江興華

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

不同劑型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗免疫SPF雞后抗體水平對(duì)比試驗(yàn)

江興華

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

不同劑型的佐劑對(duì)疫苗的免疫效果有較大的影響，本試驗(yàn)旨在對(duì)比不同劑型佐劑的新城疫-禽流感（簡(jiǎn)稱“新-流”）二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，從而為生產(chǎn)上選擇最佳劑型佐劑應(yīng)用于新城疫-禽流流感二聯(lián)滅活疫苗提供依據(jù)。分別將油包水型、水包油型、水包油包水型佐劑與新城疫及禽流感滅活抗原乳化成不同劑型的新城疫-禽流感（H9亞型，HP株）二聯(lián)滅活疫苗，將這三種不同劑型的新城疫-禽流感（H9亞型，HP株）二聯(lián)滅活疫苗分別免疫一組7日齡SPF雞。每羽頸部皮下注射0.2 mL，同時(shí)設(shè)一組未免7日齡SPF雞作為對(duì)照組，各免疫組與對(duì)照組SPF雞于免疫組免后6、10、15、21、28、35 d進(jìn)行采血，檢測(cè)新城疫與禽流感抗體水平。結(jié)果表明：免疫油包水型疫苗組SPF雞免疫后新城疫與禽流感抗體上升最快，在免后10、15、21、28、35 d的新城疫與禽流感抗體也最高，其次是免疫水包油包水型的，而免疫水包油型疫苗組的SPF雞新城疫與禽流感抗體上升最慢，而且在免后10、15、21、28、35 d的新城疫與禽流感抗體也最低。此外，從各免疫組可以看出，在免后6 d時(shí)新城疫抗體已開(kāi)始產(chǎn)生，在1log2以下，而禽流感抗體仍未產(chǎn)生。可見(jiàn)免疫新-流二聯(lián)苗后，新城疫抗體比禽流感抗體更早產(chǎn)生，油包水型新-流二聯(lián)苗的免后抗體高于水包油包水及水包油型，而且能持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體，更具優(yōu)勢(shì)。

不同劑型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗SPF雞抗體水平對(duì)比

新城疫（Newcastle disease，ND）又稱亞洲雞瘟，是由副黏病毒科、腮腺炎病毒屬的新城疫病毒（NDV）所引起的一種烈性和高度接觸性傳染病[1]，禽流感是由正粘病毒科、流感病毒屬A型流感病毒引

起的一種傳染性疾病綜合征，感染禽類(lèi)從亞臨診癥狀，輕度上呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低，直至急性全身致死性疾病[2]，我國(guó)禽流感以H9亞型為主，雖然H9亞型禽流感屬于低致病力禽流感（LPAI），其危害不如高致病性禽流感（HPAI）嚴(yán)重，但該亞型禽流感常常繼發(fā)或并發(fā)感染新城疫、大腸桿菌病等而引起蛋雞產(chǎn)蛋率下降及大批雞只死亡，也給我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。雞新城疫和禽流感是世界范圍流行的禽類(lèi)疫病，給禽業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，免疫接種是控制雞新城疫和禽流感的有效方法[4]。市場(chǎng)上預(yù)防雞新城疫與禽流感兩種疫病主要是免疫新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗，新-流二聯(lián)滅活疫苗可制備成不同劑型，如油包水型、水包油型、水包油包水型。目前使用的油乳劑滅活疫苗主要是油包水型油佐劑疫苗，免疫接種操作麻煩，吸收慢，免疫保護(hù)力產(chǎn)生較慢，因而有的免疫雞群仍有發(fā)生非典型雞新城疫的現(xiàn)象，為了提高對(duì)雞新城疫的防疫水平，有必要應(yīng)用工藝更先進(jìn)的油佐劑疫苗[5]。本試驗(yàn)通過(guò)使用不同佐劑制備成不同劑型的新-流二聯(lián)滅活疫苗，對(duì)比不同劑型的新-流二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，以尋找最佳免疫效果的佐劑應(yīng)用于制備新-流二聯(lián)滅活疫苗，從而預(yù)防雞新城疫與禽流感，減少養(yǎng)雞業(yè)的損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同劑型佐劑由法國(guó)SEPPIC公司提供。

1.1.2 不同劑型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司使用法國(guó)SEPPIC公司提供不同劑型的佐劑乳化制成。

1.1.3 試驗(yàn)用雞7日齡SPF雞。SPF蛋由斯帕法斯家禽有限公司提供，本公司自行孵化。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 疫苗的制備A組疫苗：水包油劑型疫苗，使用已滅活的等量新城疫、禽流感抗原與法國(guó)SEPPIC公司提供的水包油佐劑按質(zhì)量比85：15進(jìn)行乳化。B組疫苗：水包油包水劑型疫苗，使用已滅活的等量新城疫、禽流感抗原與法國(guó)SEPPIC公司提供的水包油包水型佐劑按質(zhì)量比1：1進(jìn)行乳化。C組疫苗：油包水劑型疫苗，使用已滅活的等量新城疫、禽流感抗原與法國(guó)SEPPIC公司提供的油包水型佐劑按質(zhì)量比30：70進(jìn)行乳化。

1.2.2 試驗(yàn)分組SPF蛋進(jìn)行孵化出殼，小雞由本公司自行養(yǎng)至7日齡。選擇健康有活力的60羽雞，隨機(jī)選20羽編為A組，免疫A組疫苗樣品；隨機(jī)選20羽編為B組，免疫B組疫苗樣品；隨機(jī)選20羽編為C組，為空白對(duì)照組。并在每羽雞上打上翅標(biāo)編號(hào)，試驗(yàn)雞在免前與免后均在隔離器內(nèi)喂養(yǎng)。

1.2.3 免疫方法將A、B、C組新-流二聯(lián)滅活疫苗樣品分別免疫7日齡SPF雞，每羽頸部皮下注射0.2 mL，對(duì)照組均不免疫，作為空白對(duì)照。

1.2.4 采血、抗體檢測(cè)各免疫組與對(duì)照組均于免疫組免后6、10、15、21、28、35 d進(jìn)行采血，檢測(cè)新城疫與禽流感抗體。

1.2.5 抗體檢測(cè)方法抗體檢測(cè)應(yīng)用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)的方法，具體步驟：用PBS將待檢血清作2倍系列稀釋?zhuān)尤牒?HAU的血凝素抗原液，并設(shè)PBS和4HAU的血凝素抗原液對(duì)照，充分振搖后，置室溫下至少20 min，或在2～8℃下40～60 min，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液，置室溫20～40 min或置2～8℃下40～60 min，當(dāng)紅細(xì)胞對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果，以使紅細(xì)胞凝集被完全抑制的血清最高稀釋度作為判定終點(diǎn)。

2 結(jié)果

從新城疫與禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1，圖1-圖2）可以看出，對(duì)照組新城疫與禽流感抗體在各日齡均為陰性，免疫組新城疫抗體從免后6 d開(kāi)始逐漸上升，油包水劑型組新城疫抗體上升得最快，且在免后不同日齡抗體值也最高，最高值可達(dá)到7log2以上，其次是水包油包水型，水包油劑型組抗體上升得最慢且最低；免疫組禽流感抗體從免后10 d開(kāi)始逐漸上升，油包水劑型組禽流感抗體上升得最快，且在免后不同日齡抗體值也最高，最高值可達(dá)到6log2以上，其次是水包油包水型，水包油劑型組抗體上升得最慢且最低；各劑型組的新城疫抗體比禽流感抗體上升得更早，同日齡抗體值更高，新城疫抗體從免后6 d已經(jīng)開(kāi)始上升，而禽流感抗體在免后6 d仍為零，從免后6～10 d才開(kāi)始上升。

表1 不同組新城疫與禽流感抗體水平檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1）佐劑是預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的非特異性物質(zhì)。佐劑可以改變抗原的物理性狀，延緩抗原的降解和排除；刺激抗原遞呈細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)抗原的處理和遞呈能力；刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化和成熟；促進(jìn)組織細(xì)胞或免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[6]。可見(jiàn)選擇合適佐劑對(duì)疫苗免疫效果十分重要，從本試驗(yàn)不同組免后抗體水平結(jié)果可以看出，不同佐劑對(duì)疫苗的免疫效果影響很大，免后不同時(shí)間抗體值差別很大，在實(shí)際疫苗生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)具體的疫苗篩選最佳免疫效果的佐劑，免疫動(dòng)物后才能獲得最好的免疫保護(hù)力。

2）雙相油乳劑滅活苗具有黏度低、在注射部位易分散、極易吸收、局部反應(yīng)輕微、佐劑效應(yīng)仍相當(dāng)良好、刺激機(jī)體較早產(chǎn)生抗體、達(dá)峰值時(shí)間提前、較早產(chǎn)生保護(hù)力等優(yōu)點(diǎn)[7]，雙相油乳劑滅活疫苗即水包油包水型疫苗，本試驗(yàn)研究不同劑型的新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，與黃建文等[7]在禽流感雙相油乳劑疫苗中的試驗(yàn)結(jié)果不一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明：水包油與水包油包水型疫苗比油包水型疫苗產(chǎn)生抗體慢，免后同日齡抗體均低于油包水型疫苗，本試驗(yàn)結(jié)果與肖興等試驗(yàn)結(jié)果不一致的原因還有待于進(jìn)一步分析。從本試驗(yàn)結(jié)果看，油包水型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗免疫效果最好，雖然水包油型與水包油包水型疫苗黏度低，更易注射與吸收，但免疫抗體低，我們?cè)谶x擇新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗佐劑時(shí)應(yīng)綜合考慮，免疫效果應(yīng)優(yōu)先考慮。

3）禽流感H9抗體以大于等于5log2為陽(yáng)性作為標(biāo)準(zhǔn)，46 d的H9抗體檢測(cè)結(jié)果平均陽(yáng)性率只有58.4%，免疫抗體水平偏低，對(duì)低致病性禽流感流行的地區(qū)還會(huì)構(gòu)成一定的威脅。所以，飼養(yǎng)場(chǎng)還必須加強(qiáng)隔離、防疫和消毒等綜合防控措施，以確保雞群的安全生產(chǎn)[8]。從本試驗(yàn)結(jié)果看，免疫油包水型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗，禽流感抗體在免后21 d就可達(dá)到5log2以上，28 d可達(dá)到6log2以上，而免疫水包油及水包油包水型疫苗，禽流感抗體需28 d才可達(dá)到5log2以上；免疫油包水型新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗，新城疫抗體在免后15 d就可達(dá)到5log2以上，21 d可達(dá)到6log2以上，而免疫水包油及水包油包水型疫苗，新城疫抗體需免后21 d才可達(dá)到5log2以上。可見(jiàn)油包水型疫苗可更快產(chǎn)生抗體，可以更早產(chǎn)生免疫保護(hù)力，是新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗的最佳佐劑[9-10]。

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Comparision of antibody levels against different formulation of bivalent inactivated vaccines containing newcastle disease virus and avian influenza virus in SPF chickens

Jiang Xinghua
(Fuzhou Dabeinong Biotech Co.Ltd.,Fuzhou 350014)

7-day-old specific pathogen free(SPF)chickens were inoculated with three kinds of bivalent vaccines,which contained inactivated Newcastle disease virus(NDV)and avian influenza virus(AIV,H9 subtype,HP strain)emulsified with water/oil,oil/water and water/oil/water adjuvant,respectively.Every chicken in the experiment groups was subcutaneously inoculated with a dose of 0.2 mL,and additionally,chickens were mock inoculated as control group.In order to detect antibody titers of NDV and AIV,blood samples were collected from both experiment groups and control group on 6,10,15,21,28 and 35 day post-immunization(dpi).Results showed that antibodies against NDV and AIV were rising fastest and highest on 10,15,21,28 and 35 day dpi in water/oil type vaccine group,followed by water/oil/water type vaccine group,and oil/water type vaccine group with relatively slowest and lowest antibody titers.In addition,the antibodies against NDV initially emerged on 6 day dpi with a titer of sub-1log2,while antibodies against AIV were absent in the meantime.Overall,antibodies against NDV emerged earlier than those of AIV,and SPF chickens immunized with water/oil type vaccine obtained continuous stimulation and produced higher antibody titers than other two vaccines.

different formulation bivalent inactivated NDV and AIV vaccine specific pathogen free(SPF)chickens comparision of antibody levels

A

1003-4331（2016）06-0005-03