曾柳丹，馬慧敏，張干，于志強，盛國

1. 中國科學院廣州地球化學研究所 有機地球化學國家重點實驗室和廣東省環(huán)境資源利用與保護重點實驗室， 廣州 510640 2. 中國科學院研究生院，北京 100049

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Cl-BDE-208和BDE-209誘導LINE-1基因低甲基化和ESR1基因高甲基化

1. 中國科學院廣州地球化學研究所 有機地球化學國家重點實驗室和廣東省環(huán)境資源利用與保護重點實驗室， 廣州 510640 2. 中國科學院研究生院，北京 100049

十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)是使用最多的一種多溴阻燃劑，由于具有高親脂性和低揮發(fā)性，容易蓄積在生物體內(nèi)，在人體血清、母乳、肝臟等組織中均有檢出；其環(huán)境脫溴產(chǎn)物九溴一氯聯(lián)苯醚(Cl-BDE-208)也在血清樣品和環(huán)境樣品中被頻頻檢出，而目前對這種化合物的毒理學研究，特別是對人體早期健康效應(yīng)的研究較少。為了評估Cl-BDE-208和BDE-209的早期健康效應(yīng)，以人乳腺癌細胞MCF-7為模型，環(huán)境相關(guān)濃度(0.375～3 μmol·L-1)為暴露濃度，檢測Cl-BDE-208和BDE-209對重復(fù)序列LINE-1、全基因組DNA甲基化(GDM)和雌激素受體基因(包括ESR1和ESR2)甲基化水平的改變。結(jié)果表明，Cl-BDE-208和BDE-209都可能通過降低DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)活性而誘導了LINE-1和GDM的低甲基化，8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平的升高可能參與了BDE-209引起的低甲基化過程；同時通過促進雌激素受體α (ESR1)基因的高甲基化而顯著下調(diào)了ESR1基因的表達，而對雌激素受體β (ESR2)基因甲基化水平并沒有顯著影響。Cl-BDE-208和BDE-209都可能通過改變DNA甲基化水平而影響人體的早期健康效應(yīng)，同時ESR1基因的高甲基化可能是Cl-BDE-208和BDE-209引起內(nèi)分泌毒性的機制之一。

Cl-BDE-208；BDE-209；DNA甲基化；LINE-1；ESR1；環(huán)境相關(guān)濃度

Received 26 November 2015 accepted 11 January 2016

十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)，作為價格低廉、穩(wěn)定性良好的阻燃劑，被廣泛用于電子和紡織等消費產(chǎn)品中，是目前市場需求量最大的一類多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)，約占PBDEs使用量的83.3%左右[1]。近年來，我國BDE-209污染嚴重，在人體血液、母乳、胎盤、肝臟等組織中均有檢出[2]，而在電子垃圾高風險區(qū)工人血清中的濃度高達3 100 ng·g-1脂重[3](約3.2 μmol·L-1)。越來越多的研究表明，BDE-209具有內(nèi)分泌干擾毒性及潛在的致癌性[4-5]，但具體機制仍不十分清楚。此外，九溴一氯聯(lián)苯醚Cl-BDE-208是十溴聯(lián)苯醚工業(yè)品的一個次要的組分，同時也是BDE-209的環(huán)境脫溴產(chǎn)物[6]，這種化合物也在環(huán)境樣品和血清樣品中被頻頻檢出[7]，而對這種化合物的毒理學研究，特別是對人體早期健康效應(yīng)的研究并不多見。

目前，DNA甲基化作為生物標志物，被廣泛用于環(huán)境污染物的早期健康效應(yīng)的評估中。許多環(huán)境污染物的暴露都能引起DNA甲基化水平的改變，比如雙酚A(BPA)引起了Avy小鼠全基因組DNA甲基化(GDM)水平的降低[8]，PM10誘導了鋼鐵鑄造工人血液DNA中ALU、LINE-1和一氧化氮合成酶(iNOS)基因的低甲基化[9]，鎘的暴露誘導了歐洲鰻魚GDM水平的降低[10]。DNA甲基化是表觀遺傳學中最重要的一種修飾方式，是指在基因胞嘧啶(cytosine)的第5位碳原子上加了一個甲基基團的過程，DNA甲基化特別是特定基因啟動子區(qū)域內(nèi)的高甲基化，會導致基因表達受到抑制和引起染色體異常等[11]。目前GDM水平降低，抑癌基因啟動子區(qū)域內(nèi)甲基化的升高和癌基因啟動子區(qū)域內(nèi)甲基化的降低等都是疾病發(fā)生早期的重要生物事件[12]，可作為疾病診斷的指標而用于臨床[13]。

基于BDE-209的內(nèi)分泌毒性，本文以MCF-7為模型，選擇環(huán)境相關(guān)濃度(0.375～3 μmol·L-1)為暴露濃度，檢測Cl-BDE-208和BDE-209對GDM、LINE-1和雌激素受體基因甲基化水平的改變，包括雌激素受體ESR1和ESR2基因甲基化水平的改變，應(yīng)用表觀遺傳學中的DNA甲基化指標來表征Cl-BDE-208和BDE-209對人體的早期健康效應(yīng)，借以初步評估Cl-BDE-208和BDE-209的毒性。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實驗材料

HPLC級的甲醇、乙腈和甲酸購買于MerK公司(Germany)。碳酸氫銨、醋酸銨、5-甲基脫氧胞苷(5mdC)、脫氧鳥苷(dG)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)、磷酸二酯酶I和十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)購于Sigma公司(USA)；DNA甲基化酶(M.SssI)、堿性磷酸酶購于New England Biolabs (Beverly，MA)；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自GIBCO公司；九溴一氯聯(lián)苯醚(Cl-BDE-208)由中國科學院廣州地球化學研究所于志強研究員提供，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理

MCF-7細胞購自中國科學院上海細胞庫，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞依次以0.375、0.75、1.5和3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209處理48 h，0.1% DMSO(V/V)為對照組。

1.2.2 DNA提取與水解

用納米磁珠法基因組DNA提取試劑盒(善諾科技有限公司，中國)提取基因組DNA，然后取10 μg DNA樣品溶于5 μL去離子水中，在100 ℃下變性3 min后立即放于冰浴中。然后加入0.6 μL DNA酶(10 U·μL-1)，在37 ℃水浴30 min后，再加入4.1 μL乙酸鈉(30 mmol·L-1, pH=7.8)和1 μL 磷酸二酯酶I(2 U·μL-1)，在37 ℃下反應(yīng)2 h后加入1 μL堿性磷酸酶(3 U·μL-1)，37 ℃孵育過夜。水解完全的DNA 樣品保存于-80 ℃待分析。

1.2.3 LINE-1甲基化水平檢測實驗

每個樣品取1 μg DNA用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒(Zymo, USA)進行處理，具體操作按照說明書。然后取40 ng DNA用于Methylight PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min后，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共50個循環(huán)。反應(yīng)在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行，使用正常人外周血淋巴細胞DNA(PBL DNA)按1：10比例做一系列稀釋，作標準曲線。每個基因的甲基化水平用PMR(甲基化百分比)表示，PMR=100% × (樣品中目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)) / (甲基化PBL中目的基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù))。PMR<4%，則視為非甲基化狀態(tài)。設(shè)過甲基化的PBL DNA的甲基化率為100%，PBL DNA的M.SssI甲基化反應(yīng)具體方法見文獻[14]。LINE-1基因以Alu-C4為內(nèi)參基因，ESR2基因以β-actin為內(nèi)參基因，具體引物和探針序列見表1。

1.2.4 GDM水平檢測實驗

DNA水解樣品采用Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Atlantis dC18柱(Waters公司)，保護柱(Phenomenon公司)，流動相為體積分數(shù)0.1%的甲酸溶于水(A)和體積分數(shù)0.1%的甲酸溶于甲醇(B)，洗脫程序為：0～24 min，0%～18%B，流速為0.22 mL·min-1。5mdC、dG和8-OHdG離子對檢測條件分別為m/z 241.9/126.3，m/z 268.1/152.3，m/z 284.2/152.3。GDM水平表示為[5mdC]/[dG]×100%，8-OHdG水平表示為[8-OHdG]/ [dG]×106。

1.2.5 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)活性檢測實驗

3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209染毒48 h后，收集細胞并用細胞核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒(百泰克，北京)提取蛋白質(zhì)。然后用DNMTs活性檢測試劑盒(Epigentek, USA)檢測DNMTs活性，具體操作按照說明書。DNMTs活性值表示為：DNMTs活性(OD·h-1·mg-1)=1 000 × (樣品吸光度值-空白吸光度值)/ (蛋白量(μg) × 反應(yīng)時間(h))。

1.2.6 基因表達水平檢測實驗

采用TRIzol法提取細胞總RNA，經(jīng)PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara, China)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以cDNA為模板擴增。熒光定量PCR(RT-PCR)擴增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min后，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)。以18S基因為內(nèi)參基因，采用2-Ct方法分析基因表達水平的改變，ESR1和18S基因引物序列見表1。

1.2.7 ESR1基因甲基化水平檢測實驗

DNA樣品經(jīng)亞硫酸氫鈉修飾后，進行焦磷酸鹽測序(華大基因公司完成)。具體方法如下：95 ℃預(yù)變性3 min，90 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。用Pyrosequencing檢測儀(QIAGEN)進行反應(yīng)，Pyro Q-CpG軟件自動分析每個位點甲基化狀態(tài)。具體測序引物見表1。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

采用 IBM SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。實驗結(jié)果以平均值±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗和單因素方差分析方法(ANOVA)比較實驗組與對照組的差異性，*P < 0.05表示差異顯著，#P<0.01表示差異極顯著，P >0.05表示差異不顯著。

表1 引物和探針序列

注：a為焦磷酸鹽測序引物；b為Methylight反應(yīng)引物；c為熒光定量PCR引物。

Note:a, the primers of Pyrosequencing;b, the primers of Methylight assay;c, the primers of RT-PCR.

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cl-BDE-208和BDE-209對 MCF-7細胞的LINE-1甲基化和GDM水平的影響

從圖1A中可看出，與對照組DMSO相比，0.375～3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209均引起了LINE-1基因甲基化水平的顯著降低(P<0.05或P<0.01)。其中，0.375、0.75、1.5和3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208誘導的LINE-1甲基化水平分別為(89.48±7.63)%、(86.59±5.5)%、(86.56±8.21)%、(86.29±9.78)%；而0.375、0.75、1.5和3 μmol·L-1濃度的BDE-209誘導的LINE-1甲基化水平分別為(87.01±9.75)%、(83.88±8.34)%、(81.05±11.46)%、(82.07±9.10)%。

為了進一步驗證LINE-1甲基化改變的結(jié)果，采用HPLC-MS/MS方法檢測0.375～3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209對GDM水平的影響。結(jié)果顯示，Cl-BDE-208和BDE-209在 0.375～3 μmol·L-1濃度下都能引起GDM水平的顯著降低(圖1B)。其中，0.375、0.75、1.5和3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208引起GDM水平分別降低為(91.51±0.03)%、(89.78±0.3)%、 (92.09±6.47)%、(91.85±5.68)%；而0.375、0.75、1.5和3 μmol·L-1濃度的BDE-209引起GDM水平分別降低為(91.28±1.51)%、(89.93±0.22)%、(93.28±7.05)%、(91.93±4.38)%。

圖1 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞的LINE-1甲基化和GDM水平的影響 注：A) Methylight方法檢測LINE-1基因甲基化水平的變化；B) HPLC-MS/MS方法檢測GDM水平的變化; * P < 0.05, #P < 0.01; 0.375～3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209處理MCF-7細胞48 h，0.1% DMSO(V/V)為對照組。Fig. 1 Effects of Cl-BDE-208 and BDE-209 exposure on LINE-1 methylation and GDM levels in MCF-7 cells Note: A) Changes of LINE-1 methylation level were analyzed using Methylight method; B) Changes of GDM level were analyzed using HPLC-MS/MS method; * P < 0.05, #P < 0.01; MCF-7 cells were treated with 0.375～3 μmol·L-1 Cl-BDE-208 or BDE-209 for 48 h, and 0.1 % DMSO (V:V) was used as the control group.

圖2 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞的8-OHdG水平和DNMTs酶活性的影響 注：A) HPLC-MS/MS方法檢測8-OHdG相對水平的變化； B) DNMTs酶活性試劑盒檢測DNMTs酶活性的變化； #P < 0.01；3 μmol·L-1 濃度的Cl-BDE-208和BDE-209處理MCF-7細胞48 h，0.1% DMSO(V/V)為對照組。Fig. 2 Effects of Cl-BDE-208 and BDE-209 exposure on 8-OHdG levels and DNMTs activity in MCF-7 cells Note: A) Changes of 8-OHdG levels were analyzed using HPLC-MS/MS method; B) Changes of DNMTs activity were analyzed using DNMTs activity assay; #P < 0.01; MCF-7 cells were treated with 3 μmol·L-1 Cl-BDE-208 or BDE-209 for 48 h, and 0.1 % DMSO (V:V) was used as the control group.

圖3 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞ESR1基因甲基化和表達水平的影響 注：A) 焦磷酸鹽測序方法檢測ESR1基因甲基化水平的變化；B) RT-PCR檢測ESR1基因表達水平的變化；* P < 0.05；0.375 μmol·L-1和3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209處理MCF-7細胞48 h，0.1% DMSO(V/V)為對照組。Fig. 3 Effects of Cl-BDE-208 and BDE-209 exposure on methylation levels and gene expression of ESR1 in MCF-7 cells. Note: A) Changes of ESR1 methylation levels were analyzed using Pyrosequencing method; B) Changes of ESR1 gene expression levels were analyzed using RT-PCR method； * P < 0.05; MCF-7 cells were treated with 0.375 μmol·L-1 and 3 μmol·L-1 Cl-BDE-208 or BDE-209 for 48 h, and 0.1 % DMSO (V:V) was used as the control group.

圖4 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞ESR2基因甲基化水平的影響 注：0.375 μmol·L-1和3 μmol·L-1濃度的Cl-BDE-208和BDE-209處理MCF-7細胞48 h，0.1% DMSO(V/V)為對照組，然后用Methylight方法檢測ESR2基因甲基化水平的變化。Fig. 4 Effects of Cl-BDE-208 and BDE-209 exposure on ESR2 methylation levels in MCF-7 cells Note: MCF-7 cells were treated with 0.375 μmol·L-1 and 3 μmol·L-1 Cl-BDE-208 or BDE-209 for 48 h, and 0.1% DMSO (V:V) was used as the control group. Changes of ESR2 methylation levels were analyzed using Methylight method.

2.2 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞的8-OHdG水平的影響

從圖2A中可看出，Cl-BDE-208并沒有引起8-OHdG水平的顯著改變 (P >0.05)，但BDE-209在3 μmol·L-1濃度下引起了8-OHdG水平的顯著升高(P<0.01)。

2.3 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞的DNMTs活性的影響

從圖2B中可看出，Cl-BDE-208和BDE-209在3 μmol·L-1濃度下都引起了DNMTs活性的顯著降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(P <0.01)。

2.4 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞ESR1基因甲基化和表達水平的影響

從圖3中可看出，Cl-BDE-208和BDE-209在0.375 μmol·L-1和3 μmol·L-1濃度下，均引起了ESR1基因甲基化水平的顯著升高(圖3A)，同時顯著下調(diào)了ESR1基因的表達(圖3B)。

2.5 Cl-BDE-208和BDE-209對MCF-7細胞ESR2基因甲基化水平的影響

從圖4中可看出，Cl-BDE-208和BDE-209在0.375 μmol·L-1和3 μmol·L-1濃度下，并沒有引起ESR2基因甲基化水平的顯著改變(P > 0.05)。

3 討論(Disscusions)

目前較廣泛使用重復(fù)序列(ALU，LINE和SAT等)的甲基化水平和5mdC的水平這2種指標來表征全基因組DNA甲基化水平。本文采用重復(fù)序列LINE-1的甲基化水平來表征全基因組DNA甲基化水平，因為這種指標可以將DNA甲基化改變定位到這一類的重復(fù)序列上，并且與其他重復(fù)序列相比，更多的癌癥組織表現(xiàn)為LINE-1基因低甲基化的特性[11]。本實驗中，Cl-BDE-208和BDE-209都顯著降低了LINE-1的甲基化水平，5mdC數(shù)據(jù)也驗證了這一結(jié)果。其他文獻也報道了類似結(jié)果，比如環(huán)境污染物苯和PM10都誘導了人體血液DNA中LINE-1基因的低甲基化[9, 15]，以及苯和三氯生都引起了哺乳動物細胞GDM水平的降低[16-17]。從5mdC數(shù)據(jù)看，Cl-BDE-208和BDE-209引起的GDM水平降低程度略小，而2個化合物引起LINE-1基因甲基化水平的改變較為明顯，這可能是因為重復(fù)序列僅占全基因組序列的三分之一[18]，而當某些基因組區(qū)域內(nèi)可能發(fā)生了高甲基化時，比如抑癌基因啟動子區(qū)域內(nèi)發(fā)生高甲基化時，全基因組DNA甲基化水平的整體降低幅度將減小，即5mdC%的降低幅度較小。

DNA甲基化主要是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)催化完成的，基因組DNA甲基化的失調(diào)常伴隨著DNMTs的異常[19]。有研究表明，DNMTs活性的缺失與全基因組DNA甲基化水平的降低具有相關(guān)性，但DNMTs 表達水平的降低并不一定是全基因組DNA甲基化水平降低的直接影響因素，比如結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌等樣品中都呈現(xiàn)全基因組DNA甲基化水平降低，但DNMTs 表達卻是升高的[11, 20]。所以，本文只選擇檢測DNMTs活性來探究LINE-1和GDM低甲基化的可能機制，而數(shù)據(jù)表明Cl-BDE-208和BDE-209都顯著降低了DNMTs活性，說明Cl-BDE-208和BDE-209可能都是通過抑制DNMTs的活性而引起了LINE-1和GDM低甲基化。

LINE-1和GDM低甲基化的另一個可能原因是8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)水平的升高。8-OHdG是DNA氧化損傷的標志物，可通過降低DNA 甲基化酶(DNMTs)與DNA的親和力，從而抑制DNA甲基化[21]。本次實驗結(jié)果顯示，BDE-209引起了8-OHdG水平的顯著升高，而Cl-BDE-208對8-OHdG水平影響較小。表明Cl-BDE-208的DNA氧化損傷的能力小于BDE-209，也說明BDE-209可能通過增加8-OHdG水平而誘導了LINE-1和GDM低甲基化。

ESR1高甲基化是在乳腺癌[22]、卵巢上皮癌[23]和膀胱癌[24]等癌癥組織中頻頻出現(xiàn)的指標，是疾病診斷的生物標志物。從ESR1實驗結(jié)果看，Cl-BDE-208和BDE-209都顯著誘導了ESR1基因甲基化的升高，并下調(diào)了ESR1基因的表達，說明Cl-BDE-208和BDE-209可能都是通過誘導ESR1的高甲基化而下調(diào)了ESR1基因的表達。這一結(jié)果暗示了環(huán)境相關(guān)濃度的Cl-BDE-208和BDE-209對人體的早期健康具有一定的不良效應(yīng)，表明ESR1基因的高甲基化可能是Cl-BDE-208和BDE-209引起內(nèi)分泌毒性的機制之一。

綜上，Cl-BDE-208和BDE-209都可能通過改變DNA甲基化水平而影響人體的早期健康效應(yīng)，同時ESR1基因的高甲基化可能是Cl-BDE-208和BDE-209引起內(nèi)分泌毒性的機制之一；從表觀遺傳學的改變水平看，一個氯(Cl)基團的取代對BDE-209的毒性影響并不大。因此，還需通過使用多種人體細胞、動物實驗或采集相關(guān)暴露人群的血液樣本開展下一步的研究，以便從表觀遺傳角度更全面地闡述Cl-BDE-208和BDE-209對人體的早期健康效應(yīng)。

[1] 杜紅燕, 朱琳, 陳中智, 等. 十溴聯(lián)苯醚的毒理學效應(yīng)研究進展[J]. 毒理學雜志, 2008, 22(1): 50-52

Du H Y, Zhu L, Chen Z Z, et al. The research progress of BDE-209 in toxicological effect [J]. Toxicology, 2008, 22(1): 50-52 (in Chinese)

[2] Frederiksen M, Vorkamp K, Thomsen M, et al. Human internal and external exposure to PBDEs--A review of levels and sources [J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2009, 212(2): 109-113

[3] Bi X H, Thomas G O, Jones K C, et al. Exposure of electronics dismantling workers to polybrominated diphenyl ethers, polychlorinated biphenyls, and organochlorine pesticides in South China [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(16): 5647-5653

[4] Tseng L H, Li M H, Tsai S S, et al. Developmental exposure to decabromodiphenyl ether (PBDE 209):Effects on thyroid hormone and hepatic enzyme activity in male mouse offspring [J]. Chemosphere, 2008, 70(4): 640-647

[5] Van der Ven L T M, Van de Kuil T, Leonards P E G, et al. A 28-day oral dose toxicity study in Wistar rats enhanced to detect endocrine effects of decabromodiphenyl ether (decaBDE) [J]. Toxicology Letters, 2008, 179(1): 6-14

[6] Yu Z Q, Zheng K W, Ren G F, et al. Identification of monochloro-nonabromodiphenyl ethers in the air and soil samples from south China [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(7): 2619-2625

[7] Qu W Y, Bi X H, Sheng G Y, et al. Exposure to polybrominated diphenyl ethers among workers at an electronic waste dismantling region in Guangdong, China [J]. Environment International, 2007, 33(8): 1029-1034

[8] Dolinoy D C, Huang D, Jirtle R L. Maternal nutrient supplementation counteracts bisphenol A-induced DNA hypomethylation in early development [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(32): 13056-13061

[9] Tarantini L, Bonzini M, Apostoli P, et al. Effects of particulate matter on genomic DNA methylation content and iNOS promoter methylation [J]. Environmental Health Perspectives, 2009, 117(2): 217-222

[10] Pierron F, Baillon L, Sow M, et al. Effect of low-dose cadmium exposure on DNA methylation in the endangered European eel [J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(1): 797-803

[11] Wilson A S, Power B E, Molloy P L. DNA hypomethylation and human diseases [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2007, 1775(1): 138-162

[12] Hsiung D T, Marsit C J, Houseman E A, et al. Global DNA methylation level in whole blood as a biomarker in head and neck squamous cell carcinoma [J]. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 2007, 16(1): 108-114

[13] Do H D, Wong N C, Murone C, et al. A critical re-assessment of DNA repair gene promoter methylation in non-small cell lung carcinoma [J]. Scientific Reports, 2014, 4: 4186

[14] Weisenberger D J, Campan M, Long T I, et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight [J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33(21): 6823-6836

[15] Bollati V, Baccarelli A, Hou L, et al. Changes in DNA methylation patterns in subjects exposed to low-dose benzene [J]. Cancer Research, 2007, 67(3): 876-880

[16] Hu J J, Ma H M, Zhang W B, et al. Effects of benzene and its metabolites on global DNA methylation in human normal hepatic L02 cells [J]. Environmental Toxicology, 2014, 29(1): 108-116

[17] Ma H M, Zheng L J, Li Y H, et al. Triclosan reduces the levels of global DNA methylation in HepG2 cells [J]. Chemosphere, 2013, 90(3): 1023-1029

[18] Hou L F, Zhang X, Wang D, et al. Environmental chemical exposures and human epigenetics [J]. International Journal of Epidemiology, 2012, 41(1): 79-105

[19] Liu Q C, Yang L Q, Gong C M, et al. Effects of long-term low-dose formaldehyde exposure on global genomic hypomethylation in 16HBE cells [J]. Toxicology Letters, 2011, 205(3): 235-240

[20] 王晶晶, 馬慧敏, 李寶才, 等. 苯代謝物氫醌對人體肝細胞內(nèi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和蛋白表達的影響[J]. 昆明理工大學學報：自然科學版, 2013, 38(5): 90-95

Wang J J, Ma H M, Li B C, et al. Effects of hydroquinone on the expression of DNA methyltransferase mRNA and protein in L02 cells [J]. Journal of Kunming University of Science and Technology: Natural Science Edition, 2013, 38(5): 90-95 (in Chinese)

[21] Maltseva D V, Baykov A A, Jeltsch A, et al. Impact of 7, 8-dihydro-8-oxoguanine on methylation of the CpG site by Dnmt3a [J]. Biochemistry, 2009, 48(6): 1361-1368

[22] Giacinti L, Claudio P P, Lopez M, et al. Epigenetic information and estrogen receptor alpha expression in breast cancer [J]. Oncologist, 2006, 11(1): 1-8

[23] 劉曼華, 王瑩. 雌激素受體α基因啟動子甲基化在卵巢上皮癌中表達的意義[J]. 實用癌癥雜志, 2011, 26(5): 448-451

Liu M H, Wang Y. Expression of methylation of ERα gene promotor in ovarian cancer [J]. The Practical Journal of Cancer, 2011, 26(5): 448-451 (in Chinese)

[24] 陽東榮, 沈罡, 單玉喜, 等. 膀胱癌ERα基因甲基化與ER表達的相關(guān)性[J]. 江蘇醫(yī)藥, 2010, 36(19): 2237-2239

Yang D R, Shen G, Shan Y X, et al. Correlation between estrogen receptor α gene methylation and ER gene expression in bladder transitional cell carcinoma [J]. Jiangsu Medical Journal, 2010, 36(19): 2237-2239 (in Chinese)

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Cl-BDE-208 and BDE-209 Induce LINE-1 Gene Hypomethylation and ESR1 Gene Hypermethylation

Zeng Liudan1,2, Ma Huimin1,*, Zhang Gan1, Yu Zhiqiang1, Sheng Guoying1, Fu Jiamo1

1. State Key Laboratory of Organic Geochemistry and Guangdong Key Laboratory of Environmental Protection and Resources Utilization, Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China 2. Graduate School of the Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China

Decabromodiphenyl ether (BDE-209) is the mostly used compound of polybrominated flame retardants. The high lipid solubility and low vapor pressure contribute to their bioaccumulation. BDE-209 has been detected in human blood, milk, and liver tissues. Monochloro-nonabromo diphenyl ethers (Cl-BDE-208), the environmental metabolite of BDE-209 is also found in human tissues, but the information of Cl-BDE-208 and BDE-209 toxicity is limited. The objective of this study is to investigate whether environmental relative concentrations BDE-209 and Cl-BDE-208 (0.375～3 μmol·L-1) could cause DNA methylation changes of several DNA methylation biomarkers in MCF-7 cells, including repetitive elements (LINE-1), global DNA methylation (GDM) and estrogen receptor gene (ESR1 and ESR2), and to explore the possible mechanism. Results showed that Cl-BDE-208 and BDE-209 down-regulated LINE-1 and global DNA methylation through DNMTs activity decrease, and 8-OHdG level increase may be involved in BDE-209-induced hypomethylation. More interesting, Cl-BDE-208 and BDE-209 inhibited ESR1 gene expression by promoting the DNA methylation in promoter area, while both compounds have no effects on ESR2 gene. Results suggested that Cl-BDE-208 and BDE-209 have the adverse health outcomes, and ESR1 gene hypermethylation may be the potential mechanism of endocrine toxicity of BDE-209.

Cl-BDE-208; BDE-209; DNA methylation; LINE-1; ESR1; environmental relative concentrations

10.7524/AJE.1673-5897.20151126001

國家青年基金 (NSFC-21007072)；有機地球化學國家重點實驗室開放基金 (SKLOG2015A02)；廣東省環(huán)境資源利用與保護重點實驗室開放運行費 (2014B03031060)

曾柳丹(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為環(huán)境污染物與表觀遺傳學，E-mail: zengliudan@gig.ac.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: mahuimin@gig.ac.cn

2015-11-26 錄用日期：2016-1-11

1673-5897(2016)2-163-07

X171.5

A

簡介：馬慧敏 (1981-)，女，副研究員，博士。研究方向為環(huán)境污染物與表觀遺傳學。

曾柳丹, 馬慧敏, 張干, 等. Cl-BDE-208和BDE-209誘導LINE-1基因低甲基化和ESR1基因高甲基化[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(2): 163-169

Zeng L D, Ma H M, Zhang G, et al. Cl-BDE-208 and BDE-209 induce LINE-1 gene hypomethylation and ESR1 gene hypermethylation [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 163-169 (in Chinese)