3)蛋白表達(dá)的影響，探討AmGP治療CIA的免疫作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c雄性小鼠，90只，體質(zhì)量(18±2)g，清潔級，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2 主要藥物、試劑、儀器

AmGP為自制；弗氏完全佐劑，Sigma公司;膠原蛋白Ⅱ型(牛)，Chondrex公司；Anti-RORγt Purified、Anti-Foxp3 Purified，eBioscience公司；β-actin、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；四甲基乙二胺，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；苯甲基磺酰氟、過硫酸銨、Tween-20、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、聚偏氟乙烯微孔轉(zhuǎn)移膜、5%脫脂奶粉、Tris、SDS、BCA蛋白定量試劑盒，Solarbio公司;Mouse IL-17A PE-Cy7 Antibody、Mouse CD4 FITC Antibody、Anti-Mouse CD25 APC、Anti-Mouse Foxp3 PE、Cocktail(PMA+Ionomysin+BFA)，美國BioLegend公司。

JY600C型電泳儀，北京君益東方電泳設(shè)備有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀，Tecan公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備 Balb/c雄性小鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，參考文獻(xiàn)方法[6]，將溶解的CⅡ與等體積CFA在冰浴中充分乳化，以0.1 mL/只在小鼠腹部、背部和尾根部多點皮下注射，進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，當(dāng)天記為第1天，第21天以同樣的方法加強(qiáng)免疫。以關(guān)節(jié)腫脹度評分標(biāo)準(zhǔn)評價模型復(fù)制是否成功。

1.3.2 分組及給藥 將造模成功的50只小鼠隨機(jī)分為模型組、氫化可的松(hydrocortisone，HC)陽性對照組、黃芪糖蛋白高、中、低劑量組，每組10只；基礎(chǔ)免疫后第42天開始給藥治療：HC組小鼠腹腔注射HC 10 mg/kg；AmGP低、中、高劑量組分別按0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg腹腔注射AmGP；正常組、模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水；注射體積均為0.4 mL/20 g，每天一次，共治療兩周。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 關(guān)節(jié)腫脹度評分 采用0～4級關(guān)節(jié)評分法，關(guān)節(jié)炎得分計算方法為：0分，腳趾正常或無炎癥；1分，腳趾關(guān)節(jié)腫脹或輕度發(fā)紅；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾發(fā)紅并且腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下整個足爪發(fā)紅并且腫脹；4分，踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)紅且腫脹，關(guān)節(jié)有變形跡象。每隔3天觀察并記錄小鼠四肢關(guān)節(jié)病變情況，四肢關(guān)節(jié)評分累計之和為每只小鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)。AI值≥4分表示造模成功。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例第57天各組小鼠摘眼球取血，流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例，方法完全按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.3 Western blot法檢測 脾組織中RORγt、Foxp3蛋白的表達(dá)第57天處死小鼠，取各組小鼠脾組織，提取總蛋白并采用BCA法定量，取總蛋白40 μg 進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交。顯影結(jié)果采用Quantity One軟件分析各組條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參比值反應(yīng)脾組織蛋白表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CIA小鼠的一般情況

正常組小鼠在整個實驗期間飲食正常，活潑，皮毛光澤；模型組小鼠進(jìn)行免疫注射后可見食欲下降，體重減輕，皮毛黯淡干枯，并出現(xiàn)輕度脫毛現(xiàn)象，關(guān)節(jié)紅腫畸形，跛行。各藥物組小鼠關(guān)節(jié)紅腫均有所減輕，精神狀態(tài)及飲食較模型組均明顯改善。

2.2 CIA小鼠AI值

正常組小鼠足爪關(guān)節(jié)無紅腫現(xiàn)象，AI值為0；所有造模小鼠于基礎(chǔ)免疫后第22天開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)紅等典型改變，并隨時間推移逐漸加重，造模小鼠于基礎(chǔ)免疫后第42天關(guān)節(jié)炎指數(shù)達(dá)到高峰，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著各給藥組的持續(xù)用藥，AI值不斷降低；其中HC組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)最小，與模型組比較AI值降低明顯(P<0.01)；AmGP不同劑量組AI值較模型組均有不同程度降低(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪糖蛋白對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)影響的變化趨勢

2.3小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例

與正常組比較，模型組小鼠外周血Th17細(xì)胞比例升高，Treg細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。治療后，與模型組比較，HC組與AmGP各劑量組Th17細(xì)胞比例不同程度降低，Treg細(xì)胞比例升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 黃芪糖蛋白對CIA小鼠外周血Th17、Treg細(xì)胞比例的影響

注： 與正常組比較，aP<0.01;與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.4 小鼠RORγt 、Foxp3蛋白的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組RORγt表達(dá)升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，HC組和AmGP中、高劑量組RORγt表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3表達(dá)升高(P<0.01)。數(shù)據(jù)見表2，雜交結(jié)果如圖2。

注：A.正常組;B.模型組;C.HC組;D.AmGP低劑量組;E.AmGP中劑量組;F.AmGP高劑量組

組別nRORγt/β?actinFoxp3/β?actin正常組100．328±0．0190．525±0．016模型組100．439±0．012a0．325±0．031aHC組100．305±0．069b0．467±0．038bAmGP低劑量組100．421±0．0250．362±0．012AmGP中劑量組100．292±0．088b0．429±0．061bAmGP高劑量組100．341±0．011b0．448±0．027b

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3 討論

黃芪作為補氣藥在臨床廣泛應(yīng)用于治療RA的多種經(jīng)方。近年研究表明，黃芪的多種有效成分，如黃芪多糖、黃芪總甙及黃芪黃酮等，具有免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[7]，且用于治療RA[8-10]。HC屬于腎上腺皮質(zhì)激素，具有抗感染、抑制免疫等藥理作用，是臨床治療RA療效明確的藥物，所以本文將其作為陽性對照。本文成功復(fù)制小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，以Th17/Treg細(xì)胞平衡為切入點，探究AmGP作用于CIA小鼠的可能機(jī)制及療效。

Th17和Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的兩個亞型。初始CD4+T細(xì)胞在IL-6和TGF-β的共同作用下，通過激活JAK-STAT3途徑，誘導(dǎo)RORγt基因的表達(dá)，促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化；而在TGF-β的單獨作用下，可通過激活JAK-STAT5信號途徑，上調(diào)Foxp3的表達(dá)，促使初始CD4+T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞[11]。Th17細(xì)胞可產(chǎn)生促炎因子IL-17?，F(xiàn)已明確Th17細(xì)胞及其特異性細(xì)胞因子IL-17在RA等自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[12]。IL-17的促炎效應(yīng)可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，促進(jìn)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)與骨的損傷[13]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞可特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，通過分泌IL-10和TGF-β等抑炎細(xì)胞因子發(fā)揮抑制T細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞的功能，減少促炎因子和抗體的產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用。研究表明，Treg細(xì)胞數(shù)量減少、功能降低是RA患者免疫失調(diào)的重要原因[14]。由此可知，Th17和Treg細(xì)胞具有截然相反的免疫作用，Th17細(xì)胞可促進(jìn)RA等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展，而Treg細(xì)胞可減輕前者所導(dǎo)致的自身免疫性炎癥反應(yīng)，從而維持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，因此Th17/Treg細(xì)胞失衡在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

RORγt是Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可特異性地調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化及功能。Ivanov II等[15]研究表明，RORγt缺失的動物體內(nèi)，Th17細(xì)胞數(shù)量減少，發(fā)生自身免疫疾病的概率降低；同時還表明，無論體內(nèi)外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化都必須要有轉(zhuǎn)錄因子RORγt的參與。Foxp3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志分子，對Treg細(xì)胞的分化發(fā)育成熟及發(fā)揮免疫抑制作用方面起關(guān)鍵作用，也是Treg細(xì)胞最敏感的標(biāo)記[16]，它與Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt相互拮抗[17]。RORγt/Foxp3平衡可確定初始CD4+T細(xì)胞在受到抗原刺激后向Th17或Treg細(xì)胞分化的方向[18]。因此，RORγt/Foxp3平衡可從根本上影響Th17/Treg細(xì)胞平衡，影響RA等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。

臨床RA患者外周血表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞數(shù)量減少[19]，而血清及關(guān)節(jié)液中IL-17的表達(dá)則明顯升高[20]。牛倩等[21]研究也發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Th17細(xì)胞比例明顯升高，而Treg細(xì)胞比例明顯降低，提示RA中存在Th17/Treg細(xì)胞偏倚。Th17細(xì)胞的促炎作用與Treg細(xì)胞的抑炎作用在RA的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞平衡對治療RA意義重大。

本文以16kD黃芪糖蛋白腹腔注射治療CIA小鼠，結(jié)果顯示，與模型組比較，AmGP各劑量組小鼠皮毛較光整，飲食、活動度、精神狀態(tài)均有改善，AI值降低(P<0.01)，說明AmGP可在一定程度上改善CIA模型小鼠的關(guān)節(jié)炎癥，抑制病情的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，CIA組小鼠外周血中Th17細(xì)胞比例升高，Treg細(xì)胞比例下降，與正常組比較差異顯著(P<0.01)。同時，CIA組小鼠的脾組織中RORγt表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)明顯降低，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)，即外周血中Th17、Treg細(xì)胞的比例變化與其特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化呈現(xiàn)相同的趨勢。Foxp3表達(dá)降低，Treg細(xì)胞的發(fā)育受到抑制，Treg細(xì)胞分泌的抑炎因子減少，免疫抑制作用減弱，同時RORγt表達(dá)升高，則促使Th17細(xì)胞分化，其分泌促炎因子也相應(yīng)增多，Th17/Treg細(xì)胞平衡向Th17細(xì)胞方向偏倚，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生。CIA小鼠經(jīng)16kDAmGP治療后，外周血中Th17細(xì)胞比例降低，Treg細(xì)胞比例升高，相應(yīng)的，脾組織中RORγt表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3表達(dá)升高，與模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明16kDAmGP可通過不同程度促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化增殖，抑制Th17細(xì)胞的分化增殖，有效地恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞平衡，使CIA模型小鼠的病情逐漸緩解。

16kD黃芪糖蛋白是本課題組在以往提取的黃芪糖蛋白的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離純化，得到的分子量更小的天然糖蛋白活性分子。本文表明，16kD黃芪糖蛋白對CIA小鼠的治療作用可能是通過調(diào)節(jié)RORγt、Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，進(jìn)而糾正Th17/Treg細(xì)胞平衡而實現(xiàn)的。關(guān)于16kD黃芪糖蛋白的其他免疫活性及量效關(guān)系的研究及其對RA作用機(jī)理的進(jìn)一步探討將是下一步的研究方向。

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(本文編輯： 禹佳)

Influences of AmGP on Th17/Treg immune balance in CIA mice

LIUHui,ZHAOJun-yun,YANGXiang-zhu，etal.

SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

YANGXiang-zhu,E-mail:xiangzhuy@126.com

Objective To examine the impacts of 16kD astragalus membranaceus glycoprotein (AmGP) on the balance of Th17/Treg in CIA mice; and to investigate the effects of AmGP on CIA mice and its’ mechanism. Methods Bovine type Ⅱcollagen was used to establish CIA model. Mice were randomly divided into five groups: CIA model group, hydrocortisone(HC) positive control group, AmGP groups with low, medium and high dose. In addition, a normal group was built. The HC and AmGP groups were treated by HC or AmGP with intraperitoneal injection, while normal saline was used in the other groups，and the treatment was lasted for 2 weeks. Flow cytometry was used to detect the proportions of CD3+CD4+IL-17A+Th17 and CD4+CD25+Foxp3+Treg cells in peripheral blood of the mice; The protein expressions of RORγt and Foxp3 were evaluated by western blot in mice spleen. Results It is showed that AmGP could significantly reduce the proportion of CD3+CD4+IL-17A+Th17 in peripheral blood of CIA mice (P<0.01). It could improve the proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg cells (P<0.01). Western blot results indicated that AmGP could significantly decrease the expression of RORγt (P<0.01), while increase the expression of Foxp3 in spleen of CIA mice(P<0.01).Conclusion AmGP recovers the balance of Th17/Treg cells by improving the expressions of Foxp3,and reducing the expression of RORγt. This procedure may be one of the mechanisms for AmGP to cure the CIA mice.

Astragalus membranaceus glycoprotein； RORγt； Foxp3； CIA

國家國際科技合作專項(2013DFA30700)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院[劉慧(碩士研究生)、趙俊云、楊向竹、李彩彩(碩士研究生)、馬鑫、張娜]；山西中醫(yī)學(xué)院科研中心(薛慧清、周然)

劉慧(1989- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：16kD黃芪糖蛋白作用于CIA小鼠的免疫作用機(jī)理。E-mail：13671081286@163.com

楊向竹(1970- )，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥的現(xiàn)代物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：xiangzhuy@126.com

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.004

2016-05-16)