張弛,閆會萍,陸一帆,*,翁凱翔,武鐵男,胡兵,王娟娟,劉一凝,魏東洋,許振成
1. 北京體育大學 運動康復系,北京 100084 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣州 510655
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運動對2,3,7,8-四氯二苯并二惡英急性暴露大鼠肝臟抗氧化能力的影響
張弛1,閆會萍1,陸一帆1,*,翁凱翔1,武鐵男1,胡兵1,王娟娟1,劉一凝1,魏東洋2,許振成2
1. 北京體育大學 運動康復系,北京 100084 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所,廣州 510655
觀察8周中等強度游泳運動對2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD)急性暴露大鼠肝臟氧化應激的影響。以8周齡雄性Sprague Dawley大鼠為研究對象,將大鼠隨機分為玉米油靜養(yǎng)組(NC組)、玉米油運動組(EC組)、TCDD靜養(yǎng)組(NT)和TCDD運動組(ET組)。將TCDD溶于玉米油中,NT和ET組大鼠按照10 μg·kg-1(以單位體重計)腹腔注射TCDD,NC和EC組大鼠注射等量玉米油。正式實驗開始后,EC和ET組大鼠進行運動(尾部負重5%游泳30 min),每周運動5 d,共8周,NC和NT組大鼠不進行任何運動干預。8周后,稱重并宰殺大鼠,收集血清和肝組織樣本,待測血清天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性;肝組織丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。將數(shù)據進行多因素方差分析,結果表明,染毒可升高大鼠血清AST的活性,增加肝臟MDA的含量,降低肝臟SOD、CAT和GSH-Px的活性;運動可降低大鼠肝臟GSH-Px的活性;染毒后運動可減少肝臟MDA的含量,升高肝臟SOD、CAT和GSH-Px的活性。研究表明,TCDD急性暴露可導致大鼠肝細胞功能受損,導致大鼠肝臟發(fā)生氧化應激。8周有氧運動改善TCDD急性暴露誘導的肝細胞損傷,改善肝臟氧化應激,這可能是運動改善TCDD肝毒性的機制之一。
2,3,7,8-四氯二苯并二惡英;大鼠;肝臟抗氧化能力;運動
Received 30 November 2015 accepted 6 January 2016
伴隨全球工業(yè)化進程的加快,環(huán)境中存在著大量危害人類健康的致病因素,二惡英作為一種典型的持續(xù)性有機污染物,因其親脂性、生物富集性、難降解、高毒性等特點引起了學術界的廣泛關注。二惡英包含多種化學有機物,其中毒性最強的是2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,2,3,7,8-TCDD)[1]。TCDD可經皮膚、呼吸道和消化道進入機體,對機體造成廣泛的損害[2]。TCDD經腹腔注射后在肝臟發(fā)生首過消除效應,可擾亂肝功能,誘導肝細胞增生、肥大,造成肝細胞損傷甚至凋亡,還可導致肝臟氧化與抗氧化系統(tǒng)功能失衡,表現(xiàn)為丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶活性降低,因此氧化應激被認為是TCDD發(fā)揮肝臟毒性作用的重要環(huán)節(jié)[3-5]。
隨著“exercise is medicine”這一健身理念的提出,長期規(guī)律的運動鍛煉作為一種防治慢性疾病的非藥物性手段越來越受到學術界的關注。研究表明,參加體育鍛煉或者體力活動具有防治非酒精性脂肪肝,改善肥胖患者肝臟脂代謝,增加II型糖尿病患者肝臟糖原儲備、改善糖代謝等諸多益處,適宜的有氧運動是防治肝臟疾病保護肝組織的有效干預手段[6-8]。劇烈運動時,機體的能量代謝增加,活性氧(reactive oxidative species, ROS)作為線粒體氧化磷酸化的副產物在細胞內的濃度也急劇升高,因此劇烈運動會造成機體的氧化損傷。而規(guī)律的、適宜強度的有氧運動具有提高機體抗氧化能力、降低氧化應激水平的作用[9],可見機體氧化與抗氧化系統(tǒng)對于運動的應答與運動強度和機體本身的氧化-抗氧化平衡狀態(tài)有關。
本文通過隨機對照試驗(randomized controlled trail, RCT)研究8周有氧運動對TCDD急性暴露大鼠肝臟氧化應激的影響,為運動緩解TCDD導致的肝毒性、防治肝臟疾病、促進機體健康提供一定的理論依據。
1.1 實驗對象及分組
8周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,體重(191.06±9.94) g,購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院(許可證號SCXK-(軍)2012-0004),實驗已經通過北京體育大學福利倫理委員會審核批準,適應性飼養(yǎng)1周后,將大鼠隨機分為4組:正常對照組(normal control, NC)、染毒組(normal toxic, NT)、運動對照組(exercise control, EC)、運動染毒組(exercise toxic, ET),各組分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(22±2) ℃,濕度為(50±5)%,晝夜交替時間為12 h,自由飲用水和食物,以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水、飲食,大鼠所用飲用水和墊料均經過高壓蒸汽滅菌,動物房及飼養(yǎng)用具定期清掃消毒。飼養(yǎng)室、用具等定期消毒滅菌。
1.2 染毒及運動方案
將2,3,7,8-TCDD溶于玉米油中,NT和ET組大鼠腹腔注射10 μg·kg-1(以單位體重計)的2,3,7,8-TCDD(購自美國Cambridge Isotope Laboratories Inc,純度99%),NC和EC組大鼠腹腔注射等量玉米油。運動組(ET與EC)大鼠運動方式為尾部負重5%進行游泳(尾根套負重螺絲),每周游泳5 d,每天游泳30 min,水溫為(32±2) ℃。游泳水桶直徑150 cm,水深75 cm。每組大鼠每天游泳時間固定,于每周稱重后調整負重,共8周,NC和NT組大鼠不進行任何運動干預。
1.3 實驗取材
運動組大鼠最后1次運動48 h后進行取材。所有大鼠在取材前禁食8 h,稱重并記錄,按照0.006 g·kg-1(以單位體重計)的劑量,腹腔注射水合氯醛麻醉。大鼠開腹后,分離腹主靜脈,用負壓采血管采集大鼠血液,離心后分離血清,-80 ℃凍存??焖賱冸x肝臟組織,在預冷的生理鹽水中浸洗后,濾紙吸干水分,稱重并記錄,用手術剪剪成100~200 mg的小組織塊,錫紙包裹后液氮速凍,之后轉入-80 ℃凍存。
1.4 血清指標測試
采用比色法測試血清天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性。所用試劑盒購自于北京華英生物技術研究所。血清樣本按說明書操作步驟進行處理,分別加入相應試劑并進行孵育,用全自動生化分析儀讀取特定波長的吸光度變化,計算酶活性。
1.5 肝臟氧化應激指標測試
稱取100 mg肝臟組織,加入1 mL生理鹽水,在玻璃勻漿器中制成10%的勻漿液。采用比色法測試肝臟勻漿液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性,及丙二醛(MDA)含量。所用試劑盒均購自北京華英生物技術研究所,操作步驟均按說明書進行。
1.6 統(tǒng)計學分析
2.1 血清AST、ALT水平
大鼠血清AST和ALT結果見表1,結果顯示,運動對血清AST活性的影響有可靠的主效應(P=0.025,F(xiàn)=5.449,偏Eta方=0.131),使血清AST活性非常顯著升高;染毒對血清AST活性的影響有可靠的主效應(P=0.001,F(xiàn)=14.404,偏Eta方=0.286),使血清AST活性非常顯著升高;運動、染毒對血清AST活性的影響無可靠的交互效應(P=0.809,F(xiàn)=0.059,偏Eta方=0.002)。運動對血清ALT活性的影響有可靠的主效應(P=0.000,F(xiàn)=48.372,偏Eta方=0.573),使血清ALT活性非常顯著升高;染毒對血清ALT活性的影響無可靠的主效應(P=0.089,F(xiàn)=3.062,偏Eta方=0.078);運動、染毒對血清ALT活性的影響無可靠的交互效應(P=0.802,F(xiàn)=0.064,偏Eta方=0.002)。
圖1 運動對TCDD染毒大鼠肝組織MDA含量的影響Fig. 1 The effect of exercise on the liver MDA level of rats after acute exposure to TCDD
表1 大鼠血清AST和ALT活性的變化
注:NC, 正常對照組;EC, 運動對照組;NT, 染毒組;ET, 運動染毒組。*, P<0.05 vs. NC; **, P<0.01 vs. NC; ***, P<0.001 vs. NC。
Note: NC, the normal control group; EC, the exercise control group; NT, the normal TCDD group; ET, the exercise TCDD group. *, P<0.05 vs. NC; **, P<0.01 vs. NC; ***, P<0.001 vs. NC.
2.2 肝臟MDA含量
肝組織MDA含量測試結果見圖1,運動對肝臟MDA含量的影響無可靠的主效應(P=0.371,F(xiàn)=0.900,偏Eta方=0.101);染毒對肝臟MDA含量的影響有可靠的主效應(P=0.005,F(xiàn)=14.400,偏Eta方=0.643),使肝臟MDA含量非常顯著升高;運動、染毒對肝臟MDA含量的影響有可靠的交互效應(P=0.045,F(xiàn)=5.625,偏Eta方=0.413),染毒后運動可顯著降低肝臟MDA含量。
2.3 肝臟抗氧化酶活性
肝組織抗氧化酶活性檢測結果見圖2~4。結果顯示,運動對肝臟SOD的影響無可靠的主效應(P=0.455,F(xiàn)=0.617,偏Eta方=0.072);染毒對肝臟SOD活性的影響有可靠的主效應(P=0.000,F(xiàn)=34.638,偏Eta方=0.812),使肝臟SOD活性非常顯著降低;運動、染毒對肝臟SOD活性的影響有可靠的交互效應(P=0.005,F(xiàn)=14.967,偏Eta方=0.652),染毒后運動可非常顯著升高肝臟SOD活性。
運動對肝臟CAT活性的影響無可靠的主效應(P=0.095,F(xiàn)=3.581,偏Eta方=0.309);染毒對肝臟CAT活性的影響有可靠的主效應(P=0.000,F(xiàn)=40.302,偏Eta方=0.834),使肝臟CAT活性非常顯著降低;運動、染毒對肝臟CAT活性的影響有可靠的交互效應(P=0.001,F(xiàn)=23.255,偏Eta方=0.744),染毒后運動可非常顯著升高肝臟CAT活性。
圖2 運動對TCDD染毒大鼠肝組織SOD活性的影響Fig. 2 The effect of exercise on the activity of liver SOD of rats after acute exposure to TCDD
運動對肝臟GSH-Px活性的影響有可靠的主效應(P=0.023,F(xiàn)=7.846,偏Eta方=0.495),使肝臟GSH-Px活性顯著降低;染毒對肝臟GSH-Px活性的影響有可靠的主效應(P=0.001,F(xiàn)=29.843,偏Eta方=0.789),使肝臟GSH-Px活性非常顯著降低;運動、染毒對肝臟GSH-Px活性的影響有可靠的交互效應(P=0.000,F(xiàn)=50.822,偏Eta方=0.864),染毒后運動可非常顯著升高肝臟GSH-Px活性。
圖3 運動對TCDD染毒大鼠肝組織CAT活性的影響Fig. 3 The effect of exercise on the activity of liver CAT of rats after acute exposure to TCDD
圖4 運動對TCDD染毒大鼠肝組織GSH-Px活性的影響Fig. 4 The effect of exercise on the activity of liver GSH-Px of rats after acute exposure to TCDD
3.1 運動對TCDD大鼠血清AST、ALT及LDH水平的影響
TCDD進入機體后首先在肝臟發(fā)生首過消除效應,肝臟因較早地接觸TCDD而成為TCDD毒性的靶器官。TCDD在肝臟的聚集會導致肝臟腫大、實質增生和肥大,最終會引起肝細胞大量的壞死和凋亡。伴隨肝臟病理學改變發(fā)生的是肝臟代謝功能的紊亂,表現(xiàn)為肝臟內大量存在的AST、ALT和LDH等代謝酶釋放進入血液,使血清中酶的活性升高。本實驗室前期的研究結果證實,有氧運動可以改善TCDD誘導的肝毒性,保護肝細胞,改善肝臟功能,糾正肝臟脂代謝紊亂[10]。本實驗結果所示,TCDD急性暴露8周后,大鼠血清AST的活性顯著增高,ALT的活性有增高的趨勢但是沒有統(tǒng)計學意義,這說明本實驗成功建立了大鼠肝臟TCDD急性暴露染毒模型,而ALT沒有顯著增高的原因可能與本實驗采用的染毒模型為急性暴露,其對大鼠肝臟的損傷較慢性染毒較輕有關[11-12]。8周有氧運動并未使TCDD急性暴露大鼠血清AST和ALT活性顯著減低。結合運動對正常大鼠血清AST和ALT酶活性的影響,我們推測可能是運動引起大鼠骨骼肌發(fā)生損傷,釋放部分AST和ALT進入血液,這說明本實驗所采用的運動方案是有效的,這也提示我們在今后的研究中,當不能排除運動誘導骨骼肌和心肌等釋放一系列的酶進入血液的情況下,評價運動模型的肝功能一定要從多方面、多角度著手,比如增加肝臟超聲等指標。
3.2 運動對TCDD大鼠肝臟抗氧化能力的影響
TCDD導致肝臟損傷的機制雖然目前仍不完全清楚,但是動物實驗已經證實TCDD的肝毒性主要是通過AhR受體介導的[13-15]。TCDD進入肝臟后同內源性的核轉錄因子AhR結合,誘導毒物代謝有關I相代謝酶和II相代謝酶的表達,從而導致相應的毒效應。I相代謝酶主要是細胞色素P450。細胞色素P450可以將TCDD代謝成易氧化還原的酚類或醌類物質,在氧化還原的過程中不斷產生ROS和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)。而肝臟內存在眾多抗氧化酶可以降解ROS或RNS,緩解氧化損傷。但當肝臟內自由基生成增加,抗氧化能力減退時,將誘發(fā)氧化應激。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),長期TCDD暴露可以使肝臟內氧化—抗氧化系統(tǒng)失衡,表現(xiàn)為MDA含量增加,SOD、CAT和GSH-Px等氧化酶的活性減弱。而抗氧化治療可以改善TCDD的肝毒性[16-17]。本實驗結果顯示,TCDD急性暴露8周后大鼠肝臟MDA含量增加,SOD、CAT和GSH-Px的活性減弱,這說明TCDD急性暴露也可以使肝臟發(fā)生氧化應激,綜合以上結果,本實驗證明氧化應激是TCDD導致肝毒性的重要環(huán)節(jié)。
運動作為一種應激,可以對機體的抗氧化系統(tǒng)產生影響。長期的運動刺激可以使機體產生不同水平的結構和功能重塑,其表現(xiàn)之一是機體對氧化應激產生系統(tǒng)性適應[18]。運動與氧化應激的關系是十分復雜的。研究發(fā)現(xiàn),大強度運動過程中ROS產生增多,并伴隨脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷。但是長期規(guī)律的運動鍛煉可以降低機體的氧化應激水平,這是因為適宜強度的運動產生的低濃度的ROS對機體不具有毒性作用但又能刺激機體對此產生適應包括抗氧化體系和氧化損傷修復系統(tǒng)的激活[19-20]。關于運動與肝臟氧化應激的關系已有大量研究,Barcelos等[21]發(fā)現(xiàn)4周運動訓練雖然可以增強骨骼肌的有氧代謝能力但會造成肝臟的氧化損傷,表現(xiàn)為肝臟脂質過氧化增加,血清AST、CK活性增加,肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性代償性增加,所以在進行大運動量訓練時進行抗氧化營養(yǎng)劑的補充是必需的。Hu等[22]報道,運動鍛煉可以通過降低肝臟氧化應激損傷對非酒精性脂肪肝起到防治作用。由此可見,運動對機體氧化應激的影響與運動方式、運動強度和機體本身的氧化應激水平息息相關[14]。因此,探索運動對TCDD急性暴露大鼠肝臟氧化應激的影響具有一定的理論價值和實踐意義。本實驗結果顯示,8周有氧運動對正常大鼠肝臟MDA含量,SOD、CAT活性沒有影響,這提示本實驗所采用的運動方案不是大負荷方案,沒有影響肝臟氧化和抗氧化之間的平衡,未造成大鼠肝臟氧化損傷[23],這與本實驗血清酶活性指標的結果相互印證。本實驗結果顯示,運動降低了TCDD急性暴露大鼠肝臟MDA含量,升高了SOD和CAT的活性,這提示本實驗所選用的運動方案可以提高TCDD急性暴露大鼠肝臟的抗氧化能力,降低氧化應激水平,這可能是有氧運動緩解TCDD肝毒性的機制之一。
綜上所述,急性10 μg·kg-1體重TCDD染毒后8周,可導致大鼠肝細胞功能受損,導致大鼠肝臟抗氧化能力減退發(fā)生氧化應激,表現(xiàn)為MDA含量增加,SOD和CAT的活性減弱。8周有氧運動能有效抵抗TCDD急性暴露誘導的肝細胞損傷,改善肝臟氧化應激,這可能是運動改善TCDD肝毒性的機制之一。
致謝:特別感謝環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所許振成研究員、國家體育總局運動醫(yī)學研究所方子龍研究員的支持和幫助。
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◆
Effect of Exercise on the Activity of Liver Antioxidant Ability in 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) - Exposed Rats
Zhang Chi1, Yan Huiping1, Lu Yifan1,*, Weng Kaixiang1, Wu Tienan1, Hu Bing1, Wang Juanjuan1, Liu Yining1, Wei Dongyang2, Xu Zhencheng2
1. Sports Rehabilitation College, Beijing Sport University, Beijing 100084, China 2. South China Institute of Environmental Sciences of Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China
The purpose of this study was to investigate the effects of moderate intensity exercise (8-week swimming) on the oxidative stress in the liver of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-exposed rats. Forty, 2-month-old, male Sprague Dawley (SD) rats were randomly assigned to 4 groups, including normal control (NC) group, normal toxic (NT) group, exercise control (EC) group, and exercise toxic (ET) group. The rats in NT and ET groups were intraperitoneally injected with TCDD (dissolved in the corn oil, 10 μg·kg-1body weight); and the NC and EC groups were injected with equivalent volume of corn oil. Then, the rats in EC and ET groups swam for 8 weeks with a weight of 5% body weight attached to the tails (30 min·d-1and 5 d per week). After all the procedure, the body weights of the rats were measured, the liver of the rats was obtained to determine the concentration of malonaldehyde (MDA), and the activities of the superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px). And the sera were collected to determine the activities of the aspartate aminotransferase (AST) and the alanine aminotransterase (ALT). The results show that the AST activity and the MDA concentration increased, and the activities of SOD, CAT, and GSH-Px decreased in the NT groups compared to the NC group. In addition, the GSH-Px activity decreased in the EC group, while the MDA concentration decreased and the activities of SOD, CAT and GSH-Px increased. It can be conclude that acute exposure of TCDD could lead to hepatocyte damage, and consequently result in the oxidative stress in the live. Eight week of moderate intensity exercise may decrease the cell damage and the oxidative stress. Therefore, the improving effects of the exercise on the anti-oxidative capacity of the liver may be one of the mechanisms of its hepatic protective function against TCDD.
2,3,7,8-TCDD; rat; antioxidant ability of liver; exercise
10.7524/AJE.1673-5897.20151130023
北京體育大學自主科研課題(2014YB015);全國重點地區(qū)環(huán)境與健康專項調查(21111011101EHH(2011)-505)
張弛(1992-),男,在讀碩士生,研究方向運動與健康,E-mail: sws_zc@126.com
*通訊作者(Corresponding author), E-mail: fanluyi@hotmail.com
2015-11-30 錄用日期:2016-01-06
1673-5897(2016)2-300-07
X171.5
A
簡介:陸一帆(1963—),男,運動生理學博士,教授,博士研究生導師,主要研究方向為運動訓練監(jiān)控、社區(qū)體育健身、運動與健康。
張弛, 閆會萍, 陸一帆, 等. 運動對2,3,7,8-四氯二苯并二惡英急性暴露大鼠肝臟抗氧化能力的影響[J]. 生態(tài)毒理學報,2016, 11(2): 300-306
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